目的:比较超速离心法和尺寸排阻色谱法提取干细胞外泌体的产率、纯度、生物活性和促骨修复能力的差异.方法:采用超速离心法和尺寸排阻色谱法提取骨髓间充质干细胞外泌体,对外泌体的粒径、外观形貌和标志蛋白进行鉴定表征.采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定外泌体中蛋白含量,并采用血管生成因子芯片对外泌体中成血管相关蛋白进行分析.采用划痕实验和小管形成实验评价外泌体体外促血管生成能力,进一步在大鼠骨缺损模型中评价外泌体对骨修复再生的效果.结果:单位体积上清液中,超速离心法所得外泌体(Exo-UC)质量低于尺寸排阻色谱法所得外泌体(Exo-SEC)质量.电镜下见Exo-SEC中杂质蛋白少于Exo-UC中的杂质蛋白.Exo-UC中检测到16种成血管蛋白,Exo-SEC中检测到的成血管蛋白种类和含量均少于Exo-UC.与Exo-SEC比较,Exo-UC能够显著促进血管内皮细胞迁移和小管形成,并显著提升大鼠骨缺损部位的骨体积百分比和骨矿物质密度.结论:超速离心法提取的干细胞外泌体促新生血管形成能力更强,骨修复效果更佳.

目的 研究地五养肝方对非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠循环外泌体溶血甘油磷脂(Lyso-GPLs)的调控作用.方法 采用尺寸排阻色谱法分离血液中循环外泌体,运用透射电镜观察外泌体的外观、粒径仪检测外泌体直径分布、Western blotting法检测外泌体表面特异性蛋白CD9,CD63及TSG101的表达;将24只雄性KM小鼠随机分为正常组、模型组和复方给药组,8只/组,正常组给予标准饲料,模型组和复方给药组饲喂高脂饲料,喂养1周后,各给药组小鼠按剂量给予地五养肝胶囊内容物,正常组和模型组给予等量生理盐水,灌胃给药4周.末次给药后,各小鼠麻醉后取血分离血清,检测总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST),观察其对NAFLD的改善作用并提取血清中循环外泌体;同时,结合多元统计分析,筛选NAFLD小鼠循环外泌体中Lyso-GPLs类成分生物标志物,观察地五养肝方对标志物的调控作用.结果 透射电镜结果显示外泌体大小在100 nm左右,形状为典型的具有清晰双层膜的茶托样结构;粒径结果显示循环外泌体粒径分布均匀,平均粒径为137.5 nm;Western blotting检测结果表明外泌体表面特异性蛋白CD9,CD63及TSG101的存在;模型组小鼠血清中TC、HDL-C、LDL-C和AST水平显著高于正常组(P<0.01),经地五养肝方治疗后,TC、LDL-C、AST、ALT水平显著回调(P<0.01),并筛选出43个经地五养肝方治疗后呈现显著回调趋势(P<0.01)的Lyso-GPLs标志物成分.结论 地五养肝方防治NAFLD的作用机制涉及对循坏外泌体溶血甘油磷脂的改善和调控作用,为其防治慢性肝病的作用机制研究提供了新的科学视角.

本研究旨在建立一种灭活禽流感病毒原料液中完整病毒颗粒准确定量的方法.针对直接采用高效液相尺寸排阻色谱法(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)检测灭活禽流感病毒原液存在杂质干扰的问题,首先以H5N8型抗原为对象,分别考察了聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀和离子交换色谱法(ion exchange chromatography,IEC)进行预处理.在优化条件下,经 DEAE FF阴离子交换层析纯化预处理,杂蛋白去除率为 86.87%,病毒血凝回收率为 100%.HPSEC分析预处理后的样品,8.5-10.0 min处色谱峰样品电泳检测显示主要为H5N8 病毒蛋白,动态光散射分析平均粒径为 127.7 nm,推测为完整病毒特征峰;在IEC预处理后的样品中加入抗体进行HPSEC检测,8.5-10.0 min处特征峰消失,显示IEC预处理有效去除了杂质干扰.通过将HPSEC与多角度激光散射技术(multi-angle laser scattering technique,MALLS)联用,可以准确获得样品中完整病毒颗粒的数量,且病毒颗粒数与色谱峰面积具有良好线性关系(R2=0.997).建立的IEC预处理-HPSEC-MALLS检测方法应用于其他亚型(H7N9)、批次和浓度的病毒原液中完整病毒颗粒数的准确检测,均具有良好适用性,且重复性好,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)<5%,n=3.

