目的 建立PCR-RFLP法鉴别浙贝母及其混淆品湖北贝母.方法 对比两者叶绿体ycfl基因,选择湖北贝母的特异性酶切位点EcoRI设计引物,优化反应条件,并进行方法学考察.结果 退火温度 58℃、循环数 35 时,湖北贝母或掺有湖北贝母的浙贝母经特异性引物扩增后能被EcoRI酶酶切,200～400 bp处检出 2 条单一DNA条带,而浙贝母无此条带,检出限达 3%.结论 该方法方便快捷、灵敏度高,可用于浙贝母、湖北贝母及前者掺混后者的快速检测,为浙贝母质量控制提供参考.

川牛膝的主要混淆品为同属植物头花杯苋的根,研究报道其在性味和药理活性上存有明显差异,仅可作为地方习惯用药,不得代替川牛膝入药.但因头花杯苋外观形态上与川牛膝十分相似,且杯苋甾酮含量也能达到现行药典限量,导致市场上多以冒充或掺混形式出售,这严重地影响了川牛膝的临床用药安全和道地药材开发.鉴于此,该文采用HPLC特征指纹图谱技术试图揭示川牛膝、混淆品头花杯苋、掺混川牛膝在多组分下的化学特征成分差异,以期为川牛膝区别用药和真伪鉴别提供有力支撑.通过测得川牛膝及其混淆品、掺混品色谱图,得出65个不同组分,以建立26×65的峰面积数据矩阵,并进行特征峰差异分析、相似度分析、聚类分析和主成分分析.特征峰差异分析得出头花杯苋及其掺混品特征峰较川牛膝多且响应值高,筛选出的9个特征峰用以鉴别伪品头花杯苋,其中2个可用以鉴别出掺混5％川牛膝,且9个特征峰的光谱图大多类似于皂苷类成分的末端吸收光谱图,表明头花杯苋可能含有大量皂苷类成分.以建立的川牛膝特征指纹图谱为参照,相似度分析得出川牛膝相似度均大于0.942,而头花杯苋、掺混川牛膝相似度分别小于0.383,0.399.聚类分析树状图和主成分得分三维图均能将川牛膝、头花杯苋、掺混川牛膝明显的分为3类.以上研究结果均表明川牛膝、头花杯苋、掺混川牛膝在化学组分上表现出明显的差异,当区别用药,不可混昆淆.

目的:该研究拟通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应方法(PCR-RFLP)建立一种能快速鉴别当归药材及饮片中掺伪欧当归的方法.方法:通过比对当归和欧当归的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列酶切位点,选择欧当归的特异性酶切位点Fnu4H I,并设计PCR-RFLP反应引物,对影响PCR-RFLP反应的退火温度、引物浓度、循环数和酶切时间等条件进行优化,并对该方法的准确性进行了考察.另外,利用建立的PCR-RFLP鉴别方法对掺伪不同比例和不同来源的当归掺伪样品进行了适用性考察.结果:建立了当归药材及饮片中掺伪欧当归的PCR-RFLP鉴别方法,在退火温度63℃,循环数为30时,掺有欧当归的当归样品经过特异性引物扩增后,能被Fnu4H I限制性内切酶酶切,在100～500 bp检出2条单一DNA条带,当归样品则无此条带.该方法对当归中掺入欧当归的检出限为3％,可用于日常当归中掺混欧当归的检测.结论:建立的PCR-RFLP鉴别方法能够灵敏、准确地检测当归药材及饮片中是否掺有欧当归,可为当归的质量控制提供检验依据,以保障其临床用药安全.

目的:由于中药材传统真伪鉴别方法的局限性,本研究拟通过位点特异性聚合酶链式反应(PCR)建立一种能够快速鉴别桃仁中掺有苦杏仁的方法.方法:通过比对苦杏仁与桃仁的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)基因序列,寻找单核苷酸多态性(SNP)位点并设计特异性鉴别引物.利用不同的苦杏仁和桃仁样品进行PCR扩增,对影响PCR反应体系的退火温度、引物浓度、循环数等条件进行优化,并对该方法的专属性和检出限进行了考察.另外,利用建立的PCR鉴别方法对不同来源和不同产地桃仁中掺有不同比例苦杏仁的样品进行检测,以验证该方法的稳定性和准确性.结果:建立了桃仁中掺混苦杏仁的特异性PCR鉴别方法,在退火温度63℃和引物循环数30个时仅有苦杏仁能扩增得到432 bp的特异性条带,桃仁样品则无此条带.该方法对苦杏仁的最低检出限为0.2 ng,其对桃仁中掺入苦杏仁的检出限为1％,可用于日常桃仁中掺混苦杏仁的检测.结论:建立的位点特异性PCR方法能够准确地检测桃仁中是否掺有苦杏仁,可为桃仁的质量控制提供实验依据,以保障其临床用药安全.

