目的:探讨复合人表皮干细胞（ESC）的猪脱细胞真皮基质（ADM）对裸鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。方法:采用实验研究方法。采用数码相机拍照观察猪ADM形态，采用苏木精-伊红（HE）染色观测猪ADM中细胞残留，采用扫描电子显微镜观察猪ADM表面结构，采用红外光谱仪分析猪ADM二级结构，采用动态光散射粒度分析仪分析猪ADM粒径，采用纳米粒度电位仪分析猪ADM电位。采用倒置荧光显微镜观察猪ADM在培养基中放置30 min、1 d、5 d的形态（样本数为2）；采用随机数字表法（分组方法下同）将猪ADM分为5 min组、10 min组、20 min组、30 min组、60 min组、120 min组，常温静置相应时间，称量法计算吸水量（样本数为3）；将Swiss小鼠胚胎成纤维细胞（Fb）分为仅有培养基的空白对照组和另加入相应终质量浓度的ADM浸提液的50.0 g/L ADM浸提液组、37.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、6.5 g/L ADM浸提液组，分别于培养24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖率并进行细胞毒性分级（样本数为5）；将1只6周龄雄性SD大鼠红细胞分为生理盐水组、超纯水组及添加相应终质量浓度猪ADM浸提液的5 mg/mL ADM浸提液组、10 mg/mL ADM浸提液组、15 mg/mL ADM浸提液组，于反应3 h，采用酶标仪检测血红蛋白的吸光度值代表猪ADM血液相容性（样本数为3）。从陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院泌尿外科2020年7月收治的1名6岁健康男童包皮环切术后废弃包皮中分离培养ESC并采用流式细胞术鉴定。混合培养法构建复合ESC的猪ADM（以下简称ESC/ADM）颗粒，培养3 d后采用HE染色和激光扫描共聚焦显微镜观察ESC/ADM复合效果。将36只7~8周龄雄性无胸腺裸鼠分成单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组，每组9只，并建立全层皮肤缺损创面模型，伤后即刻，创面均一次性采用相应试剂处理。分别于伤后1、7、11、15 d，观察创面愈合情况并计算创面愈合率（样本数为3）；伤后7 d，行HE染色观察创面上皮化情况并测量未上皮化长度（此处及以下样本数均为4）；伤后11 d，行Masson染色观察创面胶原沉积和真皮化情况并计算创面切面真皮面积，行免疫荧光染色并计算创面表达ESC特异性标志物CD49f的细胞数，行实时荧光定量反转录PCR检测创面移植ESC的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的mRNA表达。对数据行独立样本 t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、LSD- t检验。 结果:猪ADM为白色微粒状，内部无细胞存在，由网状结构组成，结构排列无序，表面粗糙；猪ADM分别在1 659、1 549、1 239 cm -1波数处出现吸收峰；猪ADM在溶液中主要粒径分布在500~700 nm；猪ADM表面带负电荷。放置30 min、1 d、5 d，猪ADM均形态相对稳定；放置30~120 min猪ADM吸水量保持相对高水平。6.5 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组小鼠胚胎Fb在培养24 h细胞毒性分级为1级，其余各组各时间点细胞毒性分级均为0级。反应3 h，超纯水组红细胞中血红蛋白的吸光度值明显高于生理盐水组和15 mg/mL ADM浸提液组（ t值分别为8.14、7.96， P<0.01）。第4代细胞常规培养3 d形态呈鹅卵石样且低表达CD71和高表达CD49f的被鉴定为ESC。猪ADM颗粒上有ESC附着、生长。伤后1 d，单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面大小基本一致。伤后7、11、15 d，各组裸鼠创面收缩，其中单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面收缩明显。伤后7 d，单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组（ t值分别为2.83、4.72， P<0.05或 P<0.01）；伤后11 d，ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组（ t=4.86， P<0.01）；伤后15 d，单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率均明显高于单纯PBS组（ t值分别为2.71、2.90、3.23， P<0.05）。伤后7 d，单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面未上皮化长度分别为（816±85）、（635±66）、（163±32）μm，明显短于单纯PBS组的（1 199±43）μm（ t值分别为5.69、10.19、27.54， P<0.01）。伤后11 d，单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面切面真皮面积明显大于单纯PBS组（ t值分别为27.14、5.29、15.90， P<0.01）；单纯ADM组和ESC/ADM组裸鼠创面的胶原生成比单纯PBS组明显，单纯ESC组和单纯PBS组相近。伤后11 d，单纯ESC组和ESC/ADM组裸鼠创面中CD49f表达阳性数量分别为（135±7）、（185±15）个，GAPDH的mRNA表达阳性；单纯PBS组、单纯ADM组裸鼠创面均无CD49f、GAPDH的mRNA表达。 结论:ESC/ADM颗粒能够促进裸鼠全层皮肤缺损创面愈合，这可能与其提高了ESC移植后的存活率和ADM促进了真皮结构重排、血管新生有关。