目的 优化重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc免疫融合蛋白多聚体含量尺寸排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测方法,并对优化的方法进行验证.方法 利用SEC-HPLC法对rhGH-Fc免疫融合蛋白中多聚体含量进行检测,优化检测条件(盐浓度、流动相pH、流速、柱温及色谱柱型号),观察目的蛋白与聚合体分离的效果.对方法的系统适应性、专属性、线性与范围、精密性、准确性及定量限进行验证.结果 优化后的方法为采用TSK-gelG2000SWxl色谱柱(5 μm,7.8mm× 300 mm)进行测定,流动相50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.80),检测波长280 nm,进样量100μL,流速0.6 mL/min,柱温45℃.rhGH-Fc免疫融合蛋白与聚合物分离度、理论塔板数、拖尾因子均能满足要求;rhGH-Fc免疫融合蛋白样品与对照品出峰时间一致,GH国家标准品与对照品出峰时间不同,蛋白缓冲液不出峰;rhGH-Fc免疫融合蛋白浓度在0.307～1.842 mg/mL范围内,其峰面积与上样量呈良好的线性关系(R2=0.9994);重复性验证峰面积和纯度的RSD分别为0.7％和0.1％;中间精密性验证的RSD为0.8％;准确性验证的平均回收率为99.1％,RSD为1.9％;定量限为6μg/mL.结论 采用优化后的SEC-HPLC法检测rhGH-Fc免疫融合蛋白多聚体含量,准确性有所提高,柱效与分离度符合《中国药典》四部(2020版)的相关规定,可用于对样品中高分子含量的检测.

该研究根据麻杏石甘汤中胶体颗粒尺寸不同对其进行分离、表征、含量测定及抗病毒药效研究.采用超滤法将麻杏石甘汤的混合胶体相态初步拆分为小胶体颗粒段(S)、中胶体颗粒段(M)、大胶体颗粒段(B),并用体积排阻色谱法进一步精细拆分,动态光散射法(DLS)及透射电镜法(TEM)表征分离后胶体颗粒的大小及形貌.UPLC-MS/MS测定不同胶体相态中麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸含量,EDTA络合滴定钙(Ca2+)含量.最后,滴鼻法建立呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠模型,实验设空白组、模型组、利巴韦林组、麻杏石甘汤(MC)组、S组、M组、B组,灌胃给药治疗,考察小鼠肺组织病理变化及脏器指数.研究结果显示,麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸及Ca2+含量在不同胶体段中分布并不均匀,其中B段是除Ca2+外其他3种成分占比最高的部分,分别占全方的46.35％、53.72％、92.36％.体积排阻色谱法分离到粒径在100～500 nm的形貌均一的胶体颗粒.与S、M段相比,B段能提高RSV感染小鼠的肺指数抑制率(38.31％)、脾指数及胸腺指数,并改善小鼠肺组织炎症细胞浸润及肺损伤情况.麻杏石甘汤中的复杂成分通过加热形成大小不一、形态各异的胶体颗粒,麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸、Ca2+等小分子活性成分都不同程度地参与组装.麻杏石甘汤中发挥抗病毒作用的主要物质基础就是加热过程中活性成分组装产生的具有一定粒径的胶体颗粒.

将合成的人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)突变体基因与IgG4抗体的Fc部分进行融合获得GLP-1-IgG4-Fc片段,获得的基因片段与pXC17.4载体进行连接,用电转化方法将线性化质粒稳定转染CHO-K1细胞,通过ClonePix 2筛选出高表达细胞株,产量达1.5g/L.收集培养上清并经Protein A和Source 30Q纯化,得到的GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白,SDS-PAGE纯度高于95％,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度和毛细管区域凝胶电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)纯度均不低于80％,尺寸排阻层析(size-exclusionchromatography,SEC)纯度高于99％.经质谱和肽图谱测定,分子量与理论值一致,肽图谱序列与对照品高度一致.生物学活性分析表明,GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白具有促进表达有GLP-1受体的HEK293细胞分泌环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的活性,并且该活性与对照品高度相似.

为检测工业级菊粉生产中不同工艺过程中的菊粉含量及鉴定问题产品真伪,文章研究建立了菊粉含量的离子色谱测定方法及真伪鉴别方法.采用Dionex ICS5000+离子色谱仪,样品组分分离采用CarboPac PA2003 mm×250 mm色谱柱,配备同系保护柱CarboPac PA200 3 mm×50 mm,柱温30℃,体积流量0.40 mL/min,流动相采用梯度洗脱模式,流动相A(NaOH)在20'25 min内由6 mmol/L线性增至100 mmol/L并保持至50 min,流动相B(NaAC)在25～35 min内由0 mmol/L线性增至100 mmol/L并保持至50 min,检测器采用脉冲积分安培检测器,电极Au,参比电极Ag/AgCl,检测器电位波形为糖四电位波形,进样体积10 μL,方法所用对照品采用Sepax Zenix SEC150+ SEC100尺寸排阻制备色谱柱对菊粉成品进行纯化制备,纯化物采用傅里叶变换红外光谱进行结构表征,并采用shodex KS802配位体交换色谱柱进行纯度分析.结果表明采用尺寸排阻制备色谱纯化菊粉对照品具有可行性,所得菊粉对照品纯度为99.3％,满足未知样品定量需求,离子色谱分析得出菊粉线性方程为y =4.126x+1.391(R2 =0.997 8),线性范围在0.10 ～ 5.00 μg/mL之间,方法检测限为10.34 ng/mL,采用离子色谱法对问题样品进行真伪鉴别较尺寸排阻色谱具有更高的分离选择性.采用所建方法简单灵敏,能够有效地指导菊粉生产及鉴定产品真伪.

