目的:了解云南省大理白族自治州（简称大理州）亚洲带绦虫线粒体细胞色素b（Cytb）基因的遗传多样性。方法:2019年5月至2021年8月，在大理州血吸虫病防治研究所收治的绦虫病患者中，共采集131份带绦虫样本，涉及大理市（58份），巍山彝族回族自治县（简称巍山县，14份），弥渡县（18份），漾濞彝族自治县（简称漾濞县，24份），洱源县（17份）5个地区（即5个群体）。基于线粒体Cytb基因序列设计引物，采用PCR法扩增Cytb基因部分序列，并进行测序及同源性比对；使用MEGA 7.0、DNASP 5.10.01软件对测得序列进行分析，得到碱基组成、遗传距离、遗传多样性参数、遗传分化指数、基因流等数据。结果:131份带绦虫样本的Cytb基因扩增片段大小均为235 bp，经同源性比对均为亚洲带绦虫，A、T、G、C碱基的平均含量分别为23.8%、42.3%、24.0%、9.9%。131份亚洲带绦虫样本，共定义12个单倍型，单倍型多样性和核酸多样性分别为0.295 9和0.006 0；5个群体间的遗传分化指数和基因流范围分别为- 0.053 00~0.050 40和4.710 31~162.087 66。5个群体间的遗传距离范围为0.003 5~0.009 0，其中弥渡县与巍山县的遗传距离最大，大理市与漾濞县的遗传距离最小。结论:大理州亚洲带绦虫线粒体Cytb基因具有丰富的遗传多样性，各群体间存在频繁的基因交流，未形成显著的遗传分化。

目的 对青海地区多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫遗传分化特征进行分析,为青海省棘球蚴病的防控提供理论依据.方法 在玉树、果洛、黄南藏族自治州等棘球绦虫主要自然疫源地捕捉小型哺乳动物,剖检采集包囊,提取包囊组织基因组DNA,PCR扩增细胞色素氧化酶1(cox1)基因并测序,运用DnaSP v6、Iqtree、BEAST v2.7.4等软件进行单倍型分析、核苷酸多态性分析、系统进化树构建及棘球绦虫属分化时间估算.结果 从2 864只小型哺乳动物中共获得55份棘球蚴包囊.55份包囊DNA样品均扩增出长度约800 bp的cox1条带,其中37份为多房棘球绦虫,18份为石渠棘球绦虫,青海田鼠多房棘球蚴患病率为1.96％(37/1 884),高原鼠兔石渠棘球蚴患病率为1.84％(18/980).37条多房棘球绦虫cox1 序列共有单倍型5个,以EmH3单倍型为主(占33/37),单倍体多样性指数为0.207,核苷酸多样性指数为0.033 55,共有156个变异位点.18条石渠棘球绦虫cox1序列共有单倍型8个,以EsH2单倍型为主(占8/18),单倍型多样性指数为0.778,核苷酸多样性指数为0.060 52;共有14个变异位点.多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫的13个单倍型上传GenBank,单倍型EmH1～EmH5的登录号依次为 OR821706、OR821707、OR830343、OR830344、OR826123,EsH1～EsH8 登录号依次为 OR835156、OR835157、OR830376、OR830378、OR831110、OR875250、OR835161、OR841080.系统进化树分析显示,多房棘球绦虫的5个单倍型与多房棘球绦虫亚洲株聚为一支,石渠棘球绦虫的8个单倍型与GenBank中的石渠棘球绦虫聚为一支.基于cox1基因的分化时间结果显示,细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫、少节棘球绦虫和伏氏棘球绦虫的共同祖先存在于约5.67百万年前(Mya)(95％CI:4.72～6.66 Mya),细粒棘球绦虫、石渠棘球绦虫和多房棘球绦虫的平均分化时间约为2.02 Mya(95％CI:1.51～2.49 Mya).结论 青海地区多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫具有较高的遗传多样性,其中多房棘球绦虫以EmH3单倍型为主,石渠棘球绦虫以EsH2单倍型为主.

