美国白蛾Hyphantria cunea Drury是我国重要林业害虫,寄主植物众多且分布范围广泛.本试验基于重组酶聚合酶扩增(RPA)和CRISPR检测技术,构建美国白蛾RPA-CRISPR/Cas12a分子检测体系.根据NCBI数据库中的美国白蛾及近缘种、近似种线粒体CO Ⅰ基因片段信息以及昆虫样本CO I基因测序比对结果为模板,设计美国白蛾特异性RPA引物和CrRNA,通过RPA扩增目标序列,结合CRISPR检测技术并对反应条件进行优化,最终该体系灵敏度可检测的最低限度1.0×10-1 ng/μL,较RPA结合普通凝胶电泳提高了100倍,检测体系在30 min内即可实现对害虫的现场快速、可视化、精准鉴定.为美国白蛾现场检测提供理论和实践依据,有助于保护森林资源和生态环境的安全.

目的 评估亚洲璃眼蜱在普氏野马分布区域传播疾病的潜在风险,研究雌、雄蜱在宏基因组水平的特征并进行病原体分析.方法 2022年4月,在新疆卡拉麦里山有蹄类自然保护区使用"守株待蜱"法采集硬蜱,利用体视镜进行形态学鉴定,提取48只蜱(雌、雄各24只)DNA,PCR扩增线粒体细胞色素C氧化酶第1亚基(COⅠ)序列进行分子生物学鉴定.将雌、雄亚洲璃眼蜱分组进行宏基因组测序,非冗余基因集与非冗余蛋白(NR)数据库进行比对,分析蜱携带的微生物群落组成;与京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库和抗生素抗性基因数据库(ARDB)进行比对,获取蜱及蜱传病原体的基因功能注释结果以及抗生素抗性功能注释结果.数据的比较采用t检验分析.结果 共采集硬蜱124只,经形态学鉴定亚洲璃眼蜱成虫119只.硬蜱DNA扩增出约700 bp的阳性条带,经测序与亚洲璃眼蜱(GenBank:MH459386.1)的序列一致性为99％～100％.宏基因组测序经质控过滤共获得469 327 812条序列读长,开放阅读框预测得到836 843～1 094 994条序列.NR数据库比对结果显示,亚洲璃眼蜱携带的细菌菌落丰度占注释到的总群落丰度的99.13％,共注释到细菌32门2 040种,变形菌门和放线菌门为优势菌门,分别占细菌群落丰度的51.52％和44.35％;嗜吞噬细胞无形体为优势菌种,占细菌群落丰度的16.35％.病毒菌落丰度占注释到的总群落丰度的0.004％,共注释到病毒5 门 21种.雌蜱和雄蜱携带的细菌群落和病毒群落的丰富度及多样性差异均无统计学意义(t=-1.180、-1.729,均P＞0.05).KEGG基因功能注释到亚洲璃眼蜱新陈代谢基因占比最高(54.38％),主要的功能条目为氨基酸代谢、碳水化合物代谢、膜转运等;共识别出11 352种蛋白通路,其中154种蛋白通路在雌蜱和雄蜱间的差异有统计学意义(t=-2.348,P＜0.05).ARDB注释到亚洲璃眼蜱携带154种抗生素抗性基因,包括49种抗性基因类型,主要抗性基因类型为Baca(占62.53％),抗生素类型为肝菌肽.大部分注释到的抗性基因与多重耐药相关,如Mexf、Mexb、Emrd、Mexw等.雌蜱和雄蜱在抗生素抗性基因类型的差异性对比结果显示,仅雌蜱的Emrd基因抗性高于雄蜱(t=-7.558,P＜0.05).结论 本研究在宏基因组水平上揭示了亚洲璃眼蜱携带的主要细菌、病毒群落及多重耐药相关的抗生素抗性基因,雌蜱及其携带的病原体具有较高的物种丰度和基因丰度.

