苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)是我国重大农业入侵害虫,对我国果业健康发展造成严重威胁.在利用基因编辑等技术对相关基因进行功能研究时,通常采用单对交配策略对纯合突变体进行筛选.因此,在配对前明确个体基因型,避免对虫体造成损伤尤为重要.本研究分别收集末龄幼虫蜕(10个蜕)和蛹壳(1个、5个、10个、15个蛹壳),通过基因组DNA提取、目的基因PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测和PCR产物测序,以评估该方法作为苹果蠹蛾基因检测的可行性.结果显示,以苹果蠹蛾末龄幼虫10个蜕及5个以上蛹壳提取的基因组DNA作为模板,扩增精巢特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Testis specific serine/threonine protein kinase,TSSK1)基因,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到单一、明亮的条带,经测序证实该产物是目的基因序列.基于高效及节约成本的原则,拟推荐利用10个末龄幼虫蜕或10个蛹壳提取基因组DNA、通过PCR扩增和测序进行苹果蠹蛾的无损伤基因型检测.本研究建立了一种利用幼虫蜕和蛹壳进行苹果蠹蛾无损伤、高效的基因检测方法,为提高苹果蠹蛾基因功能研究的效率奠定了基础.

目的 探讨胡椒碱对白纹伊蚊幼虫的毒性作用,为绿色杀虫剂的研发提供科学基础.方法 采用幼虫浸渍法,观察不同浓度(5、10、20、30 mg/L)胡椒碱处理对白纹伊蚊幼虫生长发育的影响,记录发育异常的幼虫形态、幼虫的化蛹数、羽化数和死亡数,计算化蛹率、羽化率和死亡率.利用不同浓度梯度(5、10、20、25、30mg/L)的胡椒碱处理48 h后观察白纹伊蚊幼虫对应的死亡率,进行回归分析,并计算半数致死浓度(LC50)和95％CI.结果 胡椒碱作用初期,白纹伊蚊幼虫活动正常,1h后发现幼虫活动频率降低,高浓度(20、30 mg/L)胡椒碱处理组的幼虫活跃度较低浓度(5、10mg/L)明显减弱;12h后各浓度组均有幼虫发生死亡,部分幼虫反应迟钝,但用细玻璃棒轻触刺激后可做出逃避反应,并浮出水面;死亡幼虫多数沉于水底,表现为躯干局部发黑,虫体萎缩僵直;部分死亡幼虫浮在水面上,触动后下沉.经胡椒碱处理的存活幼虫化蛹后进入蛹期,部分在蛹期发生死亡,死蛹主要表现出两种形态,蜕皮后尚未形成新表皮的裸蛹和已发生色素沉着的蛹.与空白对照组比较,经不同浓度(5、10、20、30 mg/L)胡椒碱处理的白纹伊蚊幼虫化蛹率(x2=25.185、63.602、241.359、322.105)和羽化率(x2=5.046、14.203、68.629)均依次显著降低,死亡率依次显著升高(x2=37.600、84.050、272.046、291.256),差异均有统计学意义(P均＜0.001).胡椒碱对白纹伊蚊4龄幼虫的LC50为10.068 mg/L,95％CI为6.108～13.930 mg/L,毒力回归曲线方程y=3.301x-3.310.结论 胡椒碱对白纹伊蚊幼虫具有毒性作用,通过影响化蛹和羽化这两个发育关键环节达到杀灭效果,可作为潜在的白纹伊蚊绿色杀虫剂.

