目的:观察CD36在肝细胞癌组织和细胞株中的表达水平，探讨CD36对人肝细胞癌细胞株增殖、迁移能力及人肝癌细胞异种移植裸鼠模型的影响。方法:基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库相关信息分析371份肝细胞癌及癌旁组织中CD36转录本表达水平差异。前瞻性收集2019年1月至2021年2月就诊于扬州大学附属医院行手术治疗的48例肝细胞癌患者癌组织及相应的癌旁组织，采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测组织中CD36 mRNA水平。采用蛋白质印迹法检测人肝癌细胞株Huh7、HCCLM3及人正常肝细胞株LO2中CD36蛋白水平。将载有CD36干扰序列的质粒和空质粒转染到Huh7细胞或HCCLM3细胞，分别为sh-CD36组和对照组；采用CCK-8法检测培养0、12、24、36、48、60 h各组细胞的增殖能力（以吸光度值表示），采用划痕愈合实验、Transwell实验检测各组细胞迁移能力。将sh-CD36组或对照组Huh7细胞注射于BALB/c裸鼠腋窝皮下，每组4只，构建人肝癌异种移植裸鼠模型；接种1周后每周测量肿瘤长径、短径并计算肿瘤体积，接种5周后处死裸鼠，收集肿瘤标本并称量质量；显微镜下观察肿瘤组织细胞形态，采用免疫组织化学法检测肿瘤组织中CD36、Ki-67蛋白表达情况。结果:对TCGA数据库数据分析显示，肝癌组织中CD36转录本水平较癌旁组织高（4.2±1.8比3.2±1.5， t＝2.28， P＝0.035）。qRT-PCR法对48例肝细胞癌患者组织检测显示，肝癌组织中CD36 mRNA相对表达量高于癌旁组织（0.76±0.26比0.48±0.23， t＝3.52， P<0.001）。蛋白质印迹法检测显示，Huh7、HCCLM3细胞中CD36蛋白水平均高于LO2细胞，分别为LO2细胞的（1.42±0.11）倍和（1.68±0.16）倍（均 P<0.001）。在mRNA及蛋白水平上，sh-CD36组Huh7和HCCLM3细胞CD36均低于对应的对照组（均 P<0.001）。CCK-8法检测显示，sh-CD36组Huh7细胞和HCCLM3细胞分别于培养36 h和24 h开始增殖能力均低于对应的对照组（均 P<0.01）。划痕愈合实验显示，培养48 h的sh-CD36组Huh7细胞[（12±3）%比（30±5）%， t＝4.01， P<0.001]和HCCLM3细胞划痕愈合率[（15±4）%比（29±5）%， t＝4.16， P<0.001]均低于对应的对照组；Transwell实验显示，sh-CD36组Huh7细胞[（46±6）个/视野比（88±6）个/视野， t＝5.56， P<0.001]及HCCLM3细胞24 h穿膜细胞数[（42±5）个/视野比（82±7）个/视野， t＝5.34， P<0.001]均少于对应的对照组。皮下注射5周后，注射sh-CD36组Huh7细胞的裸鼠肿瘤体积[（682±268）mm 3比（1 375±512）mm 3， t＝4.73， P＝0.006]和肿瘤质量[（432±95）mg/只比（871±109）mg/只， t＝6.57， P<0.001]均低于注射对照组Huh7细胞的裸鼠；显微镜下观察，注射sh-CD36组Huh7细胞的裸鼠移植瘤标本中肿瘤细胞密度低于注射对照组Huh7细胞的裸鼠，CD36和Ki-67蛋白的表达水平亦均低。 结论:CD36在肝细胞癌患者癌组织及人肝癌Huh7、HCCLM3细胞株中表达均上调，其可能与肝癌细胞增殖和迁移相关。敲低CD36表达体外可明显抑制肝癌细胞增殖和迁移能力，对人肝癌细胞异种移植裸鼠模型肿瘤有抑制作用。

目的:探索开发一种靶向CLL-1的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）并验证其功能。方法:通过流式细胞术检测急性髓系白血病（AML）细胞系和AML原代细胞CLL-1靶点的表达水平。构建CLL-1 CAR载体并制备出相应慢病毒，感染激活后T细胞生产出CAR-T细胞，并通过体外和体内实验验证CLL-1 CAR-T细胞的功能。结果:AML细胞系和原代AML细胞中均表达CLL-1。制备的CLL-1 CAR-T细胞转导率为77.82%，在AML细胞系以及AML原代细胞中，CLL-1 CAR-T细胞能明显特异性杀伤表达CLL-1的靶细胞系和原代肿瘤细胞。相对于未转导的T细胞，CLL-1 CAR-T细胞在杀伤靶细胞和原代肿瘤细胞时分泌IL-6、IFN-γ等细胞因子水平更高（ P值均<0.001）。在AML人源性异种移植小鼠模型中，相对于未转导的T细胞，CLL-1 CAR-T细胞表现出有效的抗白血病活性并延长小鼠存活时间[未达到对22（95% CI 19~24）d， P=0.002]。 结论:靶向CLL-1的CAR-T细胞成功开发并具有较好的肿瘤杀伤作用。

