目的 基于Ms2噬菌体制备内含仙台病毒(Sendai virus,SeV)RNA的假病毒装甲RNA标准质控品,以期应用于SeV感染的诊断及该病毒的分子生物学安全检测.方法 将SeV的L基因片段插入质粒pET-28b-Ms2中,构建重组质粒pET-28b-Ms2-L(SeV).将重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,即SeV假病毒装甲RNA标准质控品.将标准质控品置电镜下观察其形态,并进行10％SDS-PAGE分析、抗DNase Ⅰ及抗RNsaeA试验、稳定性分析.采用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术对SeV、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)、小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)、汉坦病毒(Hantaan virus,HV)、呼肠弧病毒 Ⅲ 型(reovirus type Ⅲ,ReoⅢ)、小鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)进行检测,验证标准质控品的效果.结果 标准质控品于电镜下呈Ms2噬菌体假病毒颗粒结构,相对分子质量约为14 000,可有效抵抗DNase Ⅰ及RNsaeA的降解.标准质控品于-80 ℃保存6个月、-20 ℃保存6个月、28 ℃保存5、10、15 d后仍具有良好的稳定性.仅SeV可见RPA特异性扩增曲线,其他病毒均未出现扩增曲线.结论 本研究构建的SeV假病毒装甲RNA标准质控品具有良好的稳定性及特异性,可作为SeV的各项分子生物学安全检测的阳性对照.

目的:分析血清前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/Kexin 9, PCSK9)与特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary hypertension, IPAH)的临床特征、血液动力学和预后相关性。方法:选择2019年12月至2022年11月我院收治的42例IPAH患者为对象。采用酶联免疫吸附测定法检测血清PCSK9水平。记录随访1年无临床恶化生存率。结果:IPAH者血清PCSK9水平135.63(77.93，216.69)ng/ml。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic, ROC)分析显示，血清PCSK9水平诊断IPAH曲线下面积为0.763(95%CI：0.655～0.871，P<0.05)，最佳截断值血清PCSK9为107.48 ng/ml，特异性为88.2%。IPAH血清PCSK9水平与肺动脉收缩压(r＝0.488)、舒张压(r＝0.634)、平均肺动脉压(mean pulmonary artery pressure, mPAP)(r＝0.653)、平均肺血管楔压(r＝0.315)、肺血管阻力(r＝0.576)、世界卫生组织功能分级(r＝0.519)呈正相关(P<0.05)，与6 min步行距离(r＝－0.361，P<0.05)呈负相关。随访1年，IPAH患者死亡11例(26.19%)，存活31例(73.81%)。Kaplan-Meier分析显示，PCSK9>107.48 ng/ml的IPAH临床无恶化生存5例(11.90%)低于PCSK9≤107.48 ng/ml IPAH者26例(61.90%)(P<0.05)。多因素COX分析显示，BNP(HR: 1.476，95%CI: 1.082～2.013)和PCSK9(HR：1.007，95%CI: 1.001～1.014)是临床恶化的预测因子。受限三次样本时，PCSK9与临床恶化HR线性相关。结论:PCSK9与肺动脉高压状态、血液动力学和预后相关。

目的:探讨ras-相关结构域家族(ras-association domain family,RASSF)10在非小细胞肺癌中的表达,分析其与非小细胞肺癌临床病理特征和预后的关系.方法:采用qRT-PCR和Western印迹检测RASSF10 mRNA和蛋白的表达;甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测RASSF10启动子甲基化状态,采用免疫组化和酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测石蜡组织和血液中RASSF10蛋白表达,Cox回归模型进行生存分析.结果:在非小细胞肺癌细胞株SPCA-1中RASSF10 mRNA及蛋白(z=21.38、33.14,均 P＜0.05)、在 NCI-H157 中 RASSF10 mRNA 及蛋白(z=56.73、56.34,均 P＜0.05)均低于非肿瘤细胞株.MSP 发现RASSF10在SPCA-1和NCI-H157细胞株启动子区甲基化,用5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后,RASSF10在SPCA-1和NCI-H157细胞株中mRNA和蛋白(t=18.14、56.13,均P＜0.05)的表达增加.RASSF10启动子甲基化状态与组织中和血清中RASSF10的低表达密切相关(x2=19.271、4.831,均P＜0.05).预后多因素分析石蜡组织中RASSF10表达(HR=0.508,P＜0.05)和N分期(HR=1.839,P＜0.001)为非小细胞肺癌患者预后独立因素,RASSF10表达与肿瘤直径(x2=4.787,P＜0.05)、气道内播散(=15.618,P＜0.001)和N分期(x2=11.588,P＜0.01)密切相关.结论:RASSF10在非小细胞肺癌中表达降低,与非小细胞肺癌肿瘤进展密切相关,是非小细胞肺癌早期诊断及预后有价值的肿瘤标志物.