目的 开发基于PCR结合簇状规则间隔短回文重复序列及相关蛋白Cas12a(CRISPR/Cas12a)快速检测华支睾吸虫囊蚴的方法.方法 使用内转录间隔区(ITS)引物以华支睾吸虫基因组DNA为模板进行PCR扩增,取PCR扩增产物、Cas12a蛋白、crRNA、单链DNA(ssDNA)报告分子和焦碳酸二乙酯水,选择其中1～5个试剂,分别制备5个CRISPR反应体系,在紫外光下观察反应结果,验证PCR-CRISPR/Cas12a检测系统的可行性.设计5个浓度梯度(100、200、300、400、500 nmol/L)优化ssDNA报告分子浓度;保持 crRNA 浓度为 50 nmol/L,设计 5 个比例梯度(1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1)优化 Cas12a/crRNA比例,荧光定量PCR仪检测荧光信号.将重组质粒梯度稀释为10个不同浓度(10-2～107拷贝/μl),PCR扩增、CRISPR反应后检测荧光信号,评价检测系统的灵敏度.提取华支睾吸虫囊蚴、东方次睾吸虫囊蚴、猬迭宫绦虫裂头蚴、派氏异尖线虫和亚洲带绦虫节片基因组DNA,PCR扩增、CRISPR反应后检测荧光信号,评价检测系统的特异性.压片镜检华支睾吸虫病流行区捕获的小型淡水鱼鱼肉,分别挑选出华支睾吸虫囊蚴、东方次睾吸虫囊蚴和其他囊蚴(未鉴定出虫种)等3种囊蚴混合感染,华支睾吸虫和东方次睾吸虫囊蚴的混合感染,华支睾吸虫和其他囊蚴的混合感染,东方次睾吸虫和其他囊蚴的混合感染,单华支睾吸虫囊蚴感染,单东方次睾吸虫囊蚴感染,单其他囊蚴感染和无囊蚴感染等8种鱼肉样品组织,提取DNA后进行PCR-CRISPR/Cas12a检测,在紫外光下观察反应结果.使用GraphPad prism 9.0软件对数据进行单因素方差分析,两两比较采用图基多重检验.结果 完整的PCR-CRISPR/Cas12a检测系统能够在紫外光下产生荧光信号.ssDNA报告分子浓度为400nmol/L时,反应体系的荧光值为(40 786±1 758)AU,高于300nmol/L的(32 029±2 651)AU(P＜0.05),与 500 nmol/L 的(42 698±4 260)AU 差异无统计学意义(P＞0.05),选取ssDNA报告分子浓度为400 nmol/L.Cas12a/crRNA比例为2.0∶1时,反应体系的荧光值为(48 950± 3 723)AU,高于 1.5:1的(37 700±3 887)AU(P＜0.05),与 2.5∶1 的(55 630±3 110)AU 差异无统计学意义(P＞0.05),选取Cas12a/crRNA比例为2.0∶1.灵敏度检测结果显示,重组质粒的浓度为10-1拷贝/μl时,反应体系的荧光值为(39 336±7 231)AU,与阴性对照的(2 216±743)AU差异有统计学意义(P＜0.05);当浓度降至10-2拷贝/μl时,荧光值为(5 451±1 957)AU,与阴性对照的差异无统计学意义(P＞0.05).特异性检测结果显示,ITS引物能同时PCR扩增华支睾吸虫、东方次睾吸虫、猬迭宫绦虫、派氏异尖线虫和亚洲带绦虫等5种基因组DNA;相同扩增产物的CRISPR检测结果显示,仅以华支睾吸虫基因组DNA为模板的反应体系在紫外光下产生了荧光信号.PCR-CRISPR/Cas12a效果评价检测结果显示,8种不同囊蚴感染的鱼肉样品反应体系中,含有华支睾吸虫囊蚴的4管出现荧光信号.结论 本研究建立了华支睾吸虫囊蚴的PCR-CRISPR/Cas12a检测方法,该方法灵敏度高、特异性好、高度模块化,具有较好的现场应用潜力.

目的 2000-2014年对云南禄丰干海资、牟定蟠猫、昆明远郊农村、兰坪河西等4地区人群进行亚洲带绦虫病流行病学调查,查明流行地区,掌握流行特征、人群感染现状,为制定防治措施提供科学依据.方法 根据亚洲带绦虫病例线索,设病例居住地为调查点.采用访问法进行病史调查及收集近期感染者带绦虫孕节片病原学检查等方法.结果 病史调查共912户5 081人,查出亚洲带绦虫感染者849人,总感染率为16.71％.病原学检查感染者孕节片标本585份,均为亚洲带绦虫.各地区人群感染率分别为:禄丰干海资22.64％(144/636)、牟定蟠猫8.78％(51/584)、昆明远郊农村2.53％(40/1 580)、兰坪河西26.92％(614/2 281).不同地区人群感染性别差异无统计学意义,不同年龄、民族和职业感染率间差异有统计学意义.流行因素调查,四地居民普遍有生食猪肝的饮食习惯占调查人数的93.11％(4 731/5 081),未查见有生食猪肉、牛肉的饮食习惯.卫生习惯不良者占调查人数的30.49％(1 549/5 081);牲畜放养率占其饲养户的55.83％(407/729);有“连茅圈”的居民户占41.54％ (140/337).结论 云南禄丰干海资、牟定蟠猫、昆明远郊农村、兰坪河西为亚洲带绦虫病流行区,本病的流行系多种因素综合的结果,生食猪肝的饮食习惯是人体感染的重要途径.

