[目的]研究湖北黄精花部形态结构特征和大小孢子发生及雌雄配子体发育过程,以丰富黄精属植物的生殖生物学理论,为进一步开展湖北黄精的品种选育提供依据.[方法]以不同发育时期的湖北黄精花芽为试验材料,用显微观察法观察花部形态结构特征,石蜡切片技术对单花雌雄蕊进行切片观察.[结果]湖北黄精的花被为白色或淡黄绿色,花被筒近喉部稍缢缩;具6枚雄蕊,花丝下端与花被合生,花药开裂方式为纵裂;雌蕊子房上位,3心皮,花柱与子房等长.湖北黄精花药壁由4层细胞组成,成熟的绒毡层具多核,绒毡层发育类型为分泌型;小孢子母细胞减数分裂为连续型,四分体呈左右对称型排列,成熟花粉粒为2-细胞型;存在小孢子发育不同步的现象.雌蕊胚珠具双珠被、厚珠心;四分体呈直线型排列,胚囊发育类型为蓼型;存在双胚囊胚珠现象.在雄蕊的花药壁和雌蕊的子房壁都观察到有束状草酸钙针晶.[结论]湖北黄精雌雄蕊具有较原始的发育特征,虽然在发育过程中都存在异常现象,但雄蕊最终能形成正常的雄配子体,雌蕊低频率的双胚囊现象对总体受精结果影响很小.湖北黄精杂交育种可以选择花药开裂前一时期的花粉,花药壁和子房壁观察到的束状草酸钙针晶无法作为湖北黄精物种鉴定的依据.

为了培育性状优良、遗传稳定的黄鳝(Monopterus albus)群体,研究探索了人工诱导黄鳝减数分裂雌核发育方法.针对养殖性状优良的深黄大斑鳝进行种质纯合,创制出3个深黄大斑鳝雌核发育群体.流式细胞术和染色体计数分析表明雌核发育黄鳝的细胞DNA含量、染色体数目均与野生型相同.性腺组织学切片观察表明雌核发育黄鳝卵巢发育正常.微卫星多样性分析表明雌核发育黄鳝群体的有效等位基因(Ne)、平均香农指数(I)、平均多态信息指数(PIC)、平均观测杂合度(Ho)及平均期望杂合度(He)等参数均极显著低于野生群体,雌核发育群体的遗传纯合度显著提高.雌核发育群体之间的遗传距离增大,遗传相似系数变小.深黄大斑鳝雌核发育群体为培育性状优良的黄鳝养殖品种提供了育种材料.

砂引草属(Messerschmidia L.)在紫草科(Boraginaceae Juss.)分类系统里位置不稳定,为更好地理解砂引草属的分类学位置,利用常规石蜡制片技术结合光学显微镜观察了砂引草(Messerschmidia sibirica L.)的大小孢子发生及雌雄配子体发育特征.结果如下:(1)花药4室,成熟花药壁由表皮、药室内壁、1层中层和绒毡层共4层细胞构成,双子叶型花药壁发育类型,分泌型绒毡层,成熟绒毡层细胞含2核,表皮宿存,药室内壁不规则2层,具纤维性加厚;(2)小孢子母细胞减数分裂过程中胞质分裂为同时型,小孢子四分体四面体型排列,成熟花粉粒为2-细胞型;(3)胚珠倒生,单珠被,珠孔狭长,具珠被绒毡层,假厚珠心,部分珠心组织宿存至成熟胚囊时期;(4)胚囊发育类型为蓼型,成熟胚囊梭形,极核在受精前融合,反足细胞退化早.砂引草胚胎学特征与天芥菜属(Heliotropium)其他种类胚胎学特征十分相似,稍有不同,鉴于胚胎学特征在属内较为稳定,支持分子系统中将砂引草属置于天芥菜属的分类学处理.

为培育泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)全雌品种,研究通过细胞荧光染色后进行细胞学观察确定人工诱导泥鳅雌核发育的热休克起始时间,并进一步利用核型和流式细胞分析等方法对人工诱导雌核发育泥鳅进行鉴定.结果显示,二倍体泥鳅受到灭活的鲤(Cyprinus carpio)精子刺激后,第二极体与卵核分开的时间在人工授精后3-5min;卵子在人工授精后3.5min后再热休克2min的诱导孵化率达到10.26％.通过分析野生型泥鳅胚胎、人工诱导雌核发育泥鳅胚胎、泥鳅×鲤杂交胚胎和单倍体泥鳅胚胎的发育,发现部分雌核发育的胚胎可以正常发育,而杂交胚胎和单倍体胚胎会出现明显的发育障碍.核型和流式细胞检测分析表明利用本研究获得的热休克参数进行处理可得到二倍体雌核发育子代,二倍率达64.71％.研究从细胞学层面获得泥鳅雌核发育的诱导参数,可为利用人工诱导雌核发育开展全雌泥鳅育种提供指导.

