目的:探讨Slit引导配体2(Slit2)对糖尿病小鼠角膜上皮和神经损伤修复的促进作用及其可能的分子机制。方法:选取60只SPF级5~6周龄C57BL/6小鼠，采用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病模型组和Slit2注射组，每组20只。糖尿病模型组和Slit2注射组小鼠采用链脲霉素腹腔内注射法建立糖尿病模型。构建小鼠角膜上皮损伤修复模型，Slit2注射组于造模后即刻结膜下注射Slit2重组蛋白，糖尿病模型组小鼠结膜下注射等容量PBS，正常对照组不做处理。采用角膜荧光素染色法观察小鼠角膜上皮缺损后24、48和72 h愈合情况；采用实时荧光定量PCR法检测正常对照组和糖尿病模型组小鼠角膜上皮中Slit2及其相关受体mRNA的表达；采用角膜铺片β-tubulin Ⅲ荧光染色法观察小鼠角膜神经形态变化；采用免疫荧光法检测正常对照组和糖尿病模型组小鼠角膜上皮中Slit2的表达分布及修复的角膜上皮中Slit2、表皮生长因子受体(EGFR)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、苏氨酸蛋白激酶(AKT)、β-连环蛋白(β-catenin)和Ki67的表达。将小鼠角膜上皮干/祖细胞系(TKE2)分为正常对照组、高糖组和Slit2干预组。采用Western blot法检测各组细胞中p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT、p-ERK/ERK和β-catenin的表达；取高糖培养的TKE2，采用Western blot法检测0.01、0.1和0.5 μg/ml Slit2处理10 min及0.5 μg/ml的Slit2处理前和处理后10、20、30、60、120 min时p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的表达。原代培养各组小鼠三叉神经节(TGs)细胞，采用β-tubulin Ⅲ免疫荧光染色法观察Slit2对于TGs细胞轴突再生的影响。结果:角膜上皮刮除后48 h和72 h，与正常对照组和Slit2注射组比较，糖尿病模型组小鼠角膜上皮修复速度明显减慢。糖尿病模型组小鼠正常角膜上皮中Slit2及其Robo1、Robo2、Robo4受体mRNA相对表达量明显高于正常对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。糖尿病模型组损伤修复的角膜上皮中Slit2免疫荧光强度明显弱于正常对照组。角膜铺片神经荧光染色显示，与糖尿病模型组比较，角膜上皮损伤后7 d Slit2注射组角膜神经丛致密，神经纤维数量增多且分布均匀，神经末梢可见较多分支。正常对照组和Slit2注射组修复的角膜上皮中p-EGFR、p-ERK、β-catenin和Ki67荧光明显强于糖尿病模型组。高糖组TKE2细胞内p-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT和β-catenin相对表达量均明显低于正常对照组和Slit2干预组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。Slit2处理高糖培养TKE2细胞后10 min，p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT的相对表达量较处理前均明显升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)，随着Slit2质量浓度的增加，TKE2细胞中p-EGFR/EGFR和p-AKT/AKT相对表达量逐渐升高，Slit2质量浓度为0.5 μg/ml时对EGFR和AKT信号通路的活化作用最明显。高糖组体外培养的TGs突触长度为(40.52±5.44)μm，明显短于正常对照组的(72.14±9.48)μm和Slit2注射组的(73.04±4.66)μm，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:Slit2通过激活EGFR信号通路对糖尿病模型小鼠角膜上皮发挥保护作用，并通过增加角膜上皮下神经丛密度和促进TGs细胞轴突生长，发挥神经保护能力。

目的 探究蛋白激酶C(PKC)/瞬时感受器电位香草酸亚型1(TRPV1)通路在大鼠三叉神经疼痛(TN)中的病理作用.方法 采用眶下神经慢性收缩术(ION-CCI)来创建大鼠TN的模型.将大鼠随机分为假手术组(Sham组)、CCI组、CCI+DMSO组、CCI+GF109203X(双吲哚马来酰亚胺,一种PKC抑制剂)组.使用Von Frey毛刷检测大鼠的机械痛阈.采用qRT-PCR及Western blot分别检测三叉神经节(TG)内PKC和TRPV1表达量的变化.HE染色观察TG的病理变化.结果 CCI组大鼠机械痛阈降低(P<0.05),大鼠TG内的磷酸化的PKC(p-PKC)和TRPV1表达显著增加(P<0.05).组织病理学结果显示,与Sham组相比,CCI组观察到TG出现明显的炎性细胞浸润增多、神经细胞肿胀等变化.注射GF109203X后降低了大鼠TG内PKC的磷酸化和TRPV1的表达,大鼠机械痛阈升高(P<0.05),光学显微镜下可见TG内细胞肿胀和炎症细胞有所减少.结论 PKC/TRPV1通路可能参与了大鼠的三叉神经痛.