为了观察常用调料、酒精饮品和饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴的体外作用,研究组自亚洲带绦虫孕节收集虫卵,体外孵化至六钩蚴阶段,同时以地塞米松皮下注射昆明鼠30 d后,按5 000个六钩蚴/只对昆明鼠进行感染,于感染后60 d剖杀小鼠获取活囊尾蚴,将常用调料(食醋、10％食盐水、30％食盐水、酱油、100％生姜汁、100％大蒜汁、10％辣椒水和100％柠檬汁)、酒精饮品(白酒、啤酒和红酒)和饮料(鲜橙多、营养快线和可乐)于常温下按不同作用时间分别体外作用活囊尾蚴,将囊尾蚴与猪胆汁于37℃培养48h观察头节翻出情况,测定并比较调料、酒精饮品和饮料在各时间点作用后对亚洲带绦虫囊尾蚴的死亡率.结果显示,食醋和30％食盐水,酒精饮品中的白酒均可在作用5 min内杀灭全部囊尾蚴(P＜0.05),酱油处理需15 min杀死全部囊尾蚴(P＜0.05),10％辣椒水需30 min导致囊尾蚴全部死亡(P＜0.05),100％蒜汁、100％姜汁和100％柠檬汁分别处理10、30和40 min后囊尾蚴死亡率达100％(P＜0.05),而常用饮料对亚洲带绦虫囊尾坳影响不显著.因此得出结论,食醋、食盐水、食用酱油、生姜汁、大蒜汁、辣椒水和柠檬汁等常用调料于体外对亚洲带绦虫囊尾蚴均有杀灭作用,其中以食醋和食盐水对亚洲带绦虫囊尾蚴杀灭作用最佳;酒精饮品中的白酒对亚洲带绦虫囊尾蚴具有最佳杀灭效果;而常用饮料对亚洲带绦虫囊尾蚴作用不显著.该研究为防治亚洲带绦虫感染导致的食源性寄生虫病提供了具有重要指导意义的基础资料.

诊治分析宁海县首例带绦虫感染病例,并鉴定感染虫种.对患者开展流行病学调查,收集患者主要临床表现、生活习惯等资料.采集患者粪样,制备生理盐水涂片,观察虫卵形态.使用槟榔南瓜子进行驱虫治疗,对患者排出的虫体进行形态学观察.利用PCR技术扩增虫体DNA的线粒体细胞色素c氧化酶1(cox1)基因片段并进行序列分析.流行病学调查结果显示,患者无外出旅行史和生食史,仅2017年9月初曾食过未完全煮熟的牛肉.于2017年11月10日出现腹泻、易饥饿现象;11月26日,肛周首次排出长约30 cm、白色、扁平状、类似面条样的节片;12月4日,肛周再次排出长约2 cm的多节节片,遂至宁海县中医院诊治,诊断为“疑似带绦虫病”.粪样镜检结果显示,可见虫卵,内含六钩蚴,未见卵膜.对排出的成虫进行形态学鉴定:虫体前端细长,向后逐渐变粗变宽变厚,由颈节和链体节片连接而成,未发现头节;孕节子宫分支整齐,每侧约24～28支,总长5.32 m,疑似牛带绦虫.cox1基因经PCR扩增后,可获得长度为832 bp的目的条带.测序后的BLAST比对分析结果显示,目的条带与牛带绦虫(Taenia saginata,GenBank登录号为AB107239.1)cox1基因序列的同源性为99％,与亚洲带绦虫(Taenia asiatica,GenBank登录号为AB107235.1)和猪带绦虫(Taenia solium,GenBank登录号为AB066485.1)cox1基因序列的同源性分别为96％和88％.综合患者的流行病学调查、虫体形态学观察、cox1基因序列比对的结果,确诊该患者属于食用未煮熟牛肉引起的牛带绦虫感染.