目的 探究多重连接探针扩增技术(MLPA)结合熔解曲线在五味子和南五味子鉴别中的应用.方法 以五味子和南五味子为研究对象,基于其ITS2序列设计探针进行MLPA反应,通过分析荧光熔解曲线的Tm值对二者进行鉴别,并将此方法应用到市场随机收集的31份五味子和南五味子商品中,通过对聚合酶链反应(PCR)产物测序验证此方法的准确性.结果 两对探针都表现出很好的特异性和灵敏度,均只出现对应的单一熔解曲线峰,五味子产生82.3℃的熔解曲线峰,南五味子产生80.7℃的熔解曲线峰.31份五味子商品中,16份商品的熔解曲线Tm值与五味子吻合,15份商品的熔解曲线Tm值与南五味子吻合,实验结果与测序结果一致.结论 该研究建立的方法特异性强,灵敏度高,且操作简单方便,可以快速鉴别五味子及其掺混品.

目的 基于多重连接探针扩增技术(MLPA)建立一种中药材半夏与其常见伪品虎掌、滴水珠的分子鉴定方法,为半夏药材质量控制提供依据.方法 从Genbank数据库下载半夏属核基因组内转录间隔区(ITS)序列,利用MEGA 6.05版软件进行序列比对,依据半夏、虎掌及滴水珠ITS序列中的单核苷酸多态性(SNP)位点设计物种特异性MLPA探针,MLPA反应后采用熔解曲线法对扩增产物进行分析.结果 半夏、虎掌和滴水珠样品DNA与物种特异性MLPA探针可分别产生位于84.84,82.76及80.14℃的单一熔解峰,表明探针具有良好特异性;构建的探针体系可对0.1 ng模板DNA进行检测,并可有效检出半夏中掺混1％的虎掌或滴水珠样品.对市场收集样品进行检测,鉴别结果准确,灵敏度高.结论 该研究建立的多重连接探针扩增方法可准确鉴别半夏和虎掌、滴水珠,具有特异性强、灵敏度高等特点,可为半夏药材质量控制提供技术支持.

目的 采用分子生物学技术鉴别鸡血藤及其常见3种混伪品.方法 根据4个物种核基因组内转录间隔区2(ITS2)序列差异设计特异性探针,结合运用多重连接探针扩增(MLPA)技术与高分辨熔解(HRM)曲线技术,根据特异性探针熔解温度(Tm)差异鉴别鸡血藤及其常见混伪品大血藤、白花油麻藤、香花鸡血藤.结果 4个物种特异性探针Tm值分别为:鸡血藤(87.0±0.2)℃、大血藤(82.8±0.2)℃、白花油麻藤(85.4±0.2)℃、香花鸡血藤(80.1±0.2)℃.探针特异性考察中,交叉反应与空白组均未产生熔解峰,表明探针具有良好特异性.构建的方法可用于1.0 ng模板DNA的检测,并可有效检出鸡血藤中掺混5％大血藤、白花油麻藤或香花鸡血藤.结论 基于MLPA-HRM技术建立的鸡血藤及其混伪品鉴别方法灵敏度高,特异性强,稳定性好,可有效解决市场上鸡血藤药材植物来源复杂、混伪品难以鉴别的问题.

目的 采用核糖核酸酶H依赖性PCR(rhPCR)扩增结合熔解曲线分析对石菖蒲与藏菖蒲进行快速鉴定及相互掺杂检测.方法 比对分析石菖蒲与藏菖蒲核基因组内转录间隔区2(ITS2)序列,寻找稳定的单核苷酸多态性(SNP)位点设计特异性扩增引物,根据扩增产物熔解温度(Tm)不同进行鉴别,考察引物特异性,筛选最佳混合引物比例,并考察该方法灵敏度、掺混检出限及适用性.结果 设计的特异性引物具有良好特异性,石菖蒲、藏菖蒲扩增产物可分别产生(89.4±0.2)与(87.9±0.2)℃的单一特异性熔解曲线峰.所建立的方法灵敏度高,DNA检出限均为0.1 ng,对石菖蒲和藏菖蒲的掺混检出限均为10％.检测样品28份,其中石菖蒲16份、藏菖蒲12份,检测结果与DNA条形码结果一致.结论 该研究基于RNase H依赖性PCR扩增结合熔解曲线建立的石菖蒲及藏菖蒲鉴别及掺杂检测方法可有效鉴别石菖蒲、藏菖蒲及掺杂样品,有利于石菖蒲药材质量控制.

目的 通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法建立快速鉴别石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲的方法.方法 对石菖蒲和藏菖蒲的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列酶切位点进行比对分析,选择藏菖蒲的特异性酶切位点AluI,设计PCR-RFLP反应引物,对影响PCR-RFLP反应的退火温度、引物浓度、循环数、酶切时间等条件进行优化,对该方法的准确性进行考察.利用建立的PCR-RFLP鉴别方法对不同产地的石菖蒲、藏菖蒲及掺混样品进行适用性考察.结果 建立了石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲的PCR-RFLP鉴别方法,在退火温度60℃、循环数为30时,藏菖蒲或掺有藏菖蒲的石菖蒲样品经过特异性引物扩增后,能被AluI酶酶切,在100～300 bp检出2条单一DNA条带,石菖蒲样品则无此条带.该方法能对石菖蒲药材及饮片中掺混的藏菖蒲进行准确鉴别,并对石菖蒲中掺入藏菖蒲的检出限为3％.结论 建立的PCR-RFLP鉴别方法稳定性好、灵敏度高,可用于石菖蒲与藏菖蒲鉴别及石菖蒲中掺混藏菖蒲的检测,为石菖蒲与藏菖蒲药材的质量控制提供参考.