目的 优化灵芝固态发酵三七渣产漆酶工艺.方法 在单因素试验基础上,以发酵时间、发酵温度、接种量为影响因素,漆酶活性为评价指标,Box-Behnken响应面法优化发酵工艺.结果 最佳条件为发酵时间 14 d,发酵温度28.09℃,接种量 26.65%,漆酶活性为 3.612 U/g.结论 该方法稳定可靠,可为灵芝固态发酵三七渣产漆酶后期开发和应用提供依据.

以一株新分离得到的路易斯安那异射脉菌为研究材料,探究其在单一及混合木质纤维素材料条件下的漆酶活性.结果表明,不同木质纤维素材料,无论是单一还是混合的木质纤维素材料条件下,对Allophlebia ludoviciana Han 1797 漆酶活性均具有极显著的影响(P<0.001).A.ludoviciana Han 1797 在棉籽壳(M培养基)条件下的最大漆酶活性为(465.04±8.99)U/L,比其在其他单一木质纤维素材料条件下的漆酶活性高.在棉籽壳和北京杨木屑(MY 培养基)条件下,A.ludoviciana Han 1797第3天达最大漆酶活性,为(445.85±30.14)U/L,比其他混合木质纤维素材料条件下的漆酶活性均高.相对而言,A.ludoviciana Han 1797在单一的棉籽壳(M培养基)或含有棉籽壳和玉米芯(MS培养基)及棉籽壳和北京杨木屑(MY 培养基)条件下所分泌的漆酶活性均较高,表明混合木质纤维素材料的方法能够提升分离获得的路易斯安那异射脉菌的漆酶活性.

黑木耳Auricularia heimuer全日光栽培模式下,在出耳期持续的光照刺激使菌丝处在不适宜的生长环境.本研究采用不同遮光程度的黑菌袋,设置 CK(正常菌袋,0%遮光)、T1(50%遮光)、T2(70%遮光)和T3(90%遮光)共4个处理,分析黑木耳菌丝在不同遮光程度下对黑木耳子实体的农艺性状、营养品质和菌丝相关酶活性的变化.结果显示,在遮光处理下黑木耳原基形成时间相对缩短、出耳整齐、未出芽数减少,各处理第一茬产量呈显著性差异,CK处理为22.09 g,T1处理为25.20 g,T2处理为25.35 g,T3处理为25.58 g;遮光处理下不同时期菌丝的漆酶、羧甲基纤维素酶、半纤维素酶及淀粉酶活性显著高于CK处理,在采收期木质素、纤维素和半纤维的含量低,同时保持着较高的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase activity,CAT)活性,丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量低,缓解了对机体的损伤,与CK处理呈显著性差异,其中T1 处理和T2 处理表现较好;遮光处理下子实体的粗蛋白含量、氨基酸含量较高,CK处理的粗脂肪含量较高,各处理存在差异.本研究重点讨论黑木耳菌丝在出耳期持续光照胁迫对子实体生长发育的影响,为黑木耳栽培提供一种更高效的栽培方式.

为获得适宜的野生中国皱木耳液体发酵培养基,在常规液体 PDA 培养基中添加一定量的植物碳氮源浸提液,通过对不同碳氮源及其添加量和正交试验筛选,结果表明培养基中同时添加植物碳源小麦 5 g/L和氮源麦麸 10 g/L的配方组合培养 6 d时,其菌丝球生物量干重最高[(1.158 0±0.156 6)g/100 mL],菌丝球密度高,大小均一;比CK[(0.594 8±0.054 7)g/100 mL]提高了 94.69%.各配方漆酶活性 9 d内的酶活大小及变化与CK相比有显著不同,植物碳氮源添加物对漆酶的产生有一定的诱导效果,不同诱导培养基下发酵产漆酶活性除玉米粉和CK基质出现先升后降的趋势外,其余均随培养时间的增加,总体呈低幅度的下降趋势.本研究将为中国皱木耳的人工栽培液体菌种生产提供一定的理论基础.

为开发能高效降解游离棉酚的酶蛋白.从土壤中筛选得到一株Bacillus amyloliquefaciens XP-13,从其基因组扩增获得了基因BmLac,进而构建Ppic9k-BmLac重组质粒,将其导入毕赤酵母GS115 实现了异源表达,对漆酶BmLac的酶学特性、棉酚降解效果进行研究.结果表明,以ABTS为底物时,该酶的最适反应条件为pH 4,55℃,最适条件下酶活是 101.56 U/mL;在 90℃下孵育 1 h后,相对酶活仍保留 70%以上;在pH 3-7 孵育 1 h,其相对酶活均保留 96%以上.1 mmol/L的Cu2+能使该酶酶活提高1.93 倍,但高浓度(10 mmol/L)的Fe2+、Fe3+和Al3+完全抑制该酶活性.在 55℃下反应 2 h后,该酶对棉酚的降解率高达 94.57%(无介体)和 98.73%(有ABTS).综上,漆酶BmLac具有良好的热稳定性和广泛的pH适应性,并能有效降解棉酚,该酶为有效降解棉籽粕中的游离棉酚提供基础支撑.