为明确朝天椒(品种:BLTY2)叶片饲喂的斜纹夜蛾Spodoptera litura幼虫生长发育受到抑制的关键原因,本研究以人工饲料及牛角椒(品种:FXBX)叶片饲喂的斜纹夜蛾幼虫为对照,通过比较3种食料饲喂后斜纹夜蛾幼虫相关生理生化指标的变化,分析BLTY2辣椒叶片饲喂所致的斜纹夜蛾幼虫生长发育异常的原因.结果表明,朝天椒辣椒叶片饲喂的斜纹夜蛾幼虫生长发育速率滞后于牛角椒辣椒叶片及人工饲料饲喂的斜纹夜蛾幼虫,且每头幼虫的发育时长均显著延长(P＜0.05).饲喂后第1天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天,饲喂BLTY2辣椒叶片的斜纹夜蛾幼虫体内保幼激素(JH)含量均显著高于其他2种食料饲喂的斜纹夜蛾幼虫(P＜0.05).饲喂后第3天、第4天、第5天和第7天,饲喂BLTY 2辣椒叶片的斜纹夜蛾幼虫体内蜕皮激素(Ecd)含量均显著高于其他2种食料饲喂的斜纹夜蛾幼虫(P＜0.05).3种食料饲喂后斜纹夜蛾幼虫体内的几丁质酶(CHT)活性变化差异较大,而2种辣椒叶片饲喂后斜纹夜蛾幼虫体内的组织蛋白酶(CTS)活性变化趋势相似,且不同于人工饲料饲喂的斜纹夜蛾幼虫体内的CTS活性变化趋势.由此可见,BLTY2辣椒主要干扰斜纹夜蛾幼虫体内JH与Ecd的含量抑制其生长发育.本研究结果可为筛选具有抗虫活性的植物次生代谢物质奠定基础.

几丁质酶是降解几丁质的糖苷水解酶,参与昆虫蜕皮、器官发育、免疫等重要生理过程.目前,寄生蜂等膜翅目昆虫中几丁质酶的鉴定以及功能研究仍较少.本研究基于生物信息学分析,在丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis基因组中鉴定到14个几丁质酶基因,氨基酸个数介于312～2 682之间.系统进化分析表明丽蝇蛹集金小蜂几丁质酶分为9个亚家族,其中Group Ⅳ、Ⅶ亚家族可能通过基因串联复制而发生基因家族扩增.qRT-PCR分析结果表明几丁质酶基因的表达具有多样性,其中NvCht1、NvCht5、NvCht6、NvCht7 4个基因在1.5 d幼虫表达量最高,NvCht3在5 d幼虫表达量最高,NvCht8在幼虫期高表达.此外,幼虫组织中的表达分析结果表明NvCht4、NvCht5、NvCht10、NvCht12 在表皮中高表达,NvCht7、NvCht8、NvCht13 在肠道中高表达,NvCht9 在脂肪体和表皮中高表达,NvCht11在唾液腺中高表达.本研究为寄生蜂几丁质酶的进化分析以及功能研究提供理论基础.

蜕皮是许多变态发育昆虫的一种重要生理现象,昆虫通过蜕皮液中的酶对新旧表皮进行分离.已有相关蛋白组学的研究证明,家蚕蜕皮液中具有一种含量丰富的羧肽酶 A(Bombyx mori-carboxypeptidase A,Bm-CPA),目前对其作用功能尚不清楚.为了更好地了解Bm-CPA在家蚕蜕皮发育过程的作用,本研究通过生物信息学分析、实时荧光定量 PCR、抗体制备、免疫荧光染色和毕赤酵母表达等方法对Bm-CPA进行了研究.结果显示,Bm-CPA具有保守的M14 锌羧肽酶结构域和糖基化位点,并且受蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)调控,在眠期和上簇期的表皮中大量表达;免疫荧光染色显示 Bm-CPA 在眠期的表皮中富集,Bm-CPA 抑制剂会导致幼虫因无法蜕皮而死亡;通过毕赤酵母表达系统在体外成功获得大量的重组 Bm-CPA 蛋白.这些结果为深入了解家蚕蜕皮发育过程提供了一定的参考.

小亚璃眼蜱Hyalomma anatolicum属于硬蜱科璃眼蜱属,是一种寄生于动物体表的专性吸血寄生虫,其分布范围广、寄生强度大.该蜱种可传播多种人畜共患病原体,对畜牧业造成巨大损失.为研究媒介蜱生物学特性和吸血期蜱类生理学变化,本研究利用实验室F2 代小亚璃眼蜱进行人工饲养和组织器官切片染色,观察小亚璃眼蜱吸血期组织器官的形态学特征.结果显示,小亚璃眼蜱在实验条件下,从虫卵孵化为幼虫,再通过吸血成为若虫,进而吸血蜕皮为成蜱,共需要 50.0 d.吸血期小亚璃眼蜱雌蜱苏木精伊红染色(HE染色)组织切片显示,随着雌蜱从半饱血至饱血状态,唾液腺细胞逐渐溶解消失,中肠腔内消化产生的血红素转移至中肠基底层和血淋巴中,然而卵巢组织并未出现明显变化.本研究首次观察了吸血期小亚璃眼蜱组织器官的变化,丰富了该蜱的生物学特性和组织学形态资料.