目的:基于单细胞转录组测序(scRNA-seq)探讨小鼠脉络膜新生血管(CNV)中内皮细胞(EC)的分子表达与病理特征。方法:取6只6~8周龄C57BL/6小鼠按照随机数字表法随机分为2个组，每组3只，处死后摘取双眼眼球，分别采用剪碎脉络膜巩膜复合体法和刮取脉络膜法分离脉络膜组织，采用胰蛋白酶/Ⅰ型胶原酶37 ℃连续消化制得单细胞悬液，流式细胞术检测细胞活率及EC比例，确定单细胞悬液制备方法。选取6只小鼠随机分为正常对照组和CNV组，每组3只，其中CNV组小鼠建立激光诱导的CNV模型；于造模后7 d制备单细胞悬液，采用10xGenomics进行单细胞分离并构建测序文库，Illumina Novaseq6000进行高通量测序，获得基因表达矩阵；根据文献报道并参考Cellmarker数据库定义细胞亚群；选取EC亚群进行拟时序分析，生成各个细胞分化状态(State)的基因表达矩阵，筛选CNV-EC并初步分析表达特征。另选取6只小鼠建立CNV模型，于造模后7 d取小鼠眼球制备冰冻切片，免疫荧光染色检测EC标志物Pecam1与线粒体外膜蛋白Tomm20、mt-Co1和毛细血管标志物Kdr、Plvap的共定位及面积占比情况，并统计血管直径。结果:剪碎复合体和刮取脉络膜所制备单细胞悬液的细胞活率分别为99.4%和99.1%，符合测序要求；流式细胞术检测EC占比约为1.58%。scRNA-seq结果显示，正常对照组和CNV组小鼠脉络膜均包含13个细胞亚群，与正常对照组比较，CNV组视锥/视杆细胞、EC和造血系细胞比例增加，视网膜色素上皮(RPE)细胞和施万细胞比例相应减少。在所有细胞亚群中，EC比例为18.40%。EC拟时序分析显示，脉络膜EC可分为4个State，CNV组中位于State 2状态的EC比例为29.1%，较正常对照组的9.5%明显升高；差异基因分析显示，State 2 EC中线粒体相关基因 mt-Nd4和 mt-Atp6等表达上调而毛细血管基因 Kdr和 Esm1等表达显著下调。免疫荧光染色结果显示，CNV区域内Tomm20和mt-Co1在Pecam1阳性EC内表达分布面积比例分别为(19.50±4.68)%和(4.64±2.82)%，明显高于正常区域的(3.00±2.09)%和(0.18±0.34)%，差异均有统计学意义( t＝7.88、3.84，均 P<0.01)。CNV区域内Kdr和Plvap在Pecam1阳性EC内表达面积比例分别为(1.50±0.29)%和(0.79±0.97)%，明显低于正常区域的(31.30±5.44)%和(10.43±2.28)%，差异均有统计学意义( t＝13.40、9.48，均 P<0.01)。CNV区域血管直径为(5.52±1.85)μm，明显大于正常区域的(4.21±1.84)μm，差异有统计学意义( t＝9.57， P<0.001)。 结论:CNV发生时，脉络膜组织中EC比例增加，CNV-EC呈现线粒体代谢活化和毛细血管特性丢失的病理特征，提示EC线粒体活化可能在CNV生成中具有一定的作用。

目的:探讨钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)介导的Parkin依赖型线粒体自噬对多巴胺(DA)能神经元凋亡及细胞周期的调控作用。方法:将SH-SY5Y细胞分为模型组、对照组、CacyBP/SIP组，其中模型组细胞用1-甲基-4-苯基吡啶(MPP +，0.5 mmol/L)处理24 h，对照组及CacyBP/SIP组细胞分别模型组细胞基础上进一步转染空载慢病毒或CacyBP/SIP-sgRNA慢病毒。采用Western blotting实验检测各组细胞中CacyBP/SIP、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)、磷酸酶张力蛋白诱导激酶1(Pink1)、Parkin、P53、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平，采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡水平及细胞周期情况，采用免疫荧光单染法检测各组细胞中LC3、LAMP2的表达情况，采用免疫荧光双染法检测各组细胞中CacyBP/SIP与Parkin的共表达情况。 结果:与模型组、对照组比较，CacyBP/SIP组CacyBP/SIP、LAMP2、Pink1、Parkin蛋白的表达明显减少，LC3-Ⅱ/Ⅰ值明显降低，LC3-Ⅱ、LAMP2的免疫荧光染色强度明显降低，Bcl-2蛋白表达明显减少，Bax蛋白表达明显增加，Bcl-2/Bax值明显降低，细胞凋亡率明显提高，P53蛋白的表达明显增加，G1期细胞占比明显增加，CacyBP/SIP与Parkin共表达的免疫荧光染色强度明显降低，差异均有统计学意义( P<0.05)。 结论:敲除 CacyBP/SIP基因后，Parkin蛋白降低导致细胞阻滞于G1期，并介导Parkin依赖型线粒体自噬功能降低，从而导致细胞凋亡水平提高。