为探讨双孢蘑菇生产过程木质纤维素的利用情况,以麦草秸秆、玉米秸秆和杂草秸秆为主料的3种不同配方的培养料为研究材料,分别测定各配方培养料不同时期主要胞外木质纤维素降解酶活性和木质纤维素组分(纤维素、半纤维素和木质素)的相对含量,并统计各配方产量.结果显示,麦草配方(FWS)的纤维素酶总活性和木聚糖酶活性不断升高,出菇期达到稳定;玉米秸秆配方和杂草配方堆肥期的纤维素酶总活性保持在1 U/g左右,发菌期大幅升高,出菇期先稳定后下降,木聚糖酶活性始终保持在7.97-23.85 U/g之间;3个配方的漆酶活性在堆肥期未检测到,发菌期升至最高,出菇期快速降低.3个配方堆肥期纤维素和半纤维素的相对含量明显下降,木质素相对含量则几乎不变.发菌及出菇期木质素与半纤维素的相对含量较纤维素的下降明显.3个配方双孢蘑菇的产量关系为麦草配方(30.00 kg/m2)＞玉米秸秆配方(17.21 kg/m2)＞杂草配方(16.67 kg/m2).本研究表明堆肥期主要为堆肥微生物及物理化学作用降解纤维素和半纤维素,发菌期则主要是双孢蘑菇菌丝利用木质素;从播种至三潮菇清床,双孢蘑菇菌丝主要利用木质素和半纤维素;本研究中麦草配方是栽培双孢蘑菇的最佳培养料,而玉米秸秆配方和杂草配方有待进一步优化.

[背景]高原湖泊因其海拔高、气压低、辐射强、氧气含量低,是一类特殊环境,而其中的微生物是高原湖泊生态系统物质循环与能量流动的重要参与者,其胞外酶活性的表现决定其适应这一特殊环境的方式与能力.[目的]对分离自云南高原湖泊抚仙湖和星云湖湖水的酵母菌进行产胞外酶活性的筛选,以期获得具有潜在应用价值的活性菌株.[方法]在5℃和25℃培养温度下,采用平板筛选法对两个湖泊酵母菌进行产胞外蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、几丁质酶、木聚糖酶、植酸酶、菊粉酶、漆酶、锰依赖过氧化物酶和木质素过氧化物酶活性的筛选.[结果]抚仙湖和星云湖的所有测试酵母菌菌株至少都能产1种胞外酶,且主要产植酸酶、菊粉酶和淀粉酶;其次为脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、锰依赖过氧化物酶和木质素过氧化物酶;产几丁质酶、蛋白酶和漆酶的酵母菌很少,星云湖酵母菌都不产漆酶.培养温度为5℃时,抚仙湖和星云湖的酵母菌产5种及5种以上胞外酶的活性菌株数均多于25℃.[结论]抚仙湖和星云湖的酵母菌产胞外酶菌株多样性丰富,胞外酶种类多样,产酶酵母菌可能参与高原湖泊生态系统的物质循环;筛选得到的产胞外酶菌株为开发与利用高原湖泊酶资源提供了良好的种质资源,具有进一步研究的价值.

前期研究发现β-胡萝卜素为阿魏蘑和胶红酵母共培养过程中提高漆酶活性的关键因子.为了探究共培养过程中β-胡萝卜素的作用机制,本论文扩增并分析了漆酶编码序列及其上游调控序列,通过qRT-PCR、双向电泳等技术对加入β-胡萝卜素条件下漆酶基因表达及相关蛋白的变化进行了研究.扩增得了到阿魏蘑漆酶基因LAC-CDS,该基因长1 566 bp,含有最为保守的漆酶特征氨基酸序列-L3;漆酶上游序列中存在若干个潜在的XRE、STRE等与胁迫响应相关的元件,它们可能对漆酶的转录进行了调控;β-胡萝卜素加入后,漆酶基因转录表达量在发酵第5d达到最高,为对照的6倍;双向电泳得到阿魏蘑胞内9个差异蛋白点,它们大多与蛋白质合成以及生物体能量代谢有关.实验结果表明β-胡萝卜素诱导了漆酶基因的高水平转录,并影响胞内多种蛋白的合成,这为进一步提高漆酶的发酵水平提供了理论依据.

利用1株糙皮侧耳Pleurotus ostreatus栽培菌株为材料,研究添加碱性木质素或者配合简单碳源或氮源后对其液体发酵产漆酶活性的影响.结果表明,不同诱导培养基对糙皮侧耳漆酶活性具有极显著的影响(P＜0.001),而且不同诱导培养基对糙皮侧耳菌丝生物量也产生了极显著的影响(P＜0.001).此外,只利用碱性木质素或者是再添加碳源葡萄糖均有利于糙皮侧耳产漆酶,既包括产漆酶酶活性的提升,同时也包括产漆酶时间的提前,但只利用碱性木质素诱导不利于菌丝生物量的积累;而富含简单碳/氮源的诱导培养基,无论是否含碱性木质素,均有利于菌丝生物量的积累,其中,富含简单碳/氮源的培养基中再添加碱性木质素后的菌丝生物量和漆酶活性均高于不添加碱性木质素时的菌丝生物量和漆酶活性.相比而言,含碱性木质素的培养基中测得的漆酶活性大部分时间下都要高于不含木质素的简单碳/氮源培养基,含碱性木质素的培养基对糙皮侧耳菌株产漆酶的诱导作用更强.

为了获得表达量高、稳定性好及染料脱色效率高的细菌漆酶,通过PCR扩增出短小芽孢杆菌LC01的漆酶基因并构建重组表达载体pPICZαA-lac,转化毕赤酵母菌株SMD1168H后利用甲醇诱导培养重组菌获得重组漆酶,纯化并分析了重组漆酶的性质.重组菌株产漆酶活性在第7天达到最高,为1390 U/L.纯化的重组漆酶分子量为65 kD,以丁香醛连氮为底物的最适反应温度和pH分别为70℃和6.8.在pH 9.0放置10d活性没有下降,在70℃保温10h后仍保留36％的酶活.Al3+、Fe3+和Mn2+完全抑制漆酶活性.在介体乙酰丁香酮参与下该漆酶能够有效脱色RB亮蓝、活性黑5和靛红,在pH 9.0时6h的脱色率达到了90％以上,表明该重组漆酶能有效应用于染料废水的脱色处理.