目的:研制出具有良好缓释性能的依托孕烯（etonogestrel，ENG）/炔雌醇（ethinyl estradiol，EE）复方阴道环，并对其体外释放测定方法学开展研究，确立与实时释放方法具有良好相关性的加速释放方法。方法:以乙烯-醋酸乙烯共聚物（ethylene-vinyl acetate copolymer，EVA）为基质，以热熔挤出法制备ENG/EE复方阴道环，建立基于摇瓶法的体外实时释放测定方法和加速释放测定方法，考察该复方阴道环的体外释放行为及释放机制，并对其实时释放经时过程和加速释放经时过程的相关性进行分析。结果:所得阴道环外观圆整，表面光滑，在优选出的体外实时释放条件（释放介质：200 mL纯水，37 ℃恒温水浴振荡器中60 r/min振摇）中缓慢释药，第21天ENG和EE累计释放量分别为54.39%和46.80%，在优选出的体外加速条件（释放介质：200 mL 0.6%十二烷基硫酸钠水溶液，55 ℃下60 r/min振摇）下药物释放经时过程及其机制与实时释放条件下的拟合结果相关系数均大于0.99。结论:本研究研制的ENG/EE复方阴道环的体外缓释效果显著，所建立的加速释放方法与实时释放方法相关性良好，可供此类阴道环产品的质量评价研究及体外释放研究方法指南的制定提供有益参考。

目的:探究实施精细化操作对注射用紫杉醇（白蛋白结合型）静脉输液配制结局改善的影响及必要性。方法:对注射用紫杉醇（白蛋白结合型）说明书中关于配制方法方面未明确说明的内容进行详细的精细化操作制定。制订的注射用紫杉醇（白蛋白结合型）精细化配制操作主要包含溶媒与药品混匀方法：注射器进针长度，溶媒注入速度，药品等待溶解时状态，翻转药品西林瓶的摇动速度4个具体细节；药品西林瓶中溶解的药液抽出并注入100 ml无菌空0.9%氯化钠注射液瓶中方法：包括药液重新注入100 ml无菌空0.9%氯化钠注射液瓶中的速度，恢复输液瓶内外气压平衡2个具体细节。通过对比精细化操作实施前后，配制药液中泡沫产生的2种情况及配制时间3个指标，评价精细化操作对配制注射用紫杉醇（白蛋白结合型）的实施效果。结果:精细化操作实施前后，药品西林瓶中泡沫产生率从28.57%（10/35）降至12.50%（12/96），差异有统计学意义（ χ2值为4.471， P=0.029）；混匀后的药液从药品西林瓶抽入100 ml无菌空0.9%氯化钠注射液瓶中泡沫产生率从46.15%（6/13）降至9.09%（3/33），差异有统计学意义（ χ2值为8.14， P=0.004）；精细化操作实施后单支药品的配制时间平均降低3.37 min，差异有统计学意义（ t值为79.744， P<0.05）。 结论:注射用紫杉醇（白蛋白结合型）精细化操作的配制方法可操作性强，安全可靠。实施后可有效减少药品西林瓶内及输液瓶内泡沫的产生，改善药物配制稳定性，缩短配制时间，保证患者安全、及时、有效用药。

目的 探究并优化新生小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外原代培养方法,为星形胶质细胞的体外培养提供更优解.方法 为优化小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,取新生3 d的C57BL/6J小鼠大脑皮质组织,去除脑膜和血管,经胰酶消化后离心,加入高糖的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)吹打形成细胞悬液.进一步通过差速贴壁法、十字交叉手摇法以及恒温振摇法进行纯化,将细胞分别以不同培养密度接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中,并通过形态学观察,免疫荧光染色等方法对星形胶质细胞进行纯度鉴定.结果 新生小鼠大脑皮质细胞以5×106个/瓶密度接种效果好,活性高;纯化过程中使用高糖DMEM培养基联合差速贴壁法、十字交叉手摇法及恒温振摇法,星形胶质细胞纯度可达99％.结论 成功建立并优化小鼠大脑皮质星形胶质细胞的原代培养方法.

