目的:探讨核因子(NF)κB激酶亚单位ε抑制剂(IKBKE)在食管鳞状细胞癌(ESCC)中的表达及其沉默对KYSE-30细胞生物学行为的影响.方法:收集自2020年6月至2023年6月开展ESCC根治术的30例患者的癌组织以及癌旁组织,并分为ESCC组(n=30)与对照组(n=30).运用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白质印迹法(WB)检测ESCC组及对照组中的IKBKE mRNA与蛋白水平,并分析ESCC组中的IKBKE mRNA以及蛋白水平与ESCC患者临床病理特征(性别、年龄与肿瘤的TNM分期、分化、浸润深度及是否转移)的关系.将培养的ESCC细胞系KYSE-30细胞随机分为空白对照组(无任何处理)、NC-IKBKE组(转染NC-siRNA)、si-IKBKE组(转染IKBKE-siRNA).CCK-8法检测KYSE-30细胞增殖能力;流式细胞术检测KYSE-30细胞凋亡率;划痕法检测KYSE-30细胞迁移能力;Transwell法检测KYSE-30细胞侵袭能力;采用qRT-PCR及WB检测KYSE-30细胞中IKBKE mRNA及蛋白水平;采用WB检测KYSE-30细胞中NF-κB通路关键蛋白NF-κB p65、磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-IKBα)表达水平.结果:ESCC组IKBKE的mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组(t=9.769、12.960,均P=0.000);IKBKE在ESCC组的mRNA及蛋白水平与ESCC的肿瘤的分化程度、TNM分期及转移有关(t=2.070～2.829,均P＜0.05),而其与性别、年龄、浸润深度无关(均p＞0.05);与NC-IKBKE组相比,si-IKBKE组KYSE-30细胞中的IKBKE的mRNA以及蛋白水平均显著降低(F=77.244、78.436,均P=0.000);成功沉默IKBKE表达的KYSE-30细胞系后,与NC-IKBKE组相比,si-IKBKE组细胞的48、72 h细胞增殖能力及24、48 h细胞迁移率均显著下降(F=12.355～44.755,均P＜0.05),与NC-IKBKE组比较,si-IKBKE组48 h细胞侵袭抑制率、细胞凋亡率均明显增加(F=155.436、46.360,均P=0.000);si-IKBKE组的NF-κB p65、p-IκBα的蛋白表达水平均显著低于NC-IKBKE组(F=139.206、55.551,均P=0.000).结论:ESCC组织中的IKBKE表达水平显著高于癌旁组织,且与肿瘤的分化程度、TNM分期及转移有关,沉默IKBKE可显著抑制ESCC细胞的增殖、迁移以及侵袭能力,促进细胞凋亡,其机制可能与IKBKE调控NF-κB通路有关.

目的 探讨核因子κb激酶亚基ε的抑制剂(IKBKE)、Yes相关蛋白1(YAP1)和转录增强结构域转录因子2(TEAD2)在结直肠癌(CRC)组织中的表达及其临床意义.方法 收集2016年1月至2017年12月在蚌埠医科大学第一附属医院手术切除的142例CRC组织及对应癌旁组织,采用免疫组化法检测标本中IKBKE、YAP1和TEAD2的表达情况.分析3种蛋白在CRC组织中表达的相关性,分析蛋白阳性率与患者临床病理参数及预后的关系;绘制Kaplan-Meier生存曲线,比较这些蛋白不同表达情况患者的生存差异.采用Cox回归分析影响患者预后的危险因素.结果 CRC组织中IKBKE、YAP1和TEAD2的阳性率均显著高于癌旁组织(65.5％比9.9％,73.9％比14.1％,66.9％比8.5％,均P＜0.05).IKBKE的表达与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤-淋巴结-远处转移(TNM)分期有关,YAP1和TEAD2的表达均与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关.Spearman秩相关分析显示CRC组织中IKBKE与YAP1、TEAD2表达均呈正相关(均P＜0.01).Kaplan-Meier生存分析显示IKBKE、YAP1和TEAD2阳性表达组的总生存率降低.Cox回归分析显示IKBKE、YAP1和TEAD2阳性、肿瘤分化程度高、TNM分期高是CRC患者预后的独立危险因素.结论 CRC中IKBKE、YAP1和TEAD2阳性表达与肿瘤的分化程度、TNM分期、转移等因素有关,可能成为CRC治疗的潜在靶点;检测这3个蛋白的表达有助于评估预后.