目的:针对抗白细胞分化抗原38(cluster of differentiation 38,CD38)单抗的关键质量属性建立质控方法.方法:采用肽图法进行鉴别;采用还原/非还原十二烷基磺酸钠毛细管电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)和尺寸排阻色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)进行纯度控制;采用成像毛细管等电聚焦电泳(imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis,iCIEF)测定电荷异质性;采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定结合活性;采用补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)的方法测定生物学活性.其他各项指标均应符合2015年版《中华人民共和国药典》以及其他相关要求.结果:肽图检测具有特征图谱,起到很好的鉴别作用.还原CE-SDS的轻链与重链峰面积之和百分比为(97.87±0.72)％,非还原CE-SDS主峰峰面积百分比为(97.70±0.35)％;SEC-HPLC单体的峰面积百分比为(99.15±0.01)％,高分子量物质的峰面积百分比为(0.47±0.002)％,低分子量物质的峰面积百分比为(0.37±0.01)％.iCIEF分析的主要亚型的峰面积百分比为(63.54±0.37)％,酸性亚型的峰面积百分比为(23.07±0.50)％,碱性亚型的峰面积百分比为(13.38±0.12)％.结合活性的半最大效应浓度(concentration for 50％ ofmaximal effect,EC50)值为(7.35±0.06)ng· mL-1.CDC活性EC50值为(270.67±12.42)ng· mL-1,ADCC活性EC50值为(8.71±1.04) ng·mL-1.结论:针对抗CD38单抗的质量属性,研究建立质控方法并进行质量研究,确保产品的安全、有效和质量可控,对抗CD38单抗的质量控制具有借鉴意义.

目的 探讨蛴螬均一性多糖组分HDPS-2Ⅱ对肝癌的抑制作用.方法 采用碱水提取,反复冻融除蛋白等方法获得蛴螬总多糖;用离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法分离纯化总多糖获得均一性多糖组分HDPS-2Ⅱ.用高效尺寸排阻色谱法(HPSEC)和考马斯亮蓝法等测定HDPS-2Ⅱ的理化性质.采用MTT、划痕实验和H22肝癌移植瘤小鼠模型测定蛴螬多糖体内外的抗肿瘤活性.结果 蛴螬多糖组分HDPS-2Ⅱ的相对分子质量为8.2×103 Da,蛋白质、糖醛酸、硫酸基和氨基含量分别为2.08％,12.08％,0.24％和4.89％.HDPS-2Ⅱ体外可抑制肿瘤细胞的迁移,体内可显著抑制小鼠体内肿瘤的生长,HDPS-2Ⅱ中、高剂量组抑瘤率分别为52.0％和56.9％;与环磷酰胺(CTX)组比较,蛴螬多糖组分HDPS-2Ⅱ可显著增高脾脏指数、白细胞和淋巴细胞数量(P＜0.05).结论 蛴螬多糖组分HDPS-2Ⅱ具有抑制细胞体外迁移、小鼠移植瘤的生长和免疫调节作用,具有进一步研发的价值.

目的:利用临床常用抗体将人重链铁蛋白(HFn)纳米材料更好地靶向肿瘤,以期改善肿瘤的靶向成像或药物治疗,促进蛋白类纳米材料向临床转化.方法:在大肠杆菌内表达纯化得到HFn,以抗人表皮生长因子受体2抗体(anti-HER2)作为模型抗体,用双功能交联剂马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(Mal-PEG-NHS)将HFn与anti-HER2偶联形成HFn/anti-HER2复合物;标记荧光后,观察其不同时间内在HER2阳性乳腺癌荷瘤小鼠内的分布,判断其作为靶向肿瘤药物的可能性.结果:通过尺寸排阻凝胶色谱纯化的靶向复合物HFn/anti-HER2保留典型的对称球状结构,粒径大小为16.88±0.49 nm,较HFn粒径7.11±0.1 nm增加;HFn/anti-HER2组在肿瘤部位的荧光强度是对照组HFn的3倍,说明可以通过偶联抗体提升HFn的靶向性.结论:构建了人重链铁蛋白与抗体的复合物,提升了铁蛋白的靶向性.抗体铁蛋白复合物为铁蛋白类靶向成像及治疗药物的开发提供了新的思路.