目的:观察狼疮鼠肝脏组织细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（MT-CO1）、BCL2相互作用蛋白3（BNIP3）和IL-1β表达特点及其意义。方法:以实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测狼疮鼠和对照鼠MT-CO1和BNIP3、IL-1β、线粒体微管相关蛋白1轻链3β（LC3B）、p16和p21的mRNA和蛋白水平，苏木精-伊红（HE）染色和免疫组织化学法检测狼疮鼠肝组织，免疫组织化学明确IL-1β在狼疮鼠肝组织的炎症损害表达部位，比色法检测2组肝组织丙二醛表达差异；以脂多糖刺激肝细胞和巨噬细胞，同时以脂多糖刺激巨噬细胞后上清液培养肝细胞，实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测上述基因蛋白表达，比色法检测各组肝细胞丙二醛表达差异。免疫荧光检测线粒体活性氧（mtROS）表达。各组均数比较使用单因素方差分析法，多个样本均数之间的两两比较，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Tamhane′s T2法。 结果:PCR结果显示，狼疮鼠肝组织MT-CO1和BNIP3的mRNA（0.14±0.04；0.16±0.05）较对照组（0.11±0.04；0.16±0.06）表达明显下降，差异具有统计学意义（ t=7.16， P<0.001； t=4.54， P<0.001），狼疮组IL-1β、p16和p21（2.06±0.69；0.37±0.14；0.16±0.06）较对照组（0.23±0.07；0.25±0.08；0.11±0.04）表达显著增高，差异具有统计学意义（ t=9.58， P<0.001； t=24.35， P<0.001； t=22.36， P<0.001）。蛋白质印迹法结果与PCR结果趋势一致。HE染色显示狼疮鼠肝组织中有淋巴细胞浸润，免疫组织化学显示狼疮鼠肝组织中IL-1β阳性细胞主要集中在血窦中，肝实质细胞表达不明显。狼疮组肝组织丙二醛的含量（0.19±0.10）高于对照组（0.17±0.09），差异具有统计学意义（ t=4.33， P=0.005）。与对照组（0.176±0.072；0.08±0.03）相比，脂多糖直接刺激AML12肝细胞MT-CO1、BNIP3 mRNA表达（0.069±0.028；0.17±0.07）无明显变化，差异无统计学意义（ t=1.01， P=0.337； t=0.88， P=0.399）；脂多糖刺激巨噬细胞IL-1β（0.28±0.09）较对照组（0.15±0.05）表达增高，差异具有统计学意义（ t=28.26， P<0.001）。以脂多糖刺激巨噬细胞12 h后的上清培养肝细胞24 h，MT-CO1和BNIP3在脂多糖刺激组的mRNA水平（0.046±0.026；0.17±0.05）较对照组（0.144±0.083；0.18±0.06）表达明显下降，差异具有统计学意义（ t=7.52， P<0.001； t=4.24， P<0.001），脂多糖刺激组p16和p21（0.29±0.09；0.27±0.09）较对照组（0.18±0.06；0.22±0.07）表达增高，差异具有统计学意义（ t=13.54， P<0.001； t=8.69， P<0.001）。蛋白质印迹法结果与PCR结果趋势一致。免疫荧光提示脂多糖刺激组（0.25±0.10）mtROS荧光强度高于对照组（0.08±0.03），差异具有统计学意义（ t=4.86， P<0.001）。 结论:狼疮鼠肝脏免疫炎症可以刺激肝脏实质细胞发生细胞内线粒体功能损害，狼疮鼠肝脏器官损害机制不止局限于免疫活性细胞的免疫炎症，还有实质细胞线粒体功能障碍共同参与。