流式细胞术（FCM）是一项集光学、应用流体学、电子学和计算机等多门学科为一体的细胞分析技术。目前，FCM在血液系统肿瘤的诊断与治疗监测中广泛应用，但在非造血系统肿瘤（NHN）的临床应用仍处于初级阶段。近年来，随着分析需求的日益增长和科学技术的发展，一系列与现有高新技术高度整合的新型FCM逐步受到关注，例如质谱流式细胞术（CyTOF）、全光谱流式细胞术（SFC），这些新型FCM的出现为NHN患者临床实验室辅助诊断提供了更多的可能。该文阐述传统FCM、CyTOF与SFC原理及其在NHN诊断和治疗中的应用及前景，为FCM在临床检验的进一步拓展应用提供参考。

目的 采用一步水热合成法制备C60/Fe3O4-Dox磁性纳米递药系统并考察其磁热性能.方法 选择富勒烯(C60)作为超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的载体,采用一步水热合成法制备C60/Fe3O4纳米载体;通过吸附法装载阿霉素(Dox)构建了 C60/Fe3O4-Dox磁性纳米递药系统;采用傅里叶变换红外光谱仪、透射电镜(TEM)和马尔文粒度分析仪等方法对纳米载体进行结构表征;利用红外热成像仪考察不同功率、浓度、质量分数以及介质对C60/Fe3O4-Dox磁性纳米递药系统磁热性能的影响;采用CCK-8法检测不同浓度C60/40％Fe3O4-Dox对4T1细胞活力的影响,通过流式细胞测量术检测细胞凋亡情况.结果 表征显示成功制备C60/Fe3O4纳米载体,且载药后粒径由44.61 nm增至61.85 nm,载药量6.21％,包封率74.09％.30mg·mL-1的C60/40％Fe3O4-Dox分散液在外加磁场(210 V,350 W)作用下于6 min内升温达到42～46 ℃的目标温度范围.在模拟不同pH的体内环境中,C60/40％Fe3O4-Dox磁性纳米递药系统在肿瘤弱酸性条件下的升温效果优于生理盐水以及弱碱性体液环境.C60/40％Fe3O4对4T1细胞无明显毒性,通过磁热疗作用显著抑制细胞增殖(P＜0.05),C60/40％Fe3O4-Dox使细胞凋亡率显著增加(P＜0.01).结论 制备的C60/Fe3O4-Dox磁性纳米递药系统在交变磁场中,C60/Fe3O4分散液的升温效果与其浓度、Fe3O4质量分数和磁场功率成正相关;细胞实验证实其具备较好的生物安全性,且在外加磁场作用下,C60/40％Fe3O4-Dox通过磁热疗效应与Dox协同作用可显著诱导4T1细胞凋亡.

