目的:基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术建立多囊肾病1（polycystic kidney disease 1， Pkd1）基因条件敲除小鼠模型，为深入研究 Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用提供动物模型。 方法:采用In-Fusion技术构建打靶载体，根据 Pkd1基因制备对应的gRNA、Cas9 mRNA及携带loxP位点的供体载体，共同注射于C57BL/6N小鼠的受精卵内。将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部。幼鼠出生后经PCR鉴定及测序分析分选出 Pkd1 flox/flox基因型F0代阳性小鼠，后者与野生型小鼠配繁，筛选出后代基因型为 Pkd1 flox/+的F1代杂合子小鼠，内部扩繁获得基因型为 Pkd1 flox/flox的F2代纯合子小鼠，该基因型小鼠再与 Cre阳性表达的 Ggt1- Cre小鼠杂交，获得 Pkd1 flox/+Ggt1 Cre基因型的F3代小鼠，F3代自交或与F2代 Pkd1 flox/flox回交得到 Pkd1 flox/floxGgt1 Cre基因型的F4代小鼠，即肾脏特异性 Pkd1基因敲除（ Ggt1-cKO）小鼠。采用PCR法鉴定小鼠基因型，按基因鉴定结果分为野生型对照（WT）组（ n=6）、 Pkd1纯合子对照（PKD）组（ n=6）和 Ggt1-cKO敲除验证（CKO）组（ n=6）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组小鼠肾脏和其他器官组织中 Pkd1 mRNA的表达；HE染色检查各组小鼠肾组织病理改变；自动生化检测仪检测小鼠血清尿素氮和血清肌酐含量，并计算肾脏系数。 结果:PCR检测结果显示，CKO组子代小鼠基因型符合 Pkd1 flox/floxGgt1 Cre。 Pkd1基因仅在肾脏特异性表达，其余组织中均未见表达。RT-qPCR结果显示，CKO组小鼠肾脏髓质 Pkd1 mRNA相对表达量显著低于WT组和PKD组（均 P<0.05）。肉眼可见CKO组小鼠肾脏体积较WT组增大了1倍左右，光镜下可观察到CKO组小鼠肾脏有多个大小形态不一的空泡，髓质组织间隙明显增加。CKO组小鼠肾脏系数、血清尿素氮和血清肌酐含量均显著高于WT组和PKD组（均 P<0.05）。 结论:基于CRISPR/Cas9和Cre-loxP基因编辑技术可成功构建 Pkd1基因条件敲除小鼠，为进一步研究 Pkd1基因在多囊肾病发生中的作用机制提供动物模型。

目的:构建间质细胞双尾C(Bicc1)基因条件性敲除小鼠模型，并对其表型进行分析。方法:将CRISPR Cas9方法构建的Bicc1 f/+小鼠子代与Pdgfra启动子驱动的Cre小鼠进行杂交，获得子代小鼠，饲养1~2周后提取其脚趾及鼠尾组织基因组DNA，经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后，在DNA水平检测小鼠基因型；选取经鉴定后生长至3周龄的Bicc1基因条件性敲除小鼠(实验组)、野生型小鼠(对照组)各3只进行后续实验：通过腹腔注射他莫昔芬进行诱导敲除Bicc1基因，于1周后取小鼠肾脏、骨骼肌、皮肤及脂肪组织，一部分组织通过实时定量PCR(RT-qPCR)鉴定其中的Bicc1 mRNA表达水平；另一部分组织以10%多聚甲醛固定，随后进行HE染色和Masson染色，在光镜下观察分析。应用SPSS 28.0软件对数据进行分析，组间比较采用 t检验， P<0.05表示差异有统计学意义。 结果:通过繁育获得间质细胞Bicc1基因条件性敲除小鼠，基因型为Bicc1 f/fCre +/－，野生型小鼠基因型为Bicc1 f/fCre －/－；RT-qPCR检测结果显示，实验组小鼠肾脏、骨骼肌、皮肤、脂肪组织中Bicc1 mRNA表达水平均显著低于对照组( P均<0.01)；HE染色和Masson染色显示，与对照组相比，实验组小鼠肾小球萎缩，肾小囊形状不规则，部分肾小囊消失；骨骼肌纤维排列疏松散乱，肌纤维堆积不致密；皮肤及脂肪组织未见明显差别。 结论:成功建立了间质细胞Bicc1基因条件性敲除小鼠模型，可以为研究Bicc1基因在组织器官间质细胞中的作用提供动物模型；3周龄小鼠间质细胞中敲除Bicc1后1周，其肾脏和骨骼肌发生病理性改变。

目的:构建p53凋亡刺激蛋白2（ASPP2）基因敲除小鼠，用该小鼠建立二乙基亚硝胺（DEN）诱导的肝癌模型以研究ASPP2的生物学功能。方法:构建单链向导RNA寡聚核苷酸，用CRISPR/Cas9系统制备ASPP2基因敲除小鼠。采用PCR法和测序方法鉴定F0、F1代及其子代的基因型。用DEN诱导ASPP2+/-小鼠建立肝癌模型。结果:PCR和测序结果表明F0代小鼠ASPP2基因敲除成功；F1代小鼠基因型符合ASPP2+/-，获得稳定遗传性；F1代自杂交获得ASPP2+/-小鼠DEN诱导的肝癌模型成功率（7/8与3/8）明显高于野生型。结论:基于CRISPR/Cas9系统成功构建ASPP2基因敲除小鼠，ASPP2基因敲除小鼠DEN诱导的肝癌模型成功率明显高于野生型。