目的 通过观察葛根素对硝酸甘油诱导的慢性偏头痛模型小鼠行为学、三叉神经节细胞钠离子电流抑制率和动作电位的影响,探讨其治疗慢性偏头痛的作用机制.方法 随机取 6 只雄性C57BL/6 小鼠,处死后分离三叉神经节细胞,检测不同浓度的葛根素对电压依赖性钠离子通道电流的抑制率.建立硝酸甘油诱导的慢性偏头痛小鼠模型,给予药物干预后,qRT-PCR检测三叉神经节细胞神经元电压门控钠通道基因(voltage-gated sodium channel α1-subunit gene,SCN1A)mRNA表达;用膜片钳记录各组小鼠三叉神经节细胞的动作电位参数.结果 葛根素对正常小鼠三叉神经节细胞的电压门控性钠离子通道抑制率的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)为 29.96 μmol/L.与对照组比较,模型组小鼠 0～30、30～60、60～90、90～120 min各时间段抓头次数及 2 h内抓头次数总和显著增加(P＜0.05、0.001),三叉神经节细胞中SCN1A mRNA表达显著升高(P＜0.001),动作电位发放频率和静息膜电位显著升高(P＜0.001).与模型组比较,葛根素(50、100、200 mg/kg)组 30～60 min抓头次数和 2 h内抓头次数总和显著减少(P＜0.05、0.01),葛根素(200 mg/kg)组 90～120 min抓头次数显著减少(P＜0.001);葛根素(100、200 mg/kg)组小鼠三叉神经节细胞中SCN1A mRNA表达显著降低(P＜0.001);葛根素(50、100、200 mg/kg)组小鼠三叉神经节细胞动作电位发放频率和静息膜电位显著下降(P＜0.001).结论 葛根素通过阻断三叉神经节细胞钠离子电流和SCN1A mRNA表达,降低动作电位静息膜电位和发放频率,减少慢性偏头痛发作,有望成为临床治疗慢性偏头痛的辅助治疗药物.

神经病理性疼痛(NP)临床治疗棘手,其表型相似但不同病理阶段病机各异,靶向干预NP不同病理阶段核心调控元件成为近年来药物研发新方向并为NP的救治提供了可能.蒙古族药那如-3(NR-3)临床治疗坐骨神经痛、三叉神经痛等全程皆效,但机制不明.该研究在前期"启动期"研究的基础上,建立小鼠脊神经结扎(SNL)模型并采用行为学检测痛敏阈值变化,结合网络分析、Western blot、免疫荧光、ELISA检测、激动剂/拮抗剂等探讨NR-3 治疗NP"维持期"的药效机制.结果显示,NR-3可以提高"维持期"SNL小鼠机械痛敏与热痛敏阈值而对正常小鼠基础痛阈无明显影响.实验进一步以背根神经节(DRG)、病变脊髓节段为研究对象发现NR-3对NP"维持期"发挥镇痛作用机制可能与其破坏DRG、脊髓星形胶质细胞的基质金属蛋白酶2(MMP2)/白细胞介素-1β(IL-1β)炎症通路相关.相关研究丰富了NR-3治疗NP"维持期"的生物学内涵,并为其临床合理用药提供了参考.