死亡时间(pMI)的判定在法医学研究及检案工作中一直占据极其重要的地位.玻璃体液因其独特的解剖学位置,被认为能较好地用于pMI推断,且引起了学者的兴趣,并对此展开了较多研究.目前,针对玻璃体液的检测技术在不断发展完善,并已被逐渐应用于法医学,同时利用玻璃体液进行pMI推断的研究也在不断深入.本文对目前已报道的不同玻璃体液检测技术、仪器,如离子选择性电极技术、毛细管离子分析技术、光谱法、色谱法、纳米传感技术、全自动生化分析仪、流式细胞仪等,以及近年基于此展开的pMI推断研究的相关进展进行了综述,同时分析其存在的问题,为学者们提供研究方向,以期使得玻璃体液分析在pMI推断中更加精确、实用.

目的 探讨尿流式细胞术联合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/I-onization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)直接鉴定尿标本病原菌的应用.方法 收集2017年1-10月住院及门诊泌尿系统感染患者送检的清洁中段尿阳性标本234份.所有样本均通过尿流式细胞仪(UF-1000i)进行菌量计数;根据主要病原菌不同浓度的菌量,由MALDI-TOF MS判断分值来判定结果的可靠性.MALDI-TOF MS技术直接鉴定中段尿标本中大肠埃希菌(UF-1000i细菌计数>105个/ml)与Biotyper数据库中的大肠埃希菌最佳匹配图谱进行比较.MALDI-TOF MS技术鉴定血琼脂平板上与中段尿不同菌量计数的大肠埃希菌的光谱比较.结果 MALDI-TOF MS直接法鉴定大肠埃希菌为可靠鉴定的最低菌量浓度为6×104个/m l,铜绿假单胞菌最低菌量浓度为1×105个/m l,金黄色葡萄球菌最低菌量浓度为3×105个/m l,粪肠球菌最低菌量浓度为5×105个/ml.MALDI-TOF MS技术直接鉴定中段尿标本中大肠埃希菌(UF-1000i细菌计数>105个/ml),鉴定分值为2.245.利用MALDI-TOF MS直接鉴定与Vitek2-Compact全自动细菌鉴定进行对比,鉴定结果一致率为90.39％(207/229);中段尿培养为2种菌时,MALDI-TOF MS直接鉴定法鉴定结果为不可靠.MALDI-TOF MS直接法鉴定结果中鉴定到种水平207例占90.39％(207/229),鉴定到属水平216例94.32％(216/229),5.68％(13/229)MALDI-TOF MS未提供可靠的鉴定结果.结论 尿流式细胞术与MALDI-TOF MS技术联合直接鉴定尿液中病原菌,是一种可靠细菌鉴定的新方法,其快速准确的鉴定,可为临床治疗提供病原学依据,具有一定的临床价值.

细胞凋亡早期,磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧,Annexin A5可与PS高亲和力结合,这是其检测凋亡的原理.绿色荧光探针标记的Annexin A5和碘化丙啶联合标记应用于流式细胞术进行细胞凋亡检测,该方法灵敏度高、特异性好、效率高,已成为目前全世界通用的细胞凋亡检测方法.除FITC-Annexin A5外,Annexin A5-EGFP融合蛋白是另一个常用的简单、可信、易于制备的凋亡检测探针.黄色荧光蛋白是绿色荧光蛋白的一种突变体,其荧光向红色光谱偏移.目前,有三种改良的黄色荧光蛋白:Citrine、Venus、Ypet,这三种改良的蛋白荧光更亮、更稳定、成熟更快.该文选择Citrine、Venus、Ypet来制备Annexin A5凋亡检测探针,通过原核表达和分离纯化Annexin A5-Citrine、AnnexinA5-Venus和Annexin A5-Ypet融合蛋白,获得了高产量的可溶性蛋白,探究这三种融合蛋白与凋亡细胞的结合能力,筛选出适用于流式检测的黄色荧光蛋白标记的Annexin A5,为后续研究奠定基础.以pET28a-Annexin A5-EGFP-his重组质粒为模板,利用分子生物学手段又构建了重组质粒pET28a-Annexin A5-Citrine-his、pET28a-Annexin A5-Venus-his、pET28a-Annexin A5-Ypet-his,然后通过Ni柱亲和层析纯化获得了这三种蛋白,纯度约为90％.该文重点比较了三者检测细胞凋亡的能力,流式细胞仪检测结果显示,Annexin A5-Citrine、Annexin A5-Venus和Annexin A5-Ypet融合蛋白均可以识别和标记凋亡细胞,它们与凋亡细胞的亲和力分别是3 113.0 nmol/L、444.3 nmol/L和391.6 nmol/L.三者与凋亡细胞的亲和力差异很大,通过对Citrine、Venus、Ypet的氨基酸序列进行分析,该文初步发现了决定三个黄色荧光蛋白与凋亡细胞亲和力的关键氨基酸.