目的 探讨miR-21-5p对1型辅助性T细胞(Th1细胞)极化相关信号通路的调控作用.方法 提取小鼠脾单个核细胞,用免疫磁珠阴性分选试剂盒分离初始(na?ve)CD4+ T细胞,用抗小鼠CD3ε,CD28和白细胞介素4(IL-4)单克隆抗体及小鼠IL-12和IL-2混合因子诱导体系诱导初始CD4+ T细胞向Th1细胞极化,同时转染miR-21-5p模拟物或模拟物对照,分别命名为Th1诱导组、诱导+模拟物对照组和诱导+ miR-21-5p模拟物组,72 h后用流式细胞术检测CD4和干扰素γ(IFN-γ)双阳性(CD4+IFN-γ+)细胞百分比;用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Th1细胞极化相关关键转录因子和细胞因子mRNA表达水平;Western印迹法检测Th1细胞极化相关通路关键蛋白及其磷酸化水平.结合双荧光素酶报告系统验证miR-21-5p作用靶标关键细胞因子IFN-γ、信号通路受体IL-12受体β1(IL-12Rβ1)和信号转录与转录激活因子1(STAT1)的表达.结果 经免疫磁珠分选获得高表达CD62L的初始CD4+ T细胞.与Th1诱导组和诱导+模拟物对照组相比,诱导+miR-21-5p模拟物组CD4+IFN-γ+细胞百分比显著降低(P<0.01);Th1细胞极化相关Janus激酶(JAK)/STAT信号通路关键转录因子STAT1(P<0.01)、STAT4(P<0.05)和T盒21转录因子(T-bet)(P<0.01)mRNA表达显著下调,IFN-γ(P<0.01)和IL-12Rβ1(P<0.05)mRNA表达水平亦显著下调,同时STAT1和STAT4蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01).结合双荧光素酶报告系统结果表明,miR-21-5p模拟物可分别特异性靶向结合IFN-γ(P<0.01),IL-12Rβ1(P<0.01)和STAT1(P<0.05)基因的3'-非翻译区,而对应靶向位点突变后miR-21-5p模拟物不影响其表达.结论 miR-21-5p可靶向下调IFN-γ,IL-12Rβ1和STAT1表达,抑制IL-12和IFN-γ介导的JAK/STAT信号通路活化,从而抑制Th1细胞极化.

目的 探讨核因子-κB激酶抑制剂ε(IKKε)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠主动脉夹层形成过程中的作用.方法 选用C57BL/6品系载脂蛋白E(ApoE)基因敲除(ApoE-/-)小鼠和ApoE和IKKε基因双敲除(ApoE-/-IKKε-/-)两组小鼠,ApoE-/-IKKε-/-组皮下泵入AngⅡ(DA组)和生理盐水(DN组)为实验组,ApoE-/-组皮下泵入AngⅡ(AA组)和生理盐水(AN组)为对照组.分别记录各组小鼠的血压变化,统计各组小鼠死亡率并观察各组小鼠血管的形态学改变.结果 AN、DN组小鼠血压值无明显异常改变,且小鼠无死亡.AN、DN组小鼠主动脉血管壁结构完整,未见异常的病理学改变.AA、DA组小鼠血压升高,且与DA组比较,AA组血压升高更明显(P=0.000);AA组小鼠无死亡,DA组4只小鼠于1周内死亡(P =0.000);AA、DA组小鼠血管壁均呈现不同程度的病理学改变,但与AA组比较,DA组小鼠血管壁明显增厚,中膜层平滑肌缺失增加(DA组小鼠血管壁肌肉缺失程度比AA组小鼠血管壁肌肉缺失程度:4.50±1.12比1.50 ±0.93,P=0.000),细胞外基质降解程度严重(DA组弹力蛋白降解程度比AA组弹力蛋白降解程度:2.25±0.66比0.63±0.74,P=0.000).结论 在AngⅡ诱导小鼠主动脉夹层模型中,IKKε的缺失促进实验小鼠主动脉夹层的形成.

蛋白激酶C(PKC)Epsilon(PKCε)是新型PKC家族中的主要同功酶之一.PKCε的磷酸化是PLC介导的磷酸肌醇水解激活过程,主要发生在激活环(苏氨酸566)、C端疏水位点(丝氨酸729)和自我磷酸化位点(苏氨酸710)等3个保守位点.PKCε可通过激活转录核因子红系2相关因子2调控血红素加氧酶表达;被丝苏氨酸磷酸化可升高线粒体醛脱氢酶2活性,对脑中风起保护作用.同时PKCε可通过调节BDNF/TrkB路径、调控离子通道的关闭发挥抗缺血性损伤的神经保护作用.PKCε可通过抑制载脂蛋白E4(APOE4)的表达,进一步抑制下游突触生成底物BDNF表达,逆转Aβ低聚物和APOE4诱导的HDAC的核易位参与阿尔茨海默病的发生、发展.PKCε可激活细胞外信号调节激酶,促进海马神经元CA1区突触可塑性长时程增强参与学习和记忆过程.PKCε是引起运动神经元损伤的一个上游信号,可显著增强了外周蛋白的聚集,促进星形胶质细胞中mGluR5激活的钙震动丢失,导致神经细胞凋亡,最终参与肌萎缩侧索硬化症的发生发展.