microRNA(miRNA)是一类长度约为23个核苷酸的非编码内源性小分子RNA,参与真核生物基因表达的调控,从而在生物发育和应对环境中起着重要的作用.为了探讨novel miRNA在害虫发育中的作用,本研究对斜纹夜蛾Spodoptera litura miRNA数据库中表达量较高的novel-m0287-3p进行了研究.通过生物信息学分析,确定了novel-m0287-3p是一个新的miRNA,并预测其可能靶向蜕皮激素受体EcRbl,表明novel-m0287-3p可能参与斜纹夜蛾发育的调控.双荧光素酶实验表明,novel-m0287-3p分别结合于EcRb13'非编码区的2个位点上.实时荧光PCR结果显示novel-m0287-3p和EcRb1均在斜纹夜蛾的中肠中表达.为了进一步揭示novel-m0287-3p对EcRb1表达的调控以及对幼虫发育的影响,本研究进行了体内实验.将novel-m0287-3p的模拟体类似物注射入斜纹夜蛾幼虫,结果显示斜纹夜蛾体内EcRb1的mRNA水平发生了下调,证明novel-m0287-3p能够抑制幼虫EcRb1的表达.向4龄第1天的斜纹夜蛾幼虫注射novel-m0287-3p后,幼虫的生长受到抑制;而注射斜纹夜蛾6龄幼虫则导致其化蛹滞后.研究结果表明,novel-m0287-3p可通过调控蜕皮激素受体EcRb1的表达,从而影响斜纹夜蛾的生长发育.

目的 鉴定粪类圆线虫感染性Ⅲ期幼虫(iL3)和寄生性雌虫(pF)的微小RNA(miRNA),分析差异表达miRNA及其靶基因的功能.方法 从粪类圆线虫感染犬粪便中收集iL3.取4 000～5 000条iL3于颈后皮下注射感染健康犬,感染后21 d,从肠道中采集pF.提取iL3和pF的总RNA并测序.测序数据与粪类圆线虫基因组和鼠类圆线虫miRNA比对筛选保守的miRNA,用miRDeep2通过颈环结构分析、成熟序列比对筛选miRNA.分析iL3和pF的miRNA表达谱,筛选差异表达miRNA,预测差异表达miRNA的靶基因,对log2(差异倍数)＞1和每百万转录本上的读数(TPM)＞1 000的未注释miRNA的靶基因功能进行分析.用ClusterProfiler对差异表达miRNA靶基因进行GO富集分析.选取11个未注释或保守的差异表达miRNA进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证,以粪类圆线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GenBank登录号:BI773092.1)为参照基因,计算差异表达miRNA的相对转录水平.结果 共鉴定出265个miRNA,包括130个保守的miRNA和135个未注释的miRNA.其中,134个miRNA在iL3和pF之间差异表达(包含77个保守的miRNA和57个未注释的miRNA),251个为iL3和pF所共有,10个为iL3特有,4个为pF特有.差异表达miRNA靶基因预测结果显示,57个未注释的miRNA中,有12个差异倍数＞2且TPM＞1 000,有248个靶基因与秀丽隐杆线虫同源,其中35.08％(87/248)的靶基因与发育相关,其余与应激、运动和蜕皮等相关.大部分在pF高表达未注释的miRNA靶向SSTP_0000114700.差异表达miRNA靶基因的GO分析结果显示,共5 595个靶基因被富集,其中富集靶基因数居前5位的分别为膜组成成分(1821个)、核酸结合(561个)、细胞核(450个)、蛋白质水解作用(365个)和信号传导(284个).qRT-PCR验证结果显示,sst-miR-86-5p、sst-84-5p、sst-novel-104、sst-miR-92-3p、sst-miR-34a-3p、sst-miR-81a-5p、sst-miR-1-3p、sst-novel-108、sst-miR-124-5p、sst-miR-50-3p、sst-novel-51 的 log2(差异倍数)分别为-2.13、6.39、4.46、-3.69、-3.69、2.34、-2.48、-2.41、-2.30、2.25、-3.32,转录组分析获得的 log2(差异倍数)分别为-3.05、4.98、4.07、-4.9、-3.66、0.98、-3.79、-2.61、-0.99、0.63、-1.55.qRT-PCR与转录组分析获得的上调、下调趋势结果一致.结论 获得粪类圆线虫感染性Ⅲ期幼虫和寄生性雌虫的miRNA表达谱和差异表达miRNA,差异表达miRNA与粪类圆线虫的生长发育和繁殖功能相关.