浙江红花油茶(Camellia chekiangoleosa)种仁含油率和油酸含量高,广宁红花油茶(C.semiserrata)具有较强的生长势和抗性.为了利用浙江红花油茶和广宁红花油茶的优点,培育优良种质材料,该研究对浙江红花油茶与广宁红花油茶的 45 个F1杂交子代进行表型性状分析,以掌握杂交子代的表型性状情况,同时利用SSR标记对其进行杂种真伪鉴定,并筛选可用于油茶杂交子代鉴定的SSR标记.结果表明:(1)浙江红花油茶×广宁红花油茶的F1子代表现为树形高大、生长迅速且其叶脉、萼片、柱头均倾向于父本广宁红花油茶的性状,而花和叶片形态等性状与母本浙江红花油茶接近,叶片颜色与大小等特征介于双亲特征之间.(2)从 32 个SSR标记中筛选出了 8 个可区分双亲且能明确杂交子代来源的完全互补型标记,用于开展杂交子代鉴定,其中 7 个标记杂种鉴定效率高达 100%,1 个标记杂种鉴定效率为 55.56%;8 个标记相互补充鉴定出 45 个杂交子代全是真杂种.(3)8 个SSR标记对杂交子代进行的鉴定能力验证表明,利用这些SSR标记鉴定油茶杂交子代是可行的.该研究结果为油茶物种间的杂交育种提供了参考,同时也为后续油茶物种间的杂交子代SSR标记鉴定提供了依据.

目的 通过C57BL/6J(B6)和DBA/2J(D2)亲本品系小鼠流感感染后相关表型及杂交子代BXD小鼠肺脏转录本数据的系统性分析进行基因筛选,以找到在流感病毒感染中发挥作用的候选基因.方法 共选取41个BXD小鼠及亲本品系B6和D2的雌性小鼠,在8～12周龄之间给予流感病毒甲型鼠肺适应株(H1N1,PR8M)得到相关表型及基因表达量数据,对基因表达量进行聚类分析及加权基因共表达网络分析,构建模块特征值与小鼠病毒载量的相关性,经表达数量性状座位分析,皮尔逊相关性分析,结合全基因组关联研究(GWAS)、小鼠基因组信息学(MGI)、国际小鼠表型联合会(IMPC)三个基因数据库中的信息分析筛选流感病毒感染相关的候选功能基因及确定该基因的遗传调控方式;最后将挑选出的基因进行通路富集分析.结果 通过聚类分析和加权基因共表达网络分析,将24 219个基因分为23个模块;通过模块与表型的相关性分析,发现MEred、MEgreen、MEma-genta模块与感染密切相关,将其作为核心模块;对核心模块基因通过KEGG和MPO富集分析,结果显示流感病毒相关基因显著参与MAPK信号通路、TNF信号通路等多个细胞免疫相关通路;对核心模块内基因与BXD小鼠流感病毒感染的3种表型(体质量减轻,平均死亡时间和感染后体质量减轻中位数)进行相关性分析,共发现21个基因的肺mRNA表达水平与3种表型均相关(P＜0.05);进一步通过GeneNetwork中GEMMA算法对这21个基因行表达数量性状座位分析,结果表明Acpl2受顺式遗传调控,Dusp12、Ovol2、Catsper4、Tmc5、Acsm 1、Fam81a、Rtn4、Rhpn1受反式遗传调控;通过结合MGI,IMPC,GWAS三个基因数据库中的信息分析发现部分基因在免疫通路方面发挥作用.结论 通过系统遗传学分析,在小鼠基因组上鉴定了影响流感病毒感染相关的21个候选基因,后续可做进一步的功能验证来阐明其参与流感病毒感染的遗传调控机制.

为培育泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)全雌品种,研究通过细胞荧光染色后进行细胞学观察确定人工诱导泥鳅雌核发育的热休克起始时间,并进一步利用核型和流式细胞分析等方法对人工诱导雌核发育泥鳅进行鉴定.结果显示,二倍体泥鳅受到灭活的鲤(Cyprinus carpio)精子刺激后,第二极体与卵核分开的时间在人工授精后3-5min;卵子在人工授精后3.5min后再热休克2min的诱导孵化率达到10.26％.通过分析野生型泥鳅胚胎、人工诱导雌核发育泥鳅胚胎、泥鳅×鲤杂交胚胎和单倍体泥鳅胚胎的发育,发现部分雌核发育的胚胎可以正常发育,而杂交胚胎和单倍体胚胎会出现明显的发育障碍.核型和流式细胞检测分析表明利用本研究获得的热休克参数进行处理可得到二倍体雌核发育子代,二倍率达64.71％.研究从细胞学层面获得泥鳅雌核发育的诱导参数,可为利用人工诱导雌核发育开展全雌泥鳅育种提供指导.