目的 基于BDNF/p-Akt信号途径研究偏痛汤1号对硝酸甘油(NTG)致偏头痛模型大鼠作用机制的影响.方法 采用随机数字表法将40只SD雄性大鼠分为空白组、假手术组、模型组、阳性药组、偏痛汤1号组,每组8只.空白组予正常饮食水饲养,假手术组予颈背部皮下注射生理盐水,其余各组大鼠予颈背部皮下注射NTG.成模后给药1周,同时检测行为学及痛阈值变化.采用ELSIA技术检测外周血浆中白细胞介素-6(IL-6)、脑神经营养因子(BDNF)、一氧化氮(NO)水平.RT-qPCR技术检测大鼠三叉神经节中降钙素基因相关肽(CGRP)、BDNF、蛋白激酶B(Akt)、Bcl-2相关死亡启动因子(BAD)及NO mRNA转录水平.Western blotting技术测定大鼠三叉神经节中BDNF、Akt及p-Akt蛋白表达.结果 与模型组比较,偏痛汤1号组大鼠眼眶痛阈上调(P＜0.05);血浆BDNF、NO蛋白表达水平下调(P＜0.05),IL-6无显著下降趋势(P＞0.05);三叉神经节中CGRP、Akt、BDNF mRNA转录水平下调(P＜0.05),BAD、NO mRNA转录水平有下调趋势,但无显著差异(P＞0.05),Akt、p-Akt与BDNF蛋白表达水平显著降低(P＜0.05或P＜0.001).结论 偏痛汤 1号抑制痛敏性偏头痛的机制与调控BDNF/p-Akt信号途径,下调偏头痛相关因子CGRP、NO、IL-6等表达水平,从而减少突触递质引起的通路活化相关.

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/瞬时受体电位A1通道(TRPA1)通路探究川芎-天麻药对治疗偏头痛的可能作用机制.方法 48只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、川芎-天麻药对组,每组16只.对照组和模型组给予10 ml/kg生理盐水灌胃,川芎-天麻药对组给予0.675 g/kg川芎-天麻灌胃,均每天1次,连续8天.末次给药前造模,对照组皮下注射生理盐水10ml/kg,模型组和川芎-天麻药对组皮下注射硝酸甘油10 ml/kg制备偏头痛模型大鼠.运用Von Frey纤毛测定大鼠眶周机械痛阈值;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定大鼠血清、脑脊液中降钙素基因相关肽(CGRP)水平;一氧化氮(NO)试剂盒测定血清、脑脊液中NO水平;RT-PCR法检测大鼠三叉神经节中即刻早期基因(c-Fos)、CGRP、瞬时受体电位V1通道(TRPV1)、腺苷酸活化蛋白激酶A(PRKAA)及TRPA1 mRNA表达水平;免疫荧光法检测三叉神经颈复合体(TCC)中c-Fos阳性细胞数和三叉神经节磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)、TRPA1蛋白表达水平.结果 与对照组比较,模型组大鼠机械刺激阈值、pAMPK蛋白表达降低,血清中CGRP、NO水平,三叉神经节c-Fos、CGRP、TRPV1、TRPA1 mRNA表达水平,TRPA1蛋白表达和TCC中c-Fos阳性细胞数均显著升高(P＜0.05).与模型组比较,川芎-天麻药对组大鼠机械刺激阈值、pAMPK蛋白表达显著上升,血清中CGRP、NO水平,三叉神经节中c-Fos、CGRP、TRPV1、TRPA1 mRNA表达水平,TRPA1蛋白表达和TCC中c-Fos阳性细胞数明显下降(P＜0.05).结论 川芎-天麻药对可能通过调控三叉神经节中AMPK/TRPA1通路,升高机械痛阈,从而改善偏头痛症状.

