目的:获得乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)C2蛋白的HBV多肽。方法:同源重组法构建含1.2倍HBVC2全基因组表达重组体；脂质体法转染HepG2和Huh-7细胞；荧光定量PCR法检测HBV DNA水平；双抗体夹心酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和E抗原(HBeAg)的水平；免疫荧光法检测核心抗原(HBcAg)水平和分布。电转染法转染人永生化B淋巴细胞系(B-lymphoblastoid cell line，BLCL)，液相色谱串联质谱(liquid chromatography-mass spectrography/mass spectrometry，LC-MS/MS)法分离鉴定HBV多肽，生物信息学预测亲合力，并检索已报道序列。结果:成功构建了含3881 bp目的片段的HBVC2全基因组的重组体，即pAAV/HBV1.2 C2。HepG2和Huh-7细胞转染重组体后24、48和72 h，培养上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg均呈现较高水平；HBcAg多分布在细胞核，均在48 h表达水平达高峰。从5株BLCLs细胞裂解液中检出来源于HBsAg、HBeAg和HBcAg的HBV多肽(序列长度≥8aa)共95条。比较分析共同序列和包含或重叠(≥8aa)序列，67条多肽形成了11个HBV多肽热点核心区域，有92条已见报道。51(53.68%)条多肽有相应的人类白细胞表面抗原(human leukocyte antigen，HLA)等位基因分型，而与5株细胞所携带HLA等位基因一致的共有21条。 结论:成功构建和表达了pAAV/HBV1.2 C2，获得了真实世界的HBVC2多肽谱。

目的:使用preS1-tp融合蛋白作为新型的载体，介导针对乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区的小干扰RNA(siRNA)进入感染HBV的肝细胞，从而抑制HBV复制和共价闭合环状DNA的形成。方法:以慢病毒感染系统为基础，建立表达人牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽的HepG2.2.15细胞；针对HBV NLS区设计合成siRNA；表达纯化preS1-tp融合蛋白，检测其进入细胞和与DNA结合的能力；以preS1-tp融合蛋白为载体，介导NLS siRNA递送至HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞中,观察其对HBV复制和共价闭合环状DNA水平的影响。多组间比较采用方差分析，计量资料用 t检验分析组间差异。 结果:成功构建HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞株并合成筛选出显著抑制HBV复制的HBV NLS siRNA。纯化并大量表达preS1-tp融合蛋白，以该融合蛋白为载体靶向输送HBV NLS siRNA，结果显示，融合蛋白可以有效靶向输送siRNA至HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞，不仅可有效抑制细胞中HBV mRNA，HBsAg和HBeAg表达，还能显著降低HBV DNA和共价闭合环状DNA的水平。结论:preS1-tp融合蛋白利用preS1与肝细胞HBV受体结合，tp与核酸结合的双功能特点，将针对HBV NLS的siRNA靶向至感染HBV的靶细胞，靶向阻断rcDNA转运入细胞核，使siRNA发挥抑制HBV复制和共价闭合环状DNA合成的作用，为HBV感染所致慢性乙型肝炎治疗提供新策略，为彻底清除体内HBV提供新的研究视角。

目的:获得展示新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)刺突蛋白B细胞线性表位的乙型肝炎病毒衣壳样颗粒(capsid-like particles, CLPs)并评价其免疫原性。方法:将SARS-CoV-2的4条B细胞线性表位(M1、S1-57、S14P5和S21P2)置换乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein, HBc)第80位丙氨酸。在大肠埃希菌BL21 Star (DE3)中诱导表达这4种线性表位和HBc的重组融合蛋白(M1-HBc、S1-57-HBc、S14P5-HBc和S21P2-HBc)。SDS-PAGE、Western blot和非变性琼脂糖凝胶电泳(native agarose gel electrophoresis, NAGE)鉴定表达产物。蔗糖密度梯度超速离心纯化CLPs并经Western blot验证其抗原性。用纯化的CLPs免疫BALB/c小鼠，通过ELISA测定血清中的抗体滴度。结果:重组融合蛋白M1-HBc和S1-57-HBc自组装成M1-CLP和S1-57-CLP，S1-57-CLP免疫小鼠后靶向S1-57多肽的抗体滴度高达1∶1 000 000。结论:在原核系统中成功表达了展示SARS-CoV-2 M1或S1-57线性表位的乙型肝炎病毒CLPs，S1-57-CLP具有良好的免疫原性，为研制SARS-CoV-2新型诊断试剂和疫苗提供了新思路。