囊果草(Leontice incerta Pall.)为生长于天山北坡荒漠和低山山坡的小檗科(Berberidaceae)多年生早春开花植物,具有较高的观赏价值、饲用价值和生态价值,为探究该物种的有性生殖特征,并为后续进行栽培育种等工作提供理论依据,作者利用光学显微镜和石蜡制片技术,对该物种大/小孢子发生和雌/雄配子体发育进行了观察.结果表明,(1)花药具4室,药壁由5层细胞组成,发育为基本型.药室内壁在发育后期具纤维状加厚现象;腺质型绒毡层具2核或多核现象.(2)小孢子母细胞减数分裂时胞质分裂为同时型;小孢子四分体为四面体型,被胼胝质壁所包围,游离小孢子形成后胼胝质壁逐渐消失.成熟花粉多为2细胞型,偶见3细胞型.(3)雌蕊由1心皮组成,子房1室,倒生胚珠,具双珠被,厚珠心.大孢子四分体呈线形排列,最终发育为7细胞8核的蓼型胚囊,助细胞具发达的漏斗形丝状器.这些特点说明,囊果草大/小孢子发生和雌/雄配子体发育正常,未见败育现象,表现出较原始的发育特征.研究结果丰富了小檗科植物的胚胎学资料,为该物种及其近缘物种的生殖生物学研究积累了理论基础.

果蝇Drosophila杂种劣育(hybrid dysgenesis)指某些品系果蝇间杂交,子代出现诸如卵巢发育不全、分离比异常、雄性个体减数分裂出现重组、高突变率、高频率染色体畸变甚至不育等异常现象.该现象可由多种转座因子(transposable element,TE)频繁转座引起,包括:P因子、Ⅰ因子、hobo因子、Penelope因子、Paris因子和Helena因子等.其中P因子是首个确定DNA序列的真核生物转座子,也是研究得最为充分的动物TE之一,已被开发成基因工程工具,在果蝇转基因研究中发挥重要作用.基因组中携带P因子的果蝇为父系品系(paternal strain),即P品系,无P因子的果蝇为母系品系(maternal strain),即M品系.M雌xP雄杂交子代,在繁殖过程中出现杂种劣育现象,而P雌×M雄、M雌×M雄以及P雌xP雄交配组合的后代都是正常的.近20年来,P因子调控机制研究取得重大进展,在原有阻遏蛋白机制外,又发现了与PIWI蛋白相互作用的RNA[P-element-induced wimpy testis(PIWI)-interacting RNA,piRNA]机制.阻遏蛋白机制基于 P 因子转座酶4个外显子间的3个内含子转录后剪切方式:如果3个内含子均被剪切,则产生的mRNA包含4个外显子,翻译为87 kD的转座酶,促进P因子转座;如果仅前2个内含子被剪切,则产生的mRNA在第3个内含子区段所含终止密码子处提前终止翻译,产生66 kD的阻遏蛋白,阻止P因子转座.近年发现的piRNA机制是更为普遍的TE调控机制,该机制类似细菌中发现的CRISPR来源的RNA(CRISPR-derived RNA,crRNA)机制,编码piRNA的基因也成簇排列,称为piRNA基因簇.piRNA基因簇转录出单链RNA前体分子,剪切为23～32 nt的piRNA,随即与PIWI蛋白结合形成复合体,并通过两个途径发挥作用:一是降解与piRNA序列互补的靶mRNA,发挥转录后沉默作用;另一是进入细胞核,指导P因子或piRNA基因簇序列的表观遗传修饰,发挥对P因子的转录抑制作用,和对piRNA基因簇的转录激活作用.研究发现,阻遏蛋白机制和piRNA机制在P因子转座调控中均发挥作用.本文可为果蝇杂种劣育现象的教学和科研工作提供帮助.