目的 测定咖啡酸在不同 pH 环境中的平衡溶解度以及油水分配系数,推测其生物药剂学分类系统(BCS)分类;测定咖啡酸片溶出曲线,将相关参数代入大鼠生理药动学(PBPK)模型建模,利用Gastroplus软件预测其大鼠体内外相关性.方法 采用高效液相色谱法定量,色谱柱Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相0.32%冰醋酸溶液-甲醇(70∶30),流速1.0 mL·min-1,检测波长323 nm,柱温25℃,进样体积10 μL.采用摇瓶法和正辛醇-水体系测量咖啡酸在不同pH环境中的平衡溶解度、溶解度体积(DSV)和油水分配系数(P),推测其BCS分类;测定咖啡酸片在水、pH值1.2、pH值4.5和pH值6.8环境中溶出曲线,利用Gastroplus软件分析溶出曲线的Z-Factor值,将相关参数代入大鼠的PBPK模型,模拟大鼠体内药时(PK)曲线,与已知实测PK曲线进行比较,推测其大鼠体内外相关性.结果 咖啡酸在 pH 值1.2、pH 值4.5和 pH 值6.8环境中平衡溶解度为0.676、1.266和4.624 mg·L-1,DSV 为443 787、236 967和64 879 mL,为难溶性药物,且具有较强pH依赖性;咖啡酸在水、pH值1.2、pH值4.5和pH值6.8环境中油水分配系数(P)为4.33(logP=0.64)、28.87(logP=1.46)、19.77(logP=1.30)、0.28(logP=-0.56),推测其具有较高渗透性.软件模拟得到咖啡酸大鼠体内的Cmax为0.358 μg·mL-1,tmax为0.39 h,AUC为0.320 μg·h-1·mL-1,与已知的实测结果Cmax为(0.250±0.037)μg·mL-1、tmax为(0.33±0.12)h、AUC为(0.303±0.024)μg·h-1·mL-1一致,PK曲线基本吻合.结论 咖啡酸为低溶解性、高渗透性的药物,推测其为BCS Ⅱ类药物,其片剂在大鼠中表现出较高的体内外相关性.

目的 研究盐酸米安色林(MIA)的平衡溶解度、表观油水分配系数(Papp)及溶液化学稳定性,并筛选其经鼻黏膜吸收的理想促渗剂,为制备该药鼻腔给药新制剂提供理论依据.方法 采用HPLC法测定MIA的含量及其在不同溶剂中的平衡溶解度;通过摇瓶法测定药物在正辛醇-水及正辛醇-不同pH缓冲液体系中的Papp;在80℃高温下放置,测定MIA在不同pH缓冲液中的降解百分率;以离体羊鼻黏膜为模型,采用Franz扩散池法完成药物体外渗透试验.结果 MIA在不同溶剂中平衡溶解度的大小顺序为:丙二醇＞5％DM-β-CD＞5％HP-β-CD＞1％F68＞PEG400＞5％SBE-β-CD＞水;药物在酸性与中性pH下其平衡溶解度较大,而在碱性pH下很低.在正辛醇-不同pH缓冲液体系中,MIA的Papp随介质pH升高,呈增大趋势;此外,当介质pH＜6.0时,MIA溶液的化学稳定性较差,当pH≥6.0时,其稳定性较好.4种候选促渗剂对MIA经鼻黏膜吸收均有明显促进作用,以5％DM-β-CD的促渗效果最佳.结论 3种β-CD水溶性衍生物均可增加MIA的溶解度;pH值对MIA的平衡溶解度、Papp及溶液化学稳定性均有明显影响;DM-β-CD可能是MIA鼻用制剂的理想增溶剂及促渗剂.

目的 基于质量源于设计(Quality by Design,QbD)理念,开发一种具有较高生物量与较高菌体活力培养特点的大肠埃希菌摇瓶阶段培养工艺.方法 以不同摇瓶配置为考察因素,菌体悬浮液A600值、培养物湿菌重和菌体活力值为培养结果考察指标,采用方差分析分析培养结果以获得具有高生物量和高菌体活力的第3次扩增摇瓶配置.以摇床温度和摇床转速为试验因子进行2因子2水平全因子试验,菌体悬浮液A值为响应值,培养累计时间为变量因素,摇床实时在线温度与摇床设备自测转速为补充变量因素,采用函数型主成分分析(functional principal component analysis,FPCA)方法进行广义回归,拟合生长曲线模型,通过生长曲线模型获得优化后的培养停止时间及培养工艺,对响应值添加随机噪声蒙特卡洛模拟(Monte Carlo simulation,MCS),再次优化获得摇床培养工艺设计空间,选择设计空间中最劣条件作为验证试验设定条件,以不同培养停止时间分阶段进行连续10批次验证试验.结果 第3次扩增摇瓶配置:5L一次性高效摇瓶,大面积透气膜盖.培养工艺设计空间:摇床温度36.5～37.5 ℃,摇床转速220～230 r/min,设计培养停止时间18 h.最劣条件验证试验表明,停止培养时间为16 h时,可获得较高菌体活力值且较低生物量的培养结果,停止培养时间为18 h时,可获得较高水平的生物量及菌体活力值.结论 本研究设计的大肠埃希菌摇瓶阶段培养工艺具有较高生物量及较高菌体活力培养特点,同时可依据此培养工艺适应性调整以满足不同培养需求.