目的 发现严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)木瓜样蛋白酶(PLpro)的宿主互作分子,探索其生物学意义.方法 邻近蛋白标记结合质谱分析筛选宿主互作分子DEAD-box解旋酶3(DDX3);免疫荧光法分析PLpro与DDX3的胞内共定位;免疫共沉淀法分析PLpro与DDX3的相互作用,以及PLpro对DDX3与IκB激酶ε(IKKe)和TANK结合激酶1(TBK1)、DDX3与线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)互作的影响;荧光素酶报告基因法检测PLpro对β干扰素(IFN-β)通路的影响和对底物的酶切效率.结果 DDX3能够与PLpro发生细胞内共定位和相互作用;PLpro可能抑制DDX3-MAVS复合体形成,抑制DDX3-IKKε-TBK1之间的相互作用,负调控Ⅰ型干扰素通路;DDX3过表达情况下,PLpro/PLP-TM对底物位点的切割效率显著升高,而DDX3表达降低时,切割效率则显著降低.结论 DDX3可能是PLpro的宿主相互作用分子之一;PLpro负调控DDX3活化的IFN-β表达,为病毒复制提供有利的免疫环境,提升蛋白酶切割活性,共同促进病毒复制.

宝天曼国家级自然保护区独特的地理位置和气候条件使其成为生物多样性研究热点地区之一,但关于该地区蚯蚓物种多样性的研究却十分匮乏.本研究在系统调查宝天曼国家级自然保护区蚯蚓物种的基础上,联合5个线粒体基因(COⅠ、COⅡ、ND1、12S、16S)构建蚯蚓系统发育树,并结合海拔、土壤、凋落物质量等环境因素建立结构方程模型,初步探讨了宝天曼蚯蚓多样性形成的主要影响因素.研究结果表明:(1)宝天曼国家级自然保护区共记录到蚯蚓3科5属14种,多为广布种,其中巨蚓科为优势科;(2)蚯蚓物种数随海拔升高而增加,但500-1,000 m海拔段的蚯蚓α多样性更高,分布也更均匀,符合中间高度膨胀格局;(3)在局域尺度上,海拔高度对蚯蚓物种多样性和系统发育多样性的影响较大,其次为土壤性质和凋落物质量.宝天曼国家级自然保护区蚯蚓物种组成及多样性成因的研究丰富了我国蚯蚓物种库和基因库.

黑条小车蝗[Oedaleus decorus decorus(Germar)]是新疆温性荒漠草原最为重要的蝗害之一,目前关于新疆该蝗种群的遗传多样性和亲缘关系尚不明确.测定了新疆黑条小车蝗14个地理种群194条序列的线粒体COⅠ和ND5基因,通过单基因和联合基因分析比较新疆该蝗的遗传多样性和遗传分化情况,并基于可信度高的联合基因探讨新疆该蝗种群可能的扩散路径.黑条小车蝗14个地理种群的COⅠ和ND5联合基因均表现出高遗传多样性(Hd为0.904 8～1.0000,Pi为0.010 0～0.341 5),且各种群间遗传分化较大,基因交流不充分(Fst为0.385 1,Nm为0.40).种群间的遗传差异来源于种群内部(80.03％),并且地理距离可能不是影响种群间遗传距离的主要因素.综合遗传多样性分析,单倍型网络图和系统发育树结果显示联合基因较于单基因可信度更高.新疆黑条小车蝗遗传分化较高的种群可能主要由地形地貌所致,遗传分化较低的种群可能受西北季风影响;新疆黑条小车蝗种群的早期建立种可能来源于伊犁地区,一支经天山山脉扩散至博乐、乌市及哈密地区,另一支由塔城地区经准噶尔盆地扩散至富蕴县.