目的:研究热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)在载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3B(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3B, APOBEC3B)抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)复制过程中的作用及机制。方法:通过免疫共沉淀(co-immunopreciptation，Co-IP)和GST pull-down试验研究HSP70与APOBEC3B的相互作用。干扰HSP70、过表达HSP70或使用HSP70抑制剂VER155008处理肝细胞后，Southern blot或real-time PCR检测APOBEC3B抗病毒作用的改变；差异DNA变性PCR(differential DNA denaturation PCR, 3D-PCR)和克隆测序检测APOBEC3B脱氨酶活性的改变。结果:HSP70能与APOBEC3B相结合，过表达HSP70能增强APOBEC3B的脱氨酶活性和抗HBV功能。相反，干扰HSP70或使用HSP70抑制剂VER155008后，APOBEC3B脱氨酶活性和抗HBV功能均减弱。结论:HSP70通过增强APOBEC3B的脱氨酶活性增强其抗病毒功能。

HBV引起的肝细胞癌居我国恶性肿瘤所致死亡原因的第一位。本文从HBV基因组流行病学入手，系统研究了HBV致癌各阶段病毒进化规律及其与宿主遗传因素的交互作用，综合分析了载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽家族在炎-癌转化中的桥梁作用，进而提出了普适性“癌症进化发育学”理论体系。癌症进化发育学为理解炎症促进癌症发展的机制奠定了理论基础，对多种恶性疾病的特异性预防、预测、早期诊断和靶向治疗具有重要意义。

目的:研究体外培养的人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)中钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)的表达情况，探索体外培养的BMSCs能否自然感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)及NTCP是否是HBV感染BMSCs的一个功能性受体。方法:将HBV阳性血清以不同方法感染BMSCs，检测培养基上清及细胞中HBV DNA、培养基上清中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)等感染指标。NTCP-siRNA转染BMSCs后，再次用HBV阳性血清感染BMSCs，检测各感染指标。Western blot法检测各处理组BMSCs中NTCP的表达情况。结果:HBV可自然感染体外贴壁培养的人BMSCs，但感染效率很低。当HBV感染悬浮状态下的BMSCs时，感染效率显著升高。BMSCs中存在NTCP的表达，且HBV可显著上调NTCP的表达量，特别是对悬浮状态下的BMSCs。当BMSCs中NTCP的表达被NTCP-siRNA沉默后，HBV对BMSCs的感染效率显著下降。结论:体外培养的人BMSCs可被HBV自然感染，且其细胞内表达的NTCP是其感染HBV的一个功能性受体。人BMSCs可作为一种易感、稳定、无需分子修饰的细胞模型，用于研究HBV生命周期的早期阶段以及抗病毒治疗研究。

探讨山药多糖(Chinese Yam polysaccharide,CYPS)协同核苷酸类似物(nucleoside analogues,NAs)抗乙型肝炎病毒(HBV)的分子机制.将不同浓度的山药多糖和恩替卡韦加入HepG2.2.15 细胞,采用cell counting kit-8(CCK-8)法检测细胞毒性,筛选 2 种药物抑制HepG2.2.15 细胞的最佳浓度及时间,细胞分为对照组、山药多糖组、恩替卡韦组和联合用药(山药多糖+恩替卡韦)组,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组药物对细胞上清表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)和e抗原(hepatitis B virus e antigen,HBeAg)分泌量的影响;采用聚合酶链式反应(probe quantitative real-time PCR,probe qRT-PCR)检测药物对HepG2.2.15 细胞HBV-DNA的影响;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测药物对HepG2.2.15 细胞p38 MAPK、p-p38 MAPK、Na+-牛磺胆酸共转运多肽(Na+-taurocholic cotransport polypeptide,NTCP)蛋白表达的影响;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测药物对HepG2.2.15 细胞中p38 MAPK、NTCP mRNA表达的影响.结果显示,与对照组相比,山药多糖组、恩替卡韦组和联合用药组中HBeAg、HBsAg浓度均下降(P<0.01 或P<0.001),均可抑制HepG2.2.15 细胞HBV-DNA(P<0.01),其中联合用药组抑制HepG2.2.15 细胞的 HBV-DNA更明显(P<0.001),且p-p38 MAPK、NTCP蛋白表达水平均显著降低(P<0.05 或P<0.01),p38 MAPK mRNA表达水平上升,NTCP mRNA表达水平下降(P<0.05 或P<0.01).综上,山药多糖可能通过p38 MAPK信号通路降低NTCP 蛋白和mRNA的表达协同恩替卡韦抗HBV.