通过氨基酸环内酸酐进行开环聚合及Click反应,制备得到新型两亲性糖聚肽——含半乳糖结构单元的聚(Nl苄氧羰基-L-赖氨酸)/聚(L-谷氨酸酯)嵌段聚合物,通过红外光谱、核磁共振氢谱对产物结构进行表征;采用透析法制备糖聚肽纳米粒子,对其临界胶束浓度、粒径分布、表面形貌、生物活性、细胞毒性等进行考察.随后,以糖聚肽为载体包载近红外荧光染料IR780制备诊疗一体化纳米粒子,并对其在肝癌HepG2细胞的靶向摄取、光热疗效及活体成像效果方面进行评价.结果 显示:该实验成功制备出含半乳糖结构单元的聚(N ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)/聚(L-谷氨酸酯)嵌段聚合物;这种糖聚肽在水溶液中的浓度达到0.015 μg/mL时,便可以通过自组装形成粒径大约85 nm的球形粒子.细胞毒性实验(MTT)表明,该纳米粒子具有较好的生物安全性,当其浓度达到500 μg/mL时,HepG2与HUVEC细胞仍保持90％以上的生存率.流式细胞术实验结果表明,以糖聚肽为载体,可高效地将IR780传送到HepG2细胞内,具有肝癌靶向能力;体外光热治疗实验结果证实,在808 nm波长激光照射下,对靶向吞噬诊疗一体纳米粒子的HepG2肝癌细胞具有杀伤作用,而且光热治疗效果与IR780的浓度成正相关,当IR780浓度为10.0 μM时,其治疗效果优于5.OμM时的治疗效果.小动物活体成像实验表明,该诊疗一体化纳米粒子能特异性地聚集在肿瘤部位,经尾静脉注射24 h后仍具有明显的荧光特性.综上可见,该实验合成新型两亲性糖聚肽肝癌靶向诊疗一体化纳米粒子,在肝癌的靶向诊断与治疗中具有广阔的应用前景.

背景:异物反应会导致材料植入失败,近些年来对于免疫学的研究逐渐成为热点,选择具有良好免疫性能的支架材料,对于骨缺损修复具有重要意义.目的:探讨去抗原处理的煅烧马鹿角松质骨及未去抗原处理的马鹿角对骨髓来源M1型巨噬细胞生物行为的影响.方法:经过物理及化学方法制备煅烧马鹿角松质骨,通过X射线光电子能谱、傅里叶变换红外光谱检测材料理化性质,制备2种材料浸提液并检测浸提液中Ca、P、Mg的元素水平.体外诱导培养骨髓来源巨噬细胞并在脂多糖和干扰素γ刺激下极化为M1型巨噬细胞,然后与各组浸提液共培养,对照组用单纯IMDM完全培养基共培养,CCK-8检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞M1型标志物表达率、qPCR检测巨噬细胞相关基因表达水平.结果 与结论:①去抗原马鹿角组Ca、P、Mg元素水平高于马鹿角组;②去抗原马鹿角组和马鹿角组主要官能团为OH-、PO43-、CO32-;③共培养1,3,7 d各组M1型巨噬细胞存活率差异无显著性意义;④共培养1 d时,去抗原马鹿角组细胞表面标志物CD16/32表达率低于对照组;⑤共培养1,3 d时,去抗原马鹿角组促炎因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达明显低于对照组;共培养3 d时,去抗原马鹿角组M2型巨噬细胞主要标记物CD206的表达量明显高于对照组;而在共培养1,3 d时马鹿角组的肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达或与对照组无差异或明显高于对照组,在CD206因子表达方面均与对照组无差异;⑥结果表明,去抗原马鹿角松质骨粉末浸提液可降低M1型巨噬细胞相关促炎因子的表达并促进其向M2型巨噬细胞极化.