目的 揭示电针调控2型糖尿病干眼大鼠三叉神经节(TG)和三叉神经脊核尾状核(SpVc)中髓系细胞触发受体2(TREM2)介导的神经炎症信号通路缓解眼表感觉异常的潜在机制.方法 健康雄性SD大鼠高糖高脂饮食4周后,腹腔注射10 g·L-1链脲佐菌素诱导建立2型糖尿病干眼大鼠模型.实验第12周造模成功的大鼠随机分为模型组、电针组、假针组、氟米龙组,并选择普通饲料喂养的健康雄性SD大鼠设为空白组,各组干预2周.造模前、造模后及干预后各组大鼠均行角膜荧光素钠染色(FL)、酚红棉线试验(PRT)、泪膜破裂时间(BUT)和角膜机械知觉(CTT)检查,观察各组大鼠TG和SpVc组织形态变化及TREM2阳性表达部位,检测在各组大鼠TG和SpVc中TREM2、白细胞介素-18(IL-18)和白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA表达.结果 造模后,与空白组比较,其余各组大鼠FL评分显著升高,PRT、BUT、CTT显著降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.01).干预后,与模型组比较,电针组、氟米龙组大鼠FL评分显著降低,PRT、BUT、CTT显著升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.01),假针组以上指标差异均无统计学意义(均为P＞0.05).与电针组比较,氟米龙组、假针组大鼠PRT、CTT显著降低,假针组大鼠FL评分显著升高、BUT显著降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.01),氟米龙组大鼠FL评分、BUT差异无统计学意义(均为P＞0.05).与假针组比较,氟米龙组大鼠FL评分降低,PRT、BUT、CTT升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫荧光双标染色结果显示,TREM2在模型组大鼠TG和SpVc中激活的小胶质细胞上阳性表达.TG和SpVc的RT-PCR检测结果显示,与空白组比较,模型组、电针组、氟米龙组、假针组TG和SpVc中TREM2 mRNA表达降低,模型组TG和SpVc及假针组TG中IL-18和IL-1β mRNA,以及假针组SpVc中IL-18 mRNA表达增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).与模型组比较,电针组、氟米龙组TG和SpVc中TREM2 mRNA表达增加,IL-18和IL-1β mRNA表达降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).与电针组比较,假针组TG和SpVc中TREM2 mRNA表达降低,IL-18和IL-1β mRNA表达增加,差异均有统计学意义(均为P＜0.05),氟米龙组TG和SpVc中TREM2、IL-18及IL-1β mRNA表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05).与假针组比较,氟米龙组TG、SpVc中TREM2 mRNA表达增加,SpVc中IL-18 mRNA表达降低,差异均有统计学意义(均为P＜0.05),氟米龙组TG、SpVc中IL-1β mRNA及TG中IL-18 mRNA表达差异均无统计学意义(均为P＞0.05).结论 电针通过调控TG和SpVc中TREM2介导的炎症信号通路,可有效缓解2型糖尿病干眼大鼠眼表感觉异常.

目的:三叉神经痛(trigeminal neuralgia,TN)是一种严重的慢性神经病理性疼痛,主要影响三叉神经分布区域,临床治疗效果不佳.TN的治疗方法众多,但目前临床上主要是通过服用卡马西平(carbamazepine,CBZ)来抑制疼痛.脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和慢性痛密切相关.本研究通过慢性压迫性损伤眶下神经(chronic constriction injury of the infraorbital nerve,ION-CCI)大鼠模型观察CBZ处理对TN大鼠三叉神经节(trigeminal ganglion,TG)和血清中BDNF表达的影响.方法:建立雄性SD大鼠ION-CCI模型,并将其随机分为假手术(sham)组、TN组、TN+低剂量(20 mg/kg)CBZ处理组、TN+中剂量(40 mg/kg)CBZ处理组、TN+高剂量(80 mg/kg)CBZ处理组.在手术前后定时测量各组大鼠的面部机械痛阈(mechanical pain threshold).使用实时聚合酶链反应技术测定各组大鼠TG中BDNF及酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)的mRNA含量,免疫荧光技术观察各组大鼠TG中BDNF蛋白质在神经元上的表达情况,蛋白质印迹法检测各组大鼠TG中BDNF、TrkB、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)及磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(phospho-extracellular regulated protein kinases,p-ERK)的蛋白质表达变化,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠血清中BDNF的表达变化.结果:行为学检测结果表明:手术前,各组大鼠右侧面部感觉区域的机械痛阈差异均无统计学意义(均P>0.05);术后第3天开始,TN组大鼠机械痛阈与sham组相比均明显降低(均P<0.01),TN+80 mg/kg CBZ处理组、TN+40 mg/kg CBZ处理组和TN+20 mg/kg CBZ处理组与TN组相比均升高(均P<0.05).实时聚合酶链反应和蛋白质印迹法结果显示:TN组大鼠TG中的BDNF、TrkB的 mRNA及蛋白质表达量均较sham组升高(均P<0.05),TN+20 mg/kg CBZ处理组、TN+40 mg/kg CBZ处理组、TN+80 mg/kg CBZ处理组均较TN组降低(均P<0.05);与TN组相比,TN+20 mg/kg CBZ处理组、TN+40 mg/kg CBZ处理组、TN+80 mg/kg CBZ处理组大鼠TG中的p-ERK水平均显著降低(均P<0.05).免疫荧光双标结果表明:TN组TG中的BDNF和神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)主要共表达在神经元上,与sham组比较BDNF和NeuN水平升高(P<0.05),TN+20 mg/kg CBZ处理组、TN+40 mg/kg CBZ处理组、TN+80 mg/kg CBZ处理组与TN组大鼠比较二者表达均降低(均P<0.05).ELISA检测结果显示:TN组大鼠血清中BDNF的水平较sham组显著升高(P<0.05),TN+20 mg/kg CBZ处理组、TN+40 mg/kg CBZ处理组、TN+80 mg/kg CBZ处理组均较TN组大鼠降低(均P<0.05).Spearman相关分析显示血清中BDNF水平与机械痛阈呈负相关(r=-0.650,P<0.01).结论:CBZ处理可以抑制TN大鼠TG中BDNF及其受体TrkB的表达,降低TN大鼠血清中BDNF水平及ERK信号通路磷酸化水平,进而抑制TN.可以考虑将血清中BDNF水平作为诊断TN和评估预后的指标.