目的:探讨凋亡抑制因子5(BIRC5)能否促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)对早期激素性股骨头坏死(SONFH)的修复。方法:采用SD大鼠分离培养BMSCs，BIRC5慢病毒转染BMSCs，完全随机分3组：空白对照、阴性病毒、BIRC5转染；采用BMSCs与异种脱抗原松质骨(XACB)构建组织工程骨移植治疗早期SONFH，实验完全随机分五组：单纯钻孔减压、XACB、XACB/BMSCs、XACB/BMSCs/绿色荧光蛋白(Lv-GFP)、XACB/BMSCs/Lv-BIRC5/GFP。小动物成像仪检测BMSCs存活情况；术后4、8、12周，微型CT(Micro-CT)评估骨坏死修复效果；采用单因素方差分析(ANOVA)分析数据。结果:BIRC5转染组的BIRC5 mRNA相对表达量高于阴性病毒组及空白对照组(7.623±0.127比3.367±0.135比3.227±0.156， F＝957.483， P<0.05)，BIRC5转染组的BIRC5蛋白相对表达量高于阴性病毒组及空白对照组(1.263±0.038比0.393±0.015比0.417±0.031， F＝850.551， P<0.05)。XACB具有良好的生物相容性，BMSCs可在XACB表面正常生长。术后第3天，XACB/BMSCs/Lv-BIRC5/GFP组荧光强度值高于XACB/BMSCs/Lv-GFP组及XACB/BMSCs组(0.874±0.066比0.536±0.054比0.557±0.081， F＝23.234， P<0.05)。在术后12周时，XACB/BMSCs/Lv-BIRC5/GFP组骨小梁数目高于XACB/BMSCs/Lv-GFP组及XACB/BMSCs组[(3.873±0.176)/mm比(2.763±0.140)/mm比(2.775±0.184)/mm， F＝294.717， P<0.05)，XACB/BMSCs/Lv-BIRC5/GFP组骨小梁结构完整，可见成熟骨组织散在分布，骨坏死区完全修复。 结论:BIRC5可促进BMSCs在坏死区的存活，增强BMSCs对早期SONFH的修复。

目的:建立儿童肝母细胞瘤人源性异种移植（PDX）小鼠模型，并对建模成功的PDX肿瘤与患儿的原代肿瘤生物学一致性进行比较，同时比较分析影响PDX模型建模成功的关键因素。方法:通过对39例肝母细胞瘤患儿的新鲜肿瘤组织样本进行PDX小鼠模型的构建，详细记录建模的肿瘤生长时间及体积大小，同时收集39例患儿的临床资料，对实验数据及临床数据进行分析。不同参数的成瘤率差异分析采用 χ2检验(分类变量)，正态分布的连续变量比较应用 t检验。 结果:经过传代及病理诊断确认成功构建21例肝母细胞瘤PDX模型，成功率53.8%（21/39）。建模成功的PDX模型各代次肿瘤样本的病理结果与相应原代肿瘤一致。影响PDX成瘤率主要因素分析显示，原代肿瘤的转移瘤建模成功率高于肝脏原位肿瘤的成功率（7/8比14/31， P = 0.049）；而病理分型对成瘤率无显著性差异。按照原发肿瘤及转移肿瘤的PDX成瘤组比较，2组在成瘤时间及成瘤体积差异均无统计学意义。肝母细胞瘤的PDX小鼠模型移植瘤组织苏木精-伊红染色与原代肿瘤一致；肝细胞抗原（Hepatocyte）、磷脂酰肌醇聚糖3、β-连环蛋白和甲胎蛋白4种蛋白在原代肿瘤组织与PDX小鼠模型的免疫组化的阳性率分别为100%比100%、100%比95.24%、100%比100%、95.24%比85.71%。 结论:成功建立了儿童肝母细胞瘤PDX小鼠模型，成瘤率较高，转移肿瘤成瘤率高于原发肿瘤，而且移植瘤保持了原代肿瘤的生物学特点。