甘薯茎线虫病由马铃薯腐烂线虫引起,是严重影响甘薯产量和品质的检疫性病害.挖掘抗茎线虫病基因并通过分子设计育种培育抗病品种是防控茎线虫病的有效途径.本研究前期以抗茎线虫病甘薯品种美国红为父本,感病品种徐紫薯8号为母本,通过控制授粉有性杂交方式构建了包含274个F1子代的分离群体.以该F1群体为材料,利用室内人工接种法对F1子代的茎线虫病抗扩展性进行鉴定,结果表明,甘薯茎线虫病抗扩展性呈连续性偏峰态分布,甘薯茎线虫病发病体积比与扩展直径和扩展长度呈极显著正相关,与薯块直径、薯块长度和薯块长宽比无相关性,说明薯块的大小和薯形对抗扩展性鉴定结果无影响.甘薯茎线虫病抗扩展性遗传力为75.7％,表明抗扩展性主要受遗传因素控制.基于前期构建的甘薯SNP遗传图谱对抗扩展性进展QTL定位,获得与抗扩展性紧密连锁的QTL 10个,解释6.6％～10.7％的表型变异.候选基因功能注释表明,苯丙素生物合成、植物激素信号转导、植物病原互作代谢等通路参与抗病胁迫.筛选5个关键候选基因进行荧光定量表达分析,在接种茎线虫后候选基因itf13g19570表达量显著增高.研究结果为甘薯茎线虫病抗病基因挖掘和抗病机理解析提供了重要参考.

目的 构建可在血液系统中条件性敲除DNMT3B基因小鼠并进行鉴定,为研究DNMT3B基因的生物学功能及其在血液肿瘤疾病的作用机制提供动物模型.方法 将引进的DNMT3Bflox/flox小鼠与Mx1-Cre+小鼠进行杂交繁殖,得到基因型DNMT3Bflox/+Mx1-Cre+及DNMT3Bflox/+Mx1-Cre-两种子代,再用这两种子代杂交产生子代小鼠,通过PCR法鉴定子代小鼠的基因型;获得基因型为DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+的小鼠,通过腹腔注射pI-pC共5次诱导DNMT3B敲除,然后用半定量PCR方法鉴定DNMT 3B基因敲除情况.结果 基因型鉴定确认在13只子鼠中有2只为DNMT3Bflox/floxMx1-Cre+,经pI-pC腹腔注射后,DNMT 3B基因通过Cre/loxP系统被成功敲除.结论 该方法成功构建可以在血液系统条件性敲除DNMT3B基因的小鼠,并进行敲除后鉴定.

目的 通过白细胞介素1受体1 (interleukin-1 receptor1,IL-1R1)和白细胞介素6 (inter-leukin-6,IL-6)单基因敲除小鼠杂交繁育以获得IL-1R1-/-IL-6-/-纯合子小鼠.方法 将IL-1R1 +/+IL-6-/-和IL-1R1-/-IL-6 +/+小鼠杂交,并进行子代自交繁殖,提取基因组DNA,PCR鉴定其自交子代基因型.并用免疫印迹法(Western blot)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)确定自交小鼠后代基因型.结果 PCR鉴定成功获得基因型为IL-1R1-/-IL-6-/-的双基因敲除小鼠.Western blot结果显示,双基因敲除小鼠未见IL-1R1的蛋白条带;ELISA结果提示,双基因敲除小鼠的IL-6细胞因子为阴性.结论 成功获得IL-1R1-/-IL-6-/-双基因敲除纯合小鼠,为深入研究IL-1R1、IL-6基因相关的炎症疾病动物模型奠定基础.

目的:构建Cre重组酶系统调控的肺特异性的富半胱氨酸血管生成诱导因子61(CYR61,又称CCN1)基因条件敲除小鼠,为肺组织内CCN1在炎症中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型.方法:将引进的CCN1flox/flox转基因小鼠和肺上皮细胞特异性表达Cre重组酶工具鼠分别进行繁殖和鉴定,然后将2种小鼠进行杂交并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为Cre+/-CCN1flox/flox的小鼠为本研究所构建的肺上皮细胞特异性CCN1基因条件敲除小鼠.结果:Cre+/-CCN1flox/flox的小鼠被成功繁殖并鉴定.使用他莫昔芬腹腔注射处理Cre+/-CCN1flox/flox实验组及Cre-/-CCN1flox/flox对照组,分别使用RT-PCR、免疫荧光、免疫组织化学、Western blot检测肺组织中CCN1的mRNA和蛋白表达,与对照组比可见实验组肺组织中CCN1的mRNA和蛋白表达均明显下降.结论:本研究基于Cre-LoxP技术成功构建了肺上皮细胞特异性CCN1基因条件敲除小鼠,并能稳定传代,可为进一步研究CCN1在肺组织内炎症中调控作用和机制奠定了动物模型的基础.