[目的]本研究旨在解析ATP合酶亚基α(ATP synthase subunit α,ATPs-α)在棉铃虫Helicoverpa armigera变态和发育中的功能机理.[方法]PCR扩增棉铃虫ATPs-α基因开放阅读框,并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR检测HaATPs-α在棉铃虫5龄蜕皮期和6龄第1-5天幼虫表皮、中肠和脂肪体中及外源20-羟蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)(0.1 mg/mL)处理后6龄幼虫表皮和脂肪体中的表达量;对棉铃虫6龄幼虫注射dsHaATPs-α,分析RNAi降低HaATPs-α的表达量对幼虫发育及变态及其体内ATP含量、海藻糖和葡萄糖含量以及海藻糖酶活性的影响.[结果]棉铃虫HaATPs-α的开放阅读框长1 677 bp,棉铃虫、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda、斜纹夜蛾S.litura和粉纹夜蛾Trichoplusiani这4种鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)昆虫的ATPs-α氨基酸序列一致性为96.56％,且亲缘关系较近.表达模式分析结果显示,HaATPs-α在6龄第3天幼虫表皮和中肠中表达量最高,在5龄蜕皮期脂肪体中出现表达高峰;20E(0.1 mg/mL)处理较对照显著上调6龄幼虫中HaATPs-α的表达量.与对照组(注射dsGFP)相比,利用RNNAi敲低HaATPs-α表达量后,幼虫发育迟缓,幼虫体重显著下降,幼虫死亡率显著升高,化蛹率和成虫羽化率显著降低,ATP含量和海藻糖酶活性均显著降低,海藻糖含量显著升高,葡萄糖含量显著降低.[结论]HaATPs-α不仅控制棉铃虫ATP的产量,同时还影响着海藻糖和葡萄糖的含量,因此,HaATPs-α在幼虫变态中发挥着重要作用.本研究结果还可为将来利用ATPs-α作为有害生物防控的新靶标提供实验证据和理论依据.

[目的]雌激素雌二醇(E2)在脊椎动物中通过雌激素受体(ER)调节脊椎动物的生长发育和繁殖.昆虫中并没有ER,但有研究显示某些昆虫能对E2产生一定的应答.本研究在明确E2能影响家蚕Bombyx mori卵黄原蛋白基因(BmVg)表达的前提下,分析其对这一基因表达的调控机制.[方法]取BmVg高量表达时的家蚕雌性幼虫(上蔟后60 h)脂肪体,用不同浓度(0.001,0.05,0.5,5和50 nmol/L) E2处理后,通过qRT-PCR检测BmVg表达的变化,分析家蚕对E2的应答;克隆家蚕蜕皮激素受体基因(BmEcRB1),构建原核表达载体,表达并纯化BmEcRB1蛋白后与E2体外孵育,通过微量热泳动仪(MST)分析E2与BmEcRB1的结合情况.[结果]不同浓度E2均显著抑制离体培养的雌蚕脂肪体中BmVg基因的表达.MST实验证实,E2与BmEcRB1具有一定的亲和力,解离常数(Kd)为77.8±22 μmol/L.[结论]结果说明,E2对BmVg表达的影响是通过与蜕皮激素(20E)竞争性结合BmEcRB1实现的.