目的 制备水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)收获物,纯化后免疫日本大耳白兔,制备VZV抗血清,并进行各项检定.方法 将VZV Oka株(vOka)在人二倍体细胞2BS株中传代培养,病毒收获后经超速离心纯化,制备免疫原,与弗式佐剂混合后经背部多点注射免疫雌性日本大耳白兔5只,制备VZV抗血清.Western blot检测血清抗体的特异性;测定膜抗原荧光抗体(fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA)效价和血清抗体中和效价,并对两种检测方法的结果进行相关性分析.利用抗体效价较高的血清对麻疹、腮腺炎和风疹病毒进行异种病毒干扰试验.结果 制备的VZV抗血清可特异性结合vOka和Oka-7S病毒收获物及gE和ORF7蛋白等多种VZV抗原;3免血清FAMA抗体效价可达1∶16 384,血清抗体中和效价达1∶256;根据Karl Pearson相关系数分析得出两种检测方法结果呈线性相关.异种病毒干扰试验中试验组与对照组病毒滴度差值均＜0.50 lgCCID50/mL,表明VZV抗血清对麻疹、腮腺炎和风疹病毒滴度均无干扰.结论 成功制备了特异性强,亲和力高的VZV抗血清,为VZV成分疫苗的检定奠定了基础.

目的:探索不同放疗方式与嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞协同治疗大肿块型淋巴瘤的疗效.方法:建立大肿块型淋巴瘤异种移植小鼠模型,使用低、中、高剂量的X射线对小鼠进行照射,测量照射后各组小鼠肿瘤体积的变化情况.再将低、中、高剂量的X射线分别与CAR-T细胞联用对小鼠进行治疗,记录不同的联用方式治疗后肿瘤体积的变化情况和各组小鼠的生存时间,使用流式细胞术检测各组小鼠外周血和肿瘤内CAR-T细胞占比的差异,观察治疗后各组小鼠的不良反应.结果:单纯X射线治疗无法控制巨块型淋巴瘤小鼠的肿瘤进展,而分别将低、中、高剂量的X射线与CAR-T细胞联用则均能使小鼠的肿瘤体积缩小.与低剂量联合组相比,中、高剂量联合组小鼠的肿瘤体积缩小更显著且未见重新增大的迹象(F组间=1 052.364,F 时间=14 861.095,F交互=49.864,均 P＜0.001;组间均 P＜0.05),此外,中剂量联合组[HR=21.880(3.884～124.600),Log-rank x2=12.090,P＜0.01]和高剂量联合组[HR=21.880(3.884～124.600),Log-rankx2=12.090,P＜0.01]小鼠生存期也均明显延长.中、高剂量X射线可能更利于CAR-T细胞的瘤内浸润,与低剂量联合组相比,中(t=28.200,P＜0.05)、高(t=23.960,P＜0.05)剂量联合组在治疗后第14天的瘤内CAR-T细胞比例均明显增加.不同联用方式的不良反应大多在可耐受范围内.结论:与低剂量X射线相比,中、高剂量X射线能与CD19 CAR-T细胞协同更有效地治疗大肿块型淋巴瘤.

目的 基于衔接蛋白DAP12 的多链嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)开发靶向 CD30 的 CAR-T 细胞药物,研究CD30 CAR-T对霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞的体外和体内临床前药效.方法 通过基因合成和分子克隆技术,设计构建靶向CD30 的CAR质粒,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染T细胞,其中靶向 CD30 的多链 CAR-T 为 CD30-KIRS2/Dap12-BB组,单链二代CAR-T为CD30-41BBζ组,未做病毒侵染的T细胞为NTD组,利用流式细胞术检测CAR阳性率情况,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放检测细胞的杀伤活性,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子干扰素γ(IFN-γ)的分泌水平,进一步通过小鼠异种移植瘤模型检测CD30 CAR-T在小鼠体内抗肿瘤活性.结果 靶向CD30 的多链CAR-T和单链二代 CAR-T进行对比,研究发现多链CAR-T与单链 CAR-T 的杀瘤作用相似.但值得注意的是,多链CAR-T 的IFN-γ 分泌水平更高(P<0.001).更重要的是,在小鼠的肿瘤模型实验中,多链 CAR-T 实现了肿瘤的完全消退.结论 靶向CD30 的多链CAR-T在抗肿瘤活性方面优于传统单链CAR-T.