目的 考察复方藜芍片对大鼠原发性三叉神经痛的治疗作用并初步探索相关机制.方法 建立雄性SD大鼠眶下神经压迫术原发性三叉神经痛模型,随机分为模型组、卡马西平组及复方藜芍片低、中、高剂量(420、840、1 680 mg/kg)组,ig给药 28 d;定期测定术侧面部机械痛敏阈值(MWT);ELISA试剂盒检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;q-PCR检测三叉神经节中TNF-α、IL-1 β mRNA表达;Western blotting检测三叉神经节中降钙素基因相关肽(CGRP)表达;免疫组化检测大脑纹状体中磷酸化 p38 丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)表达.结果 术后当天各组大鼠术侧MWT与术前相比均显著下降(P＜0.05),大鼠原发性三叉神经痛模型造模成功.复方藜芍片高剂量组MWT值为 19.58,与模型组比较MWT值增加 36.6%(P＜0.05),复方藜芍片对原发性三叉神经痛模型大鼠的MWT有显著性改善.与卡马西平组(14.17)相比,复方藜芍片中、高剂量组大鼠MWT均显著性上升(P＜0.05).与模型组相比,复方藜芍片中、高剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平,三叉神经节中TNF-α、IL-1 β mRNA、CGRP以及纹状体中p-p38 MAPK表达均显著下降(P＜0.05).结论 复方藜芍片可对原发性三叉神经痛发挥治疗作用,其机制可能与降低炎症相关因子以及蛋白的表达有关.

目的 利用附子汤灌胃与电刺激三叉神经节构建肝阳上亢兼瘀血型偏头痛大鼠模型,探讨该模型的特征.方法 30只SD大鼠分为正常组、模型组、正天丸组(1.6 g·kg-1),每组10只.模型组、正天丸组大鼠灌胃附子汤(2.00 g·kg-1),每天1次,连续28天,建立肝阳上亢证;附子汤灌胃第15天,正天丸组大鼠同时给予正天丸药液,每天1次,共14天;第29天时,电刺激大鼠三叉神经节建立肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型.末次给药30 min后,观察大鼠宏观体征和行为表现,血液粘度仪检测血液流变学;免疫组化、RT-qPCR、Western blot法检测大鼠三叉神经颈髓复合体(TCC)中P物质(SP)阳性表达、mRNA及蛋白相对表达量.结果 与正常组相比,模型组具有双目红赤,易怒,同笼打斗,舌质暗或有瘀点等宏观体征;出现有规律地摆头、频繁理毛等行为变化;中央区路程增加(P<0.05);全血高切相对粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数均明显升高(P<0.05),红细胞变型指数明显降低(P<0.05);TCC中SP阳性表达、mRNA及蛋白相对表达量均明显升高(P<0.05).与模型组相比,正天丸组大鼠宏观体征及行为变化明显改善;中央区路程明显减少(P<0.05);全血高切相对粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数明显降低(P<0.05),红细胞变型指数明显升高(P<0.05);TCC中SP阳性表达、mRNA及蛋白相对表达量均明显降低(P<0.05,P<0.01).结论 SD大鼠附子汤灌胃4周结合电刺激三叉神经节可构建与临床表现基本相符的肝阳上亢兼瘀血型偏头痛模型.