目的 探讨结直肠癌组织中核因子κB激酶亚单位ε抑制剂(IKBKE)和叉头框蛋白 O3 (FOXO3)的表达及与临床病理特征和生存预后的关系.方法 应用免疫组织化学染色方法检测该院2013年1月至2014年1月79例结直肠癌组织中IKBKE和FOXO3的表达,分析其临床意义.结果 结直肠癌组织中IKBKE的表达与结直肠癌患者的性别、年龄及肿瘤浸润深度无关(P>0.05),与分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移相关(P<0.05).结直肠癌组织中FOXO3的表达与结直肠癌患者的性别、年龄及肿瘤浸润深度无关(P>0.05),与分化程度、TNM分期及有无淋巴结转移相关(P<0.05).IKBKE与FOXO3表达呈负相关(P<0.01,r=-0.41).生存曲线及Cox回归模型显示,IKBKE与FOXO3 作为结直肠癌患者的独立预后危险因素均不确切(P>0.05). 结论 联合检测IKBKE和FOXO3在结直肠癌组织中的表达,有助于判断结直肠癌的恶性程度及转移潜能.

目的 探讨氨来呫诺(ALX)引起肾性尿崩症(CNDI)的机制.方法 观察ALX对野生型大鼠(WT组)、KKε基因敲除大鼠(KL组)日尿量、日饮水量、尿比重、尿离子含量,血清抗利尿激素(ADH)的影响.Western印迹检测SD大鼠肾脏核因子-κB抑制物激酶(IKK)ε、水通道蛋白(AQP)2的蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测IKKε、AQP2 mRNA的表达.利用去氨加压素(dDAVP)实验和禁水实验观察尿量、尿比重.结果 两组给予ALX灌胃后大鼠日饮水量、日尿量、AVP较灌胃前均明显增加(P<0.01;P<0.05),尿比重、尿离子较灌胃前均明显降低(P<0.01);ALX诱导的多尿具有时间依赖性.WT组ALX灌胃后肾脏IKKε表达显著降低(P<0.05),两组灌胃后AQP2的蛋白表达较灌胃前明显降低(P<0.05).ALX灌胃后两组dDAVP实验和禁水实验对尿量、尿比重无明显影响(P<0.05).结论 ALX诱导CNDI的发生与AQP2表达降低有关,与IKKε无关.

研究蓝萼甲素(glaucocalyxinA,GLA)对肥大细胞介导的过敏反应的影响.动物福利和实验过程均遵循延边大学动物伦理委员会的规定.动物实验采用BALB/c小鼠耳部皮内注射anti-DNP-IgE(anti-dinitrophenyl-immunoglobulin E)致敏,尾静脉注射DNP-HSA(human serum albumin)和4％伊文思蓝混合液激发制备动物皮肤被动过敏反应(passive cutaneous anaphylaxis,PCA)模型,收集双耳用于测量染料着色和组织学.细胞实验选用大鼠腹腔肥大细胞(rat peritoneal mast cells,RPMCs),分为对照组、IgE+antigen(Ag)组和IgE+Ag+GLA组,测定组胺释放以及钙内流水平.Westernblot法检测高亲和力IgE受体(FcεRI)介导的信号通路蛋白及HMGB1/TLR4/NF-κB(high mobility group box 1/toll like receptor 4/nuclear transcription factor kappa B)信号蛋白.动物实验结果提示,GLA抑制小鼠PCA反应,减少伊文思蓝染料渗出,减轻耳朵炎症反应及耳朵厚度.细胞实验结果提示,GLA能减少组胺释放及钙离子内流,并抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-4、IL-13和IL-1β生成;Western blot实验结果显示GLA可抑制FcεRI介导的脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)、Lck/Yes新型酪氨酸激酶(Lck/Yes novel tyrosine kinase,Lyn)、酪氨酸激酶Fyn(tyrosine kinase,Fyn)、生长因子受体结合蛋白2(growth-factor receptor-bound protein 2,Gab2)和磷脂酶C-γ1(phospholipase C-yl,PLCyl)的磷酸化水平,同时GLA抑制HMGB1/TLR4信号通路使NF-κB p65核转移受限.结果表明,GLA通过HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路抑制肥大细胞脱颗粒并减轻过敏性炎症.