目的 探讨野生型(WT)、四基因修饰(TKO/hCD55)和六基因修饰(TKO/hCD55/hCD46/hTBM)猪红细胞与人血清的免疫相容性和免疫差异.方法 收集20名不同血型志愿者的血液,将WT、TKO/hCD55 和 TKO/hCD55/hCD46/hTBM 猪红细胞、ABO-相容(ABO-C)及 ABO-不相容(ABO-Ⅰ)人红细胞分别暴露于不同血型人血清中,检测血凝集、抗原抗体结合(IgG、IgM)水平和补体依赖细胞毒性,评估2种基因修饰猪红细胞与人血清的免疫相容性.结果 ABO-C组未出现明显凝集;WT组和ABO-Ⅰ组凝集水平高于TKO/hCD55组和TKO/hCD55/hCD46/hTBM组(均为P＜0.001).WT组猪红细胞裂解水平高于ABO-C组、TKO/hCD55 组和 TKO/hCD55/hCD46/hTBM 组;ABO-Ⅰ 组猪红细胞裂解水平高于 TKO/hCD55 组、TKO/hCD55/hCD46/hTBM组(均为P＜0.01).TKO/hCD55组猪红细胞IgM和IgG结合水平均低于WT组和ABO-Ⅰ组;TKO/hCD55/hCD46/hTBM组猪红细胞IgG和IgM结合水平低于WT组,IgG低于ABO-Ⅰ组(均为P＜0.05).结论 基因修饰猪红细胞的免疫相容性优于野生型猪,并接近于ABO-C,人源化猪红细胞在血资源奇缺时可考虑作为血液来源.

重症肌无力(MG)的动物模型研究成为当前关注的焦点.不同的MG实验模型在一定程度上反映了MG的多样性,但由于其各自的局限性,尚不能在一种模型中模拟MG的所有特征.实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)模型涵盖了参与抗乙酰胆碱受体免疫反应的关键细胞机制,为理解MG的免疫学特征提供了基础.被动转移模型的特点是疾病诱导简单,在单次注射抗体后24 h内迅速出现虚弱症状.基因工程的优势在于更具有特异性,能够更准确地模拟MG的遗传基础,弥补了EAMG模型的不足.药物诱导模型具有建模迅速、不涉及复杂免疫激活和抗原诱导的特性,然而,其在模拟疾病复杂性方面存在一定局限.体外模型对患者血清的表型和功能反应进行匹配,该模型能够更直观地观察异种细胞在疾病发展中的作用,更贴近临床实际.该综述总结了各种实验模型的优缺点,帮助研究者选择适用于不同研究目的的模型.为推动对该疾病复杂机制的深入理解提供方向,并为新的治疗策略的制定提供科学依据.

目的 异种器官移植是解决人类器官供体短缺的有效途径,但其面临严重的免疫排斥反应,包括血型差异导致的超急性排斥反应.建立稳定、便捷、可靠的猪血型鉴定方法,可快速筛选合适血型的供体猪用于异种器官移植研究.方法 选择版纳微型猪近交系、滇南小耳猪、巴马香猪为研究对象,用DNA提取试剂盒提取3种品系猪的血液、口腔颊黏膜和胎儿成纤维细胞中DNA,通过PCR法对猪ABO血型同源基因EAA第7号内含子附近的目标片段进行扩增.采用血液凝集反应检测猪前腔静脉全血加入抗A、B抗体后的溶血现象,采用免疫组织化学法检测猪心、肝、脾、肺、肾组织中A抗原表达水平,采用免疫荧光法检测猪口腔黏膜中A抗原表达水平.通过对比不同方法测定猪血型的结果,验证PCR方法的稳定性和可靠性,以此建立一种基于PCR的便捷式猪血型鉴定方法.结果 首先,69头版纳微型猪近交系、7头滇南小耳猪和34头巴马香猪的血液PCR结果显示AO血型20头,AA血型66头,OO血型24头.47头滇南小耳猪的胎儿成纤维细胞PCR结果显示47个胎儿均为OO血型,其中8头基因编辑克隆猪的口腔黏膜PCR结果与供体胎儿成纤维细胞的PCR结果一致,均为OO血型;8头野生型猪(2头版纳微型猪近交系、4头滇南小耳猪和2头巴马香猪)的口腔黏膜PCR结果均与血液PCR鉴定结果一致.然后,从中随机挑选11头版纳微型猪近交系、4头滇南小耳猪和2头巴马香猪进行血液凝集反应验证,结果均与血液及口腔黏膜PCR鉴定结果一致.而且,对1头版纳微型猪近交系和2头巴马香猪的心、肝、肺、肾、脾组织进行免疫组织化学分析,结果与血液PCR鉴定和血液凝集反应结果相一致.最后,采集其中2头版纳微型猪近交系和1头巴马香猪的口腔黏膜样本进行免疫荧光检测,结果与血液PCR鉴定结果一致.结论 通过采集胎儿细胞和活体猪的口腔黏膜样本进行PCR检测,可准确、高效地鉴定出猪的血型,为异种器官移植供体猪的血型筛选提供了一种简便方法.