目的 建立一种新的敏感、特异且能快速检测细粒棘球绦虫G1的重组酶介导扩增技术(Recombinase aided isothermal amplification,RAA). 方法 以细粒棘球绦虫G1(E.granulosus G1,EgG1)线粒体基因序列(GenBank No.AF297617)作为靶序列设计合成引物,以EgG1 DNA为模板进行RAA扩增,反应产物预期大小为284 bp.以聚合酶链式反应(PCR)作为平行对照,应用RAA扩增不同稀释浓度的基因组DNA及梯度稀释的含目的基因片段不同拷贝数的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测方法的检测灵敏度;应用此方法检测多房棘球绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、贾第鞭毛虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价方法的特异性.方法优化后用于检测感染EgG1的动物组织标本(10份)、模拟现场阳性犬粪标本(3份)以及现场阳性犬粪标本(5份),以验证该项检测技术的可靠性和实用性. 结果 建立的RAA法可在40 min内特异性扩增EgG1的目的基因片段,最低可检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低检出质粒拷贝数为104个.用建立的RAA法检测其他寄生虫(包括多房棘球绦虫)结果均为阴性.用优化的RAA方法检测感染EgG1的动物组织标本以及阳性粪便标本(包括模拟现场粪便标本),结果均为阳性,且与PCR检测结果一致. 结论 建立的针对EgG1的RAA方法,其具有简便快捷、检测灵敏度与特异性均较好的特点,可望用于细粒棘球绦虫虫种的鉴定以及棘球蚴病基因诊断.

目的 基于重组酶介导的等温扩增技术(recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫的多重核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价.方法 分别以多房棘球绦虫(GenBank登录号:NC_000928)、细粒棘球绦虫(GenBank登录号:NC_044548)和石渠棘球绦虫(GenBank登录号:NC_009460)线粒体基因组序列为靶序列,依据RAA引物设计基本原则设计、合成3对引物,并进行多重RAA扩增.分别扩增不同浓度3种棘球绦虫基因组DNA和不同浓度含3种靶基因的重组质粒,以评价多重RAA检测方法的敏感性;同时采用该方法检测3种棘球绦虫及多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫基因组DNA,以评价该方法的特异性.优化建立的多重RAA法的条件,再检测棘球蚴病病变组织样本、模拟犬粪便样本和现场狐狸粪便样本,以评价该方法的应用价值.结果 所建立的多重RAA检测方法可在39℃时40 min内特异性扩增多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫线粒体基因片段,长度分别约为540、430 bp和200 bp.该多重RAA法对多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA的最低检测限为2.0、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL,对含多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫靶基因的重组质粒的最低检测限均可达到200拷贝/μL;该多重RAA法可以同时检测出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫单一感染和多重感染,对多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫无扩增.优化后的多重RAA法能够检测出全部棘球蚴病病变组织样本及模拟犬粪样本和现场狐狸粪便样本中的阳性样品,且与单一PCR法检测结果完全一致.结论 成功建立了一种可用于多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA快速检测的多重RAA法,特异性和敏感性均较高.

包虫病又称棘球蚴病，是由棘球绦虫幼虫棘球蚴感染引起的人畜共患寄生虫病。包虫病主要分为囊型包虫病和泡型包虫病两种类型。全球包虫病分布区域主要包括亚洲、欧洲、非洲、南美洲、澳洲等畜牧地区。包虫病是世界卫生组织认定的17种被忽视的热带疾病之一，也是优先支持预防和控制的人畜共患病[1]。中国是包虫病主要流行国家，据估计，全球约91%的泡型包虫病患者分布在中国西部的畜牧区，平均患病率1.08%，其中青藏高原部分地区人群患病率高达6%[2,3]。在人体中，包虫病好发部位是肝脏，其次是肺、脑、骨等，未治疗或治疗不充分的肝泡型包虫病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）患者诊断后10~15年病死率高达90%，肝囊型包虫病（hepatic cystic echinococcosis，HCE）病死率为2%~4%[3]。

绦虫病是由猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫寄生于人体肠道所引起的食源性人兽共患寄生虫病.人类是唯一的最终宿主.该文报道一例 绦虫感染致急腹症患者的诊治经过.该例28岁男性患者主要表现为腹痛,入院后行血常规、生化、影像学等检查,阑尾炎表现不典型,考虑其他原因的急腹症,经禁饮、禁食、灌肠、抗炎、补液等保守治疗后,患者恢复排便排气,腹痛明显缓解,由患者排出的粪便中见绦虫的带节片,确诊为绦虫感染致不完全性肠梗阻,诊断明确后予阿苯达唑驱虫治疗并顺利出院.该例的诊治过程提示,临床医师应提高对肠道寄生虫病的认识,拓宽诊断思路,减少漏诊和误诊.