目的:优化蜜环菌菌株M6的发酵工艺及提高其生产效率.方法:以蜜环菌菌株M6为供试菌株,通过摇瓶液体培养,筛选该菌株的最适液体发酵培养基;以摇瓶培养结果为基础,通过多级匀浆制备高活性种子液,进行液体深层发酵,优化发酵条件.结果:筛选出蜜环菌菌株M6最佳液体深层发酵条件为转速150 r/min、接种量5％、溶氧20％及温度28 ℃,在此条件下使用液体发酵培养基配方1发酵180 h所得蜜环菌菌株M6生物量干重高达18.39 g/L;使用液体发酵培养基2发酵120 h所得蜜环菌菌株M6生物量干重达23.83 g/L.结论:液体培养条件优化后,蜜环菌菌株M6生物量产出较高.本研究促进了蜜环菌菌株M6的快速生产,为应用于天麻种植业提供了技术参考.

目的 比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域(receptor binding domain,RBD)、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响.方法 选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体(R319-K537串联)3种蛋白的基因序列,按照N-端信号肽序列不同[内源(Endo)、蜂素honeybee melittin(HBM)、GP64、GP67、几丁质酶chitinase(Chi)、HIV-ENV]和C-端标签序列的不同,分为25组.通过Bac-to-Bac系统构建25种重组杆状病毒,建立25组三级毒种库.将B2和C4病毒分别接种至对数生长前期细胞(2.8×106个/mL)和对数生长中期细胞(1.2× 107个/mL).将各组病毒培养至100mL(500mL摇瓶),进行蛋白表达,并取样进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测.S1、RBD、RBD二聚体蛋白各选择表达量较高的2组,进行重复验证.结果 B2、C4病毒接种至高密度细胞,分泌表达量未提高,接毒后培养4和5 d的分泌表达量存在显著差异.A7(Endo-S1-tag)的分泌表达量明显低于 A9(HIV-ENV-S1-tag),A4(Gp67-S1-tag)分泌表达量最高,A1(Endo-Endo-S1-tag)分泌表达量显著低于 A7(Endo-S1-tag);B6(HIV-ENV-RBD-tag)分泌表达量显著高于 B4(Gp67-RBD-tag)及其他信号肽组;C4(Gp67-RBD-dimer-tag)分泌表达量明显高于C3(Gp64-RBD-dimer-tag).分别选择每种蛋白表达量较高的2组(A4、A9;B4、B6;C3、C4)进行重复验证确定,结果显示,A4、B6、C4的分泌表达量最高.结论 S1、RBD二聚体蛋白分泌表达量最高的信号肽相同,是GP67信号肽,而RBD蛋白的最适信号肽是HIV-ENV信号肽.表明N-端序列会影响蛋白的分泌,信号肽序列有一定的通用性,但也与要表达的目的蛋白序列有关.

目的 选育他克莫司高产菌株,优化培养基配方,提高发酵产量.方法 采用原生质体融合技术对2株筑波链霉菌进行基因组重排,并经响应面设计对发酵培养基配方进行优化.结果 以紫外灭活作为遗传标记经过4轮基因组重排育种后,摇瓶筛选获得3株高产菌株,其中菌株FK22-71菌丝球松散、椭圆状,发酵浸泡液颗粒状.该菌株稳定高产,采用响应面设计优化后的配方在50 L罐发酵产量平均达1684 mg/L.结论 基因组重排技术应用于他克莫司高产菌株选育,可大幅提高发酵产量,为其工业化发酵生产奠定了基础.

[背景]口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一.口蹄疫病毒的结构蛋白VP1 包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此 VP1 是研究亚单位疫苗的方向靶标.谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为安全生产菌株,是医药用蛋白生产的优势细胞工厂.[目的]利用C.glutamicum作为受体菌株表达外源蛋白的优势实现VP1 的外源表达.[方法]根据VP1 结构蛋白的基因序列、相应功能和C.glutamicum的密码子偏好性设计并合成VP1 基因,与pXMJ19载体连接构成重组质粒pXMJ19-VP1.C.glutamicum CGMCC 1.15647 菌株用于表达VP1-6×his蛋白,并对蛋白表达元件启动子、5′非翻译端(5′UTR)、目的蛋白自身N端等进行优化,同时对培养条件等进一步优化,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测VP1 蛋白的表达情况.最后应用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定本研究中生产的VP1 的免疫活性.[结果]SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明VP1 蛋白能在C.glutamicum CGMCC 1.15647 菌株成功表达,将Ptac启动子替换为合成型启动子PH36 能提高蛋白产量.在此基础上,通过插入不同的 5′UTR序列和VP1 蛋白N端氨基酸的改变能进一步提高蛋白产量并可利用CspB信号肽实现分泌表达.发酵试验表明,VP1 摇瓶发酵培养最优条件为 30℃、24 h.ELISA试验表明,本研究中的 VP1 可与阳性血清特异性结合.[结论]本研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达 FMDV的VP1蛋白,并通过优化蛋白表达元件的方法进一步提高了产量,为开发新型FMD免疫诊断试剂和安全高效的亚单位疫苗奠定了良好的基础.