钠离子牛磺胆酸共转运多肽(sodium-taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)缺陷病是一种溶质载体家族 10 成员 1(solute carrier family 10 member 1,SLC10A1)双等位基因突变引起的胆汁酸代谢障碍性疾病,分布具有区域和种族差异,其中SLC10A1 c.800C>T(p.Ser267Phe)是我国的高频突变.NTCP缺陷病患儿主要表现为病理性黄疸,少部分有生长、运动和神经系统发育迟缓的表现,成年患者临床症状和体征不明显,生化检查提示血清总胆汁酸水平升高、部分伴有转氨酶和25-羟维生素D3 水平降低.NTCP缺陷病性高胆汁酸血症需与乙型肝炎病毒感染、丁型肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎及妊娠期肝内胆汁淤积症等鉴别,妊娠合并NTCP缺陷病性高胆汁酸血症对母胎的影响迄今少有相关报道.综述NTCP缺陷病的分子遗传机制、临床表现、实验室检查、诊断、治疗及其对母胎的影响,为该病患者的明确诊断和正确干预提供依据.

目的 构建载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3A(APOBEC3A)与不同长度和序列的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的融合蛋白真核表达载体,研究其表达能力及融合蛋白的细胞内定位及胞嘧啶脱氨基活性.方法 采用In-Fusion重组克隆方法,将含有APOBEC3A的PCR产物分别和含有全长HBc、四种C端截短体HBc的PCR扩增片段连接克隆入真核表达载体pcDNA3.0.将重组载体分别转染HEK293T细胞,用免疫荧光细胞化学染色法检测融合蛋白在HEK293T细胞中的定位,Western blot法检测融合蛋白的表达水平;尿素变性PAGE法分析融合蛋白的胞嘧啶脱氨基活性.结果 构建的五种融合蛋白表达载体,可在HEK293T细胞中表达五种融合蛋白,4种含HBc截短体编码的融合蛋白表达载体比含全长HBc编码的融合蛋白载体的表达能力强;含全长HBc的融合蛋白APOBEC3A-HBc主要定位于细胞质,而含HBc截短体的融合蛋白APOBEC3A-HBc144S、APOBEC3A-HBc144E、APOBEC3A-HBc144AAA和APOBEC3A-HBc144A均主要定位于细胞核中;HBc截短体融合蛋白的胞嘧啶脱氨基活性高于全长HBc融合蛋白.结论 成功构建APOBEC3A与不同长度和序列HBc的融合蛋白真核表达载体,APOBEC3A与全长HBc及截短体HBc的融合蛋白在表达能力、细胞内定位以及胞嘧啶脱氨基活性具有明显差异.

目的 明确乙型肝炎病毒(HBV)大表面蛋白前S1区(PreS1)两个重要表位在中国乙型肝炎患者群中的基因型分布,探讨两表位基因型之间及两表位基因型与PreS1全长基因型之间的相关性,确定能否根据关键表位的多肽序列判断PreS1全长基因型. 方法 从患者血清中提取HBV DNA进行PCR扩增,对扩增成功的278例样本进行DNA测序,并与GenBank中已知的HBV序列比对,确定HBV大表面蛋白PreS1的两个关键表位(第21 ～ 47号氨基酸表位和第94 ～ 117号氨基酸表位,分别简称为P21表位和P94表位)基因型及PreS1全长基因型,并对3组基因分型结果进行一致性分析.一致性检验采用Kappa分析. 结果 成功测序232例样本.根据P21表位蛋白序列的分型结果为:C基因型201例,B基因型23例,基因型不确定8例.根据P94表位蛋白序列的分型结果为:C基因型199例,B基因型25例,基因型不确定8例.根据PreS1全长序列的分型结果为:C基因型207例,B基因型25例.P21表位基因分型和P94表位基因分型与PreS1全长基因分型结果均高度一致,分别为96.55％和96.12％(Kappa值分别为0.841,0.826),且两表位的基因分型结果也具有很好的一致性(93.10％,Kappa值为0.718). 结论 本研究创新性地提出基于关键表位氨基酸序列的基因分型方法,验证了中国乙型肝炎患者群的HBV基因型以B和C基因型为主,且HBV PreS1关键保守表位的基因分型结果与全长基因分型结果具有高度一致性(＞96％),可以采用一个或两个关键保守表位的基因分型代替全长基因分型.