目的 探讨莫西沙星(Moxi)下调长链非编码RNA生长抑制特异性基因(lncRNA GAS5)通过非受体型蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信号传导及转录激活蛋白(STAT)信号通路对肺炎支原体肺炎的保护作用.方法 将BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、实验组和联合组.模型组、实验组和联合组小鼠用鼻滴肺炎支原体菌液的方法建立肺炎支原体肺炎模型.实验组和联合组腹腔注射100 mg·kg-1莫西沙星治疗;在此基础上,联合组尾静脉注射过表达质粒pc-GAS5,对照组和模型组均腹腔注射等量的0.9％NaCl.用酶联免疫吸附试验法检测小鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6水平,用生化法检测小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)水平,用实时荧光定量聚合酶链反应法检测小鼠肺组织中 lncRNA GAS5的表达水平,用蛋白质印迹法检测小鼠肺组织中 B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、JAK2和STAT3的表达水平.结果 对照组、模型组和实验组血清中IL-1β含量分别为(64.03±14.19)、(254.85±63.79)和(157.46±42.93)pg·mL-1,IL-6 含量分别为(22.61±5.01)、(184.14±39.50)和(132.64±25.47)pg·mL-1,SOD 活性分别为(50.38±11.75)、(28.17±6.71)和(37.67±8.09)U·mL-1,肺组织中lncRNA GAS5相对表达水平分别为1.00±0.16、3.78±0.69和2.41±0.54;对照组、模型组、实验组和联合组肺组织中Bcl-2蛋白相对表达水平分别为1.00±0.17、0.65±0.14、0.82±0.16和0.62±0.13,磷酸化 JAK2/JAK2 比值分别 为 1.00±0.20、4.98±1.01、2.13±0.52和 4.21±0.92,磷酸化 STAT3/STAT3 比值分别为 1.00±0.18、3.77±0.78、2.65±0.64和3.49±0.75.模型组的上述指标与对照组相比,在统计学上差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.001);实验组的上述指标与模型组相比,在统计学上差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001);联合组的上述指标与实验组相比,在统计学上差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.001).结论 莫西沙星能够有效改善肺炎支原体肺炎小鼠肺组织形态,调节炎症因子水平和氧化应激损伤,可能是通过下调lncRNA GAS5影响细胞凋亡和JAK/STAT通路的蛋白表达来实现的.

目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:分析特发性炎性肌病（IIM）中多发性肌炎（PM）的发生率及其特征，探讨IIM中PM是否被过度诊断。方法:纳入2008—2019年于中日友好医院风湿免疫科住院依据Bohan与Peter标准诊断的所有IIM患者。确定诊断的PM（definite PM，dPM）定义为具有典型的PM临床特征和病理特征，包括肌酸激酶（CK）升高和肌无力，肌活检呈现肌细胞膜表达MHC-I阳性和CD8 +T细胞浸润肌内膜。同时，参照IIM各亚型的最新诊断标准，排除DM、抗合成酶综合征（ASS）、免疫介导的坏死性肌病（IMNM）、散发性包涵体肌炎和其他肌病。应用SPSS 24.0进行统计学分析。Kruskal-Wallis检验和 χ2检验用于比较dPM组和其他IIM亚型患者临床特点的差异。 结果:共1 259例IIM纳入研究，其中1 015例（80.6%）为DM，244例（19.4%）为PM。参照严格定义的dPM标准，IIM中仅有0.5%（6/1 259）的患者可被诊断为dPM。原先诊断为PM的患者在新的IIM亚型分类中多数为IMNM和ASS，其中48.0%（117/244）为IMNM，32.0%（78/244）为ASS。6例dPM患者中女性4例，占66.7%，其中1例合并RA，1例合并SSc。所有dPM患者均有肌无力，轻度CK升高[611（391，1 451）]U/L，肌炎特异性自身抗体均为阴性。除了1例dPM患者因合并慢性阻塞性肺疾病，未接受免疫调节治疗外，其余5例患者均予低/中等剂量糖皮质激素联合或不联合免疫抑制剂治疗。在随访（38±26）个月后，患者肌力均改善。结论:PM是一类非常罕见的IIM临床亚型，PM在临床上存在过度诊断。严格定义的PM是一类临床症状轻，预后好的疾病。