基于麻疯树RNA-Seq数据,利用RT-PCR技术成功从麻疯树花器官中克隆获得JcCXE7基因的开放阅读框,长度为957bp,编码318个氨基酸,预测该蛋白分子质量为35.55kDa.对JcCXE7基因的时空表达进行分析,结果表明,JcCXE7基因可能参与了麻疯树雌花大孢子母细胞发生和减数分裂;且在雌花中的表达水平大大高于雄花.利用原核表达体系对JcCXE7基因进行诱导表达,随后对获得的蛋白进行了LC-MS/MS鉴定,并对JcCXE7蛋白的氨基酸序列与同源家族进行多重比对及其结构进行分析,结果表明JcCXE7蛋白可能为GID1家族蛋白.

卵母细胞激活障碍(oocyte activation deficiency,OAD)是指精子进入卵母细胞后无法正确产生Ca2+振荡,从而无法解除对第二次减数分裂的阻滞、排出第二极体、释放皮质颗粒以及形成雌雄原核等对胚胎形成和发育至关重要的事件.造成OAD的原因既可能是由精子的异常导致,也可能是由卵母细胞本身的缺陷导致.卵母细胞辅助激活(assisted oocyte activation,AOA)或向卵母细胞内注射特定的重组蛋白rhPLCζ可以显著改善由OAD导致的胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后受精失败.归纳和综述OAD的各种原因及治疗手段.

boule基因为DAZ基因家族成员之一,是动物生殖细胞特异表达基因.在哺乳动物中,boule基因的缺失会引起精子生成障碍而导致雄性不育.在无脊椎动物秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中,boule基因同源物的缺失会引起其卵子发生障碍而导致雌性不育.龟鳖动物是最古老的爬行类,是从无羊膜卵到羊膜卵动物飞跃的过渡物种.相比于哺乳类及一些无脊椎动物,目前关于龟鳖动物生殖细胞发育模式的研究还非常有限.因此,本文以中华鳖(Pelodiscus sinensis)为研究对象,以期揭示boule基因对龟鳖动物生殖细胞发育分化的调控作用.首先,利用特异引物克隆获得中华鳖boule基因的cDNA序列,共1 005bp,其中,3'端非编码区57 bp,开放阅读框948 bp,共编码315个氨基酸.氨基酸序列多重比对分析显示,中华鳖与绿海龟(Chelonia mydas)同源性最高,达92％,与小鼠(Mus musculus)的同源性达83％,与果蝇(Drosophila melanogaster)的同源性达53％,与青鳉(Oryzias latipes)的同源性达42％.反转录实时定量PCR (RT-qPCR)分析结果显示,中华鳖boule mRNA主要在性腺组织精巢和卵巢中表达,而在其他体细胞组织中几乎检测不到表达.原位杂交结果显示,中华鳖boule mRNA在两性生殖细胞中特异表达,且在不同分化时期的生殖细胞中呈动态表达.在精巢中,boule mRNA在初级精母细胞中表达最强,在精原细胞和次级精母细胞中表达较弱,在精子细胞和精子中难以检测到表达信号;在卵巢中,boule mRNA在初级卵母细胞中表达信号最强且信号在初级卵母细胞胞质中均匀分布,生殖细胞发育进入卵母细胞生长期后,信号开始聚集在核周胞质,随着卵母细胞的成熟,信号逐渐变弱.本研究结果表明,boule基因可能在中华鳖两性生殖细胞的减数分裂过程中均具有重要的调控作用.

采用常规石蜡切片法,对车桑子大孢子的发生和雌配子体的发育进行观察,探讨车桑子自然结籽率低的原因和明确其胚胎发育特征.结果 表明:(1)车桑子花柱有花柱道,子房3室,中轴胎座,横生胚珠,每心室两枚胚珠,双珠被,厚珠心,无承珠盘.(2)位于珠心表皮细胞下的孢原细胞经平周分裂产生造孢细胞,造孢细胞发育为大孢子母细胞,大孢子母细胞经减数分裂形成线性四分体,靠近珠孔端3个大孢子退化消失,靠合点端大孢子发育为功能大孢子,大孢子发生类型为单孢子发生型.(3)单核胚囊经3次有丝分裂形成7细胞8核的成熟胚囊,胚囊发育类型为蓼型.(4)花器官形态的变化和大孢子发育过程有一定联系,可根据雌花形态特征大致判断大孢子发育时期.研究认为,车桑子雌配子体发育过程中出现的胚囊不中空、游离核不进一步细胞化等异常现象,可能是导致车桑子自然结籽率低的原因之一.