2019年6月8日,在云南省罗平县多依河村采集到3号树蛙科Rhacophoridae原指树蛙属Kurixalus物种标本.标本为雄性,体型较小,吻端较尖;鼓膜明显且圆;眼大,瞳孔横置;背部皮肤粗糙;泄殖孔下方具圆疣;第4指、掌部、前臂、第5趾、跖和跗的外侧均具有顶端白色的锯齿状缘膜;背面深褐色为主,四肢有深褐色横斑,两眼间有三角形黑斑;后背有一瓶形斑纹,腹面满布深色大斑点;单咽下内声囊.经过形态特征比较,并基于线粒体COⅠ基因片段构建的原指树蛙属部分物种的系统发育分析结果,鉴定这些标本为海南原指树蛙K.hainanus,是云南省两栖动物新记录.本研究扩展了对海南原指树蛙的分布范围的认知,为该物种的生物多样性研究、保护、管理,以及利用积累了重要基础数据.

目的 明确疏肝补肾毓麟汤畅通自噬流,通过PTEN诱导假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)/帕金蛋白(Parkin)通路,调节线粒体功能,提高精子活力的作用机制.方法 通过随机数字表法将SD大鼠分为正常组、模型组、疏肝补肾毓麟汤高剂量组、疏肝补肾毓麟汤低剂量组、五子衍宗丸对照组.采用腺嘌呤(0.05 g·kg-1)灌胃14 d,复制少弱精症大鼠模型.正常组与模型组给予等容0.9％氯化钠溶液,疏肝补肾毓麟汤高、低剂量组给药32.4 g/(kg·d)、8.1 g/(kg·d),五子衍宗丸对照组给药2.6 g/(kg·d).全自动精子分析仪检测精子活力,透射电镜观察睾丸组织中线粒体自噬的超微结构变化、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒与流式细胞仪检测线粒体膜电位水平变化、免疫荧光标记线粒体外膜易位酶20(Translocase of the outer membrane of mitochondrion 20,TOMM20)与微管相关蛋白 1 轻链3Ⅱ(Microtubule-associat-ed protein 1 light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)的共定位、PCR 与 Western Blot 检测睾丸组织 PINK1、Parkin、选择性自噬接头蛋白 62(Se-lective autophagy adaptor protein 62,P62)、微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3Ⅱ/Ⅰ)的表达.结果 与正常组相比,模型组的精子活动力下降(P＜0.05),线粒体膜电位比例下降(P＜0.05),线粒体超微结构出现核周聚集,嵴受损或丢失,除了碎裂外,还有暗基质,以及外膜不规则,并且受损的线粒体与包括线粒体吞噬体在内的线粒体空泡相关,免疫双染中发现LC3Ⅱ的存在量明显增多,LC3Ⅱ与TOMM20的双重标记也增加,自噬相关指标PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的基因与蛋白表达增加(P＜0.05).与模型组相比,疏肝补肾毓麟汤高剂量组、疏肝补肾毓麟汤低剂量组、对照组的精子活动力升高(P＜0.05),线粒体膜电位比例增加(P＜0.05),超微结构下正常形态的线粒体比例明显增多,且线粒体溶酶体的数量也减少,免疫双染中发现LC3Ⅱ的存在量明显减少,LC3Ⅱ与TOMM20的双重标记减少,自噬相关指标PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的基因与蛋白表达减少(P＜0.05).与对照组相比,高剂量组的线粒体膜电位比例增加(P＜0.05);疏肝补肾毓麟汤高剂量组、疏肝补肾毓麟汤低剂量组超微结构下正常形态的线粒体比例明显增多,且线粒体溶酶体的数量也减少,免疫双染中发现LC3Ⅱ的存在量明显减少,LC3Ⅱ与TOMM20的双重标记减少,自噬相关指标PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的基因与蛋白表达减少(P＜0.05).结论 疏肝补肾毓麟汤能改善精子活力低下症模型大鼠的精子活动力,可能是通过提高模型大鼠的线粒体膜电位水平,保护线粒体功能,下调PINK1、Parkin、LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62的表达,并畅通自噬流,减轻线粒体的过度自噬来发挥作用.