目的:探究调强放疗联合化疗对晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清细胞增殖抗原(PCNA)、肿瘤特异性生长因子(TSGF)、可溶性E-钙黏蛋白(SE-CAD)表达变化及与预后的关系。方法:选取2016—2018年南京医科大学附属淮安第一医院收治的晚期NSCLC患者84例(Ⅲ A、Ⅲ B、Ⅳ期分别为29、30、25例)，均给予调强放疗联合化疗。检测对比不同TNM分期、治疗前后血清PCNA、TSGF、SE-CAD水平，并比较不同疗效患者血清PCNA、TSGF、SE-CAD水平。采用 Logistic法分析血清PCNA、TSGF、SE-CAD水平与疗效关系。 Kaplan- Meier法生存分析。 结果:Ⅳ期患者疗前血清PCNA、TSGF、SE-CAD水平高于Ⅲ B和Ⅲ A期[(584.11±60.25) pg/ml∶(531.06±51.37) pg/ml和(477.54±46.49) pg/ml、(96.13±7.54) U/ml∶(88.52±5.91) U/ml和(82.41±5.0) U/ml、(3.02±0.26) ng/ml∶(2.87±0.22) ng/ml和(2.71±0.15) ng/ml，均 P<0.05]，Ⅲ B期高于Ⅲ A期(均 P<0.05)。疗后血清PCNA、TSGF、SE-CAD水平低于疗前水平[(396.11±50.23) pg/ml∶(528.37±75.09) pg/ml、(74.81±4.72) U/ml∶(88.68±6.13) U/ml、(1.92±0.24) ng/ml∶(2.86±0.31) ng/ml，均 P<0.05]。疗后18个月生存患者PCNA、TSGF、SE-CAD水平低于死亡患者[(332.51±54.32) pg/ml∶(444.92±60.07) pg/ml、(70.59±6.20) U/ml∶(78.05±8.44) U/ml、(1.71±0.24) ng/ml∶(2.08±0.27) ng/ml，均 P<0.05]。血清PCNA、TSGF、SE-CAD水平与预后显著相关(均 P<0.05)。84例NSCLC患者疗后客观缓解率为29%(24/84)。疗后血清血清PCNA、TSGF、SE-CAD高表达组生存曲线低于低表达组(均 P<0.05)。 结论:血清PCNA、TSGF、SE-CAD水平在晚期NSCLC患者中呈高表达，与临床分期、预后密切相关，且有助于预测生存状况。

目的:探讨乳腺癌耐药蛋白( BCRP)和肺特异性X蛋白( LUNX)基因的mRNA水平与非小细胞肺癌(NSCLC)患者病理类型及分期的相关性及其对于预后的价值。 方法:选取2015年6月至2018年6月河南大学淮河医院收治的89例患者为NSCLC组，以同期收治的55例肺良性病变患者为对照，检测两组患者外周血中 BCRP、LUNX的mRNA表达水平，并分析其与临床病理特征及预后的相关性。 结果:NSCLC组外周血中 BCRP、LUNX mRNA的阳性表达率显著高于肺良性病变组( P<0.05)；NSCLC患者 BCRP mRNA的表达与分化程度、TNM分期有关( P<0.05)，与性别、年龄、吸烟、病理类型、淋巴结转移无关( P>0.05)；其 LUNX mRNA的表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关( P<0.05)，与性别、年龄、吸烟、病理类型无关( P>0.05)； BCRP mRNA表达组与 LUNX mRNA表达组的总体生存率均显著低于无表达组( P<0.05)；分化程度、TNM分期、淋巴结转移、 BCRP mRNA表达、 LUNX mRNA表达均为影响NSCLC患者预后的因素。 结论:NSCLC患者外周血中 BCRP、LUNX mRNA的水平显著偏高，且 BCRP mRNA的表达与分化程度、TNM分期有关， LUNX mRNA的表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，二者可作为评估NSCLC患者预后的独立因素。