目的 建立流式细胞术外周血白细胞分类方法,并验证其分类的可行性.方法 采用CD16-Pacific Blue、CD45-V500、SYTO16、CD7-PE、CD123-PerCP-Cy5.5、CD14-PE-Cy7、CD3+CD19-APC、CD11b-APC-Cy7抗体组合,建立8色流式细胞术白细胞分类方法.收集50例健康体检者乙二胺四乙酸二钾抗凝外周血样本,分别采用全光谱流式细胞仪(流式法)、全自动血液分析仪(仪器法)和显微镜镜检(手工法)3种方法进行白细胞分类计数.采用Passing&Bablok回归对3种方法检测结果进行两两比较.以手工法为参考方法,评价3种方法白细胞分类方法的一致性.结果 成功建立了8色流式细胞术白细胞分类方法.仪器法和流式法的分类结果的回归方程的线性概率值(P)>0.05,2种方法中性粒细胞(NEUT)、淋巴细胞(LYMPH)、单核细胞(MONO)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BASO)项目回归方程的斜率分别为1.01、0.98、0.97、1.00、2.33,截距分别为-1.53、0.90、-0.11、0.01、-0.23.手工法和仪器法白细胞分类结果的回归方程的线性概率值(P)>0.05;手工法和流式法NEUT、LYMPH、MONO、EOS、BASO项目回归方程的斜率分别为0.98、0.94、0.68、0.86、0.50,截距分别为-0.96、2.64、2.74、0.29、0.30;手工法和仪器法NEUT、LYMPH、MONO、EOS、BASO项目回归方程的斜率分别为0.99、0.94、0.76、0.93、0.12,截距分别为-1.13、1.79、2.69、0.25、0.26.以白细胞分类参考方法(手工法)为标准,流式法和仪器法白细胞分类结果均在参考区间内.方法 学比较结果显示,流式法与仪器法的相关性优于流式法与参考方法.结论 成功建立了8色流式细胞术白细胞分类方法.该方法白细胞分类计数结果与参考方法具有相关性,且均在参考区间内.建立的流式法与仪器法的方法学一致性优于参考方法,可进一步提高临床血常规检测中白细胞分类的准确性.

目的 探讨聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰的黑磷纳米片(black phosphorus nanosheets,BPNS)对三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)MDA-MB-231和4T1细胞凋亡的影响及生物学机制.方法 通过液相剥离方法制备BPNS,再经PEG修饰获得BP-PEG.利用透射电子显微镜、动态光散射对BPNS和BP-PEG进行表征.通过紫外-可见吸收光谱及透射电子显微镜评估两者在超纯水中的稳定性.利用乳酸脱氢酶细胞毒性法,检测BP-PEG对鼠源和人源的正常和肿瘤细胞活力的影响;采用γ-H2AX免疫荧光染色检测肿瘤细胞DNA损伤的情况;通过细胞流式术检测细胞凋亡情况;利用JC-1染色检验肿瘤细胞线粒体膜电位变化情况;Western blot检测BP-PEG对Cyt c、Bcl-2和Bax等线粒体凋亡相关蛋白表达水平的影响.结果 BPNS为层状纳米结构,PEG修饰后平均直径和电位略有增加,并且可有效提高BPNS的稳定.BP-PEG浓度为50μg/ml范围内表现出对肿瘤细胞良好的杀伤活性.BP-PEG可造成TNBC细胞DNA损伤并促进细胞凋亡,引起线粒体膜电位Δψm下降,可显著上调Cyt c和Bax并降低Bcl2的表达水平.结论 BP-PEG可通过线粒体凋亡途径有效促进TNBC细胞凋亡,并对正常细胞表现出较好的应用安全性,其可能成为一个潜在的肿瘤治疗药物.