目的:检测降糖消渴颗粒干预后的2型糖尿病小鼠肝组织胰岛素信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)信号通路、核因子κB(NF-κB)信号通路相关指标表达的变化,探讨其改善糖尿病状态下肝脏脂代谢的可能途径.方法:40只8周龄雄性KK-Ay小鼠,高脂饲料喂养4周,诱导2型糖尿病发生,尾静脉取血测量空腹血糖,以空腹血糖≥13.9mmol/L作为糖尿病成模标准.将40只糖尿病小鼠随机分为模型组、吡格列酮组及降糖消渴颗粒低(1.75 g/kg)、中(3.50 g/kg)、高(7.00 g/kg)剂量组,每组8只,灌胃给药治疗10周.8只同周龄雄性C57BL/6J小鼠作为正常组,普通饲料喂养.治疗结束后,肝组织取材,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测小鼠肝脏胰岛素受体底物-1(IRS-1)、蛋白激酶Ce(PKCε)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、NF-κB、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA表达情况.结果:与正常组比较,模型组NF-κB、TNF-α mRNA上升,IRS-1、AMPKα、PPARα mRNA降低,差异均有统计学意义(P＜0.01).与模型组比较,吡格列酮组IRS-1、AMPKα mRNA上升,差异均有统计学意义(P＜0.01);降糖消渴颗粒高剂量组PKCe mRNA降低,PPARα mRNA上升,差异均具有统计学意义(P＜0.01);降糖消渴颗粒中剂量组AMPKα mRNA上升,NF-κB、TNF-α mRNA降低,差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);降糖消渴颗粒低剂量组AMPKα mRNA上升,NF-κB、TNF-α mRNA降低,差异均具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05).结论:降糖消渴颗粒可上调糖尿病状态下小鼠肝细胞内AMPKα mRNA的表达,同时抑制NF-κB炎症信号通路的激活,调节肝脏脂质代谢;其中低、中剂量降糖消渴颗粒综合效果较好.

目的:探讨黄芪对于大黄诱导腹泻大鼠肠道炎症、肠道屏障和肠道菌群的治疗作用,并阐明其可能的作用机制.方法:50只大鼠随机分为对照组、模型组、阳性对照组(2.468 g·kg-1参苓白术散)、低剂量(1.35 g·kg-1)黄芪组和高剂量(2.70 g·kg-1)黄芪组,每组10只.采用大黄灌胃结合饮食不节复制大鼠腹泻模型,检测各组大鼠体质量、粪便含水量和腹泻评分;HE染色观察各组大鼠结肠组织病理形态表现,Western blotting法检测各组大鼠结肠组织中蛋白酶激活受体2(PAR-2)、磷酸化p38(p-p38)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)、闭锁蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)、Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、髓样分化因子88(MyD88)和核因子κB(NF-κB)蛋白表达水平;采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组大鼠血清中胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、丙二醛(MDA)和分泌型免疫球蛋白A(SIgA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性;16S r DNA基因测序分析各组大鼠肠道菌群情况.结果:与对照组比较,模型组大鼠体质量明显降低(P<0.01),粪便含水量和腹泻评分明显升高(P<0.01),血清中MTL和GAS水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组、低剂量黄芪组和高剂量黄芪组大鼠体质量明显升高(P<0.01),粪便含水量和腹泻评分明显降低(P<0.01),血清中MTL和GAS水平明显降低(P<0.01).HE染色,与对照组比较,模型组大鼠结肠组织上皮黏膜损伤,有大量炎症细胞浸润,腺体排列紊乱;与模型组比较,阳性对照组和高剂量黄芪组大鼠结肠组织上皮黏膜结构较规则,炎症细胞浸润较少,未见明显腺体紊乱,低剂量黄芪组大鼠结肠组织上皮黏膜结构可见轻微损伤,有部分炎症细胞浸润,腺体排列较整齐.Western blotting法检测,与对照组比较,模型组大鼠结肠组织中PAR-2、MLCK、TLR4、TRAF6、MyD88、NF-κB、p-p38和p-MLC蛋白表达水平明显升高(P<0.01),ZO-1和Occludin蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组、低剂量黄芪组和高剂量黄芪组大鼠结肠组织中PAR-2、MLCK、TLR4、TRAF6、MyD88、NF-κB、p-p38和p-MLC蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01),ZO-1和Occludin蛋白表达水平明显升高(P<0.01).与对照组比较,模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平明显升高(P<0.01),IL-10和SIgA水平及SOD活性明显降低(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组、低剂量黄芪组和高剂量黄芪组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平明显降低(P<0.01),IL-10和SIg A水平及SOD活性明显升高(P<0.01).肠道菌群检测,在门水平上,与对照组比较,模型组大鼠肠道菌群中变形菌门和疣微菌门丰度明显升高(P<0.01);与模型组比较,低和高剂量黄芪组大鼠肠道菌群中变形菌门和疣微菌门丰度明显降低(P<0.01),高剂量黄芪组大鼠肠道菌群中ε-变形菌门丰度明显升高(P<0.01).结论:黄芪对大黄诱导的腹泻模型大鼠有治疗作用,其机制可能与通过TLR4/TRAF6/NF-κB信号通路抑制肠道炎症,进而修复肠道屏障,恢复肠道菌群组成有关.