目的:观察汉黄芩素联合顺铂对肺腺癌A549、H1299细胞增殖和凋亡的影响。方法:培养建立肺腺癌A549、H1299细胞株，实验分为空白对照组、汉黄芩素组、顺铂组及汉黄芩素联合顺铂组(联合组)。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)实验和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)实验检测各组的细胞增殖能力；平板克隆实验检测癌细胞克隆形成能力；原位缺口末端标记法(TUNEL)实验检测各组细胞凋亡率；流式细胞术分析各组对细胞凋亡的影响；蛋白质印迹法(Western blot)实验检测B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)/B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)/半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3通路相关蛋白表达；同时构建SPF级裸鼠成瘤模型进一步验证。多组资料比较采用单因素方差分析。结果:CCK-8实验结果显示第4天时肺腺癌A549、H1299细胞株空白对照组、汉黄芩素组、顺铂组、联合组在波长450 nm处时吸光度值比较，差异有统计学意义(1.102±0.109、0.765±0.087、0.484±0.122、0.356±0.056比1.114±0.256、0.824±0.225、0.623±0.239、0.378±0.191， F＝259.633、205.262， P<0.01)。EdU实验结果显示肺腺癌A549、H1299细胞株空白对照组、汉黄芩素组、顺铂组、联合组EdU阳性细胞率比较，差异有统计学意义[(58.0±2.0)%、(48.8±3.2)%、(22.5±1.4)%、(16.1±3.8)%比(56.7±1.5)%、(46.6±2.8)%、(21.2±2.2)%、(14.2±1.8)%， F＝65.198、89.293， P<0.01]。克隆实验结果显示肺腺癌A549、H1299细胞株空白对照组、汉黄芩素组、顺铂组、联合组克隆细胞数比较，差异有统计学意义(102.0±3.5、96.0±4.8、50.0±2.9、25.0±3.5比125.0±0.8、121.0±2.5、55.0±3.9、30.0±3.3， F＝68.151、52.086， P<0.01)。TUNEL实验结果显示肺腺癌A549、H1299细胞株空白对照组、汉黄芩素组、顺铂组、联合组TUNEL阳性细胞率比较，差异有统计学意义[(4.5±1.6)%、(7.3±3.2)%、(21.2±4.6)%、(36.6±3.8)%比(3.8±2.2)%、(7.5±1.4)%、(23.5±3.8)%、(35.2±2.9)%， F＝18.110、36.258， P<0.05]。流式分析可见肺腺癌A549、H1299细胞株空白对照组、汉黄芩素组、顺铂组、联合组凋亡细胞数百分比比较，差异有统计学意义[(5.56±2.73)%、(22.38±3.16)%、(50.78±4.85)%、(66.08±2.96)%比(4.78±1.95)%、(23.75±2.56)%、(52.14±3.82)%、(63.56±3.14)%， F＝66.565、89.298， P<0.01]。Western blot实验表明，汉黄芩素组、顺铂组、联合组细胞中促凋亡蛋白Caspase-3、c-Caspase-3、bax的表达水平与对照组比较呈明显上升趋势，而抗凋亡蛋白bcl-2的表达水平与与对照组比较则呈明显下降趋势。裸鼠成瘤模型表明，4周后空白对照组、汉黄芩素组、顺铂组、联合组肿瘤体积比较，差异有统计学意义[(625.78±3.62)、(365.64±2.58)、(220.25±2.24)、(122.69±4.86) mm 3，空白对照组、汉黄芩素组、顺铂组、联合组肿瘤质量分别为(0.72±0.14)、(0.44±0.05)、(0.22±0.04)、(0.16±0.04) g， F＝115.480、145.298， P<0.01]。 结论:汉黄芩素联合顺铂作用可抑制肺腺癌A549、H1299细胞增殖，促进其凋亡，且两者具有协同增效作用，其主要通过bax/bcl-2/Caspase-3凋亡信号通路，上调Caspase-3、bax蛋白表达，下调bcl-2蛋白表达发挥作用，可能通过ROS途径增敏顺铂诱导肿瘤细胞凋亡。

目的:构建表达结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis， Mtb)潜伏期表达抗原Rv3133c，通过人群以及小鼠实验评价其免疫原性。 方法:构建重组质粒pPROEX-Rv3133c，诱导表达并纯化蛋白质，经Western blot鉴定后，用全血干扰素释放试验评价重组蛋白rRv3133c在 Mtb感染人群中的免疫原性；联合佐剂DC免疫小鼠，检测小鼠血清中rRv3133c特异性抗体分泌水平、脾细胞中抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平以及脾细胞中多功能T细胞免疫应答水平和肺脏组织细胞因子mRNA表达水平。 结果:成功构建表达rRv3133c。rRv3133c可刺激 Mtb感染者尤其是潜伏感染者产生高水平的IFN-γ。免疫小鼠后，rRv3133c+DC组小鼠脾脏IFN-γ、TNF-α、IL-2水平，以及IFN-γ +TNF-α +CD4 +T细胞数量和肺脏组织中抗原特异性IFN-γ、TNF-α、iNOS的mRNA表达水平均高于BCG组，但低于BCG+rRv3133c+DC组；rRv3133c+DC组和BCG+rRv3133c+DC组小鼠血清中IgG2a/IgG1比值均大于1，显著高于BCG组。 结论:rRv3133c具有良好的免疫原性，可以诱发机体产生较强的Th1型免疫应答，是结核病亚单位疫苗的潜在候选靶抗原。