环境水样中非甾体抗炎药(NSAIDs)的长期存在不仅会影响水生生物的生命安全,扰乱生态系统环境,而且会对人类健康构成严重威胁.采用溶剂热法首先制备了氨基功能化Fe3O4 纳米粒子(Fe3O4-NH2).随后,通过室温下水溶液中的席夫碱反应,以戊二醛为交联剂,将具有支链结构的聚乙烯亚胺(PEI)成功地接枝到Fe3O4 纳米粒子上,合成了一种可回收的PEI接枝磁性纳米吸附剂(Fe3O4@PEI)并将其应用于环境水中NSAIDs的检测.通过各种表征手段研究了Fe3O4@PEI的组成特性,并对影响NSAIDs萃取效果的参数进行了优化.Fe3O4@PEI对 4种NSAIDs具有高吸附性,与高效液相色谱联用可对环境水样中的酮洛芬、萘普生、双氯芬酸和托芬那酸 4种NSAIDs进行定量分析,在 1～500μg/mL范围内,色谱峰面积与质量浓度呈良好的线性关系,样品在 3种不同添加水平下的加标回收率在 85.6%～107.8%,日内精密度均小于 7.8%(n=6),日间精密度均小于9.5%(n=3).该方法操作简单、准确高效,可用于环境水样中非甾体抗炎药的测定.

目的:构建一种基于超分子主客体化学组装的聚集诱导发光囊泡材料（AIE-HG-Vesicle）用于递送小干扰RNA（siRNA）及实现荧光成像功能，并探究其被肿瘤细胞摄取的效果及其基于siRNA对肿瘤细胞的杀伤效果。方法:通过合成聚乙烯亚胺树型分子修饰的β-环糊精（H-β-CD-dendrimer）作为主体化合物，同时合成含有四苯乙烯AIE基团的Bola型金刚烷（G-Ada-AIE）作为客体化合物，通过超分子主客体自组装过程制备得到AIE-HG-Vesicle囊泡材料用于负载siRNA。通过透射电子显微镜及动态光散射仪测试其形貌和尺寸，通过荧光分光光度计测试其聚集诱导发光性质，通过凝胶阻滞实验测试其对siRNA的负载效果，通过激光共聚焦显微镜测试负载siRNA的AIE-HG-Vesicle囊泡材料在肿瘤细胞内的递送效果，并通过MTT实验测试负载siRNA的AIE-HG-Vesicle囊泡材料对肿瘤细胞的杀伤效果。结果:AIE-HG-Vesicle具有囊泡状形态，直径约为100 nm，壁厚约为9 nm，且表面带正电荷可有效负载siRNA。负载于AIE-HG-Vesicle的siRNA表现出良好的稳定性，且负载siRNA后的AIE-HG-Vesicle可将siRNA递送到HeLa细胞内部，并可通过聚集诱导发光现象被观测到，负载siRNA后的囊泡对HeLa细胞有明显的杀伤效果。结论:构建了AIE-HG-Vesicle可用于递送siRNA，该材料具有荧光成像和基于siRNA的肿瘤细胞毒性作用，后期有望应用于肿瘤体内治疗。

目的:构建生物合成纳泡(GVs)－聚乙烯亚胺(PEI)－骨髓间充质干细胞(BMSCs)体系，探讨其应用于干细胞超声成像示踪的潜能。方法:制备GVs－PEI，检测其直径和电势。将GVs－PEI与BMSCs共温育获得GVs－PEI－BMSCs，检测BMSCs对GVs－PEI的摄入、GVs－PEI－BMSCs的细胞增殖活性。设置GVs－PEI－BMSCs组及BMSCs组，在琼脂仿体内分别于0、2、4和6 d进行超声成像，检测体外超声成像效果；于大鼠双侧股四头肌内分别注射BMSCs及GVs－PEI－BMSCs，于注射后0、2、4和6 d进行超声成像，检测其在体成像效果。采用单因素方差分析和两独立样本 t检验处理数据。 结果:GVs－PEI直径(383.63±11.55) nm，电势(18.48±2.20) mV，倒置荧光显微镜下见GVs－PEI－BMSCs内大量GVs－PEI显影。当GVs－PEI吸光度( A) 500 nm＝0.5和1.0时，24、48和72 h的GVs－PEI－BMSCs细胞相对增殖率无明显变化( F值：7.078～11.982，均 P>0.05)。与BMSCs组相比，各时间点GVs－PEI－BMSCs组体外超声成像效果均更佳，温育后6 d的超声信号强度差异仍有统计学意义(634.29±10.78与2 864.51±100.86； t＝－121.86， P<0.001)。在体超声成像结果显示，各时间点GVs－PEI－BMSCs组超声成像能力均优于BMSCs组，注射后6 d的超声信号强度差异仍有统计学意义(2 108.02±217.96与267.71±7.87； t＝－121.39， P<0.001)。 结论:成功构建GVs－PEI－BMSCs，其超声成像能力强、稳定性高且安全，为干细胞在体示踪提供了新方案。

目的:探讨由氟化聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)衍生物构成的纳米胶束的构建、表征及其在跨血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB)进行基因递送中的作用.方法:使用PEI和七氟丁酸酐(heptafluorobutyric anhydride,HFAA)通过化学反应合成PEI-HFAA,随后通过酰胺反应连接芥子酸(sinapicacid,SA)得到产物PEI-HFAA-SA(简称SPF),最终在SPF外包裹聚山梨酯80(polysorbate 80,PS80)得到最终产物PEI-HFAA-SA@PS80(简称SPFT).通过傅里叶变换红外吸收光谱、核磁共振氟谱和核磁共振氢谱等对SPFT的分子键和元素组成进行分析,并通过动态光散射实验、琼脂糖凝胶阻滞实验和扫描电镜观察对其水合直径、质粒吸附及保护能力、载体质粒复合体的稳定性和形貌进行进一步表征.探究SPFT在小鼠神经胶质瘤细胞Neuro 2a中的基因转染效率和细胞毒性,通过尾静脉注射携带绿色荧光蛋白表达质粒的SPFT至C57BL/6J小鼠中,观察其在脑组织中的分布情况以及BBB内细胞的基因转染效果.结果:以SA和HFAA修饰以及PS80包裹的方法合成了 SFPT.检测结果显示,SPFT水动力粒径100～200 nm,并且对质粒有一定的携带和保护作用.SPFT携带质粒在体外表现出良好的转染能力和生物相容性.体内实验显示,尾静脉注射后的SPFT在小鼠大脑中有聚集现象,能够携带质粒穿越BBB并进行基因递送.结论:SPFT具有一定生物相容性和良好的穿越BBB及基因递送能力,为脑部疾病的治疗药物递送提供了新的思路.

基因治疗在恶性肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、罕见病等重大难治性疾病的治疗中表现出巨大潜力.基因递送载体是基因治疗能否成功实施的关键所在,聚乙烯亚胺(PEI)是一种被广泛研究的阳离子基因递送载体,在不同细胞系和转染条件下均展现出稳定高效的基因转染效果,其中PEI25k更被视作基因转染的"黄金标准".为解决PEI在基因递送中存在的体内转染效率低、细胞毒性大、靶向性低和负载基因溶酶体降解等问题,该文对基于PEI设计构建新型纳米递送系统用于基因治疗的研究进展进行综述,主要包括高相对分子质量线性PEI、多糖、亲水性的聚合物和右旋糖酐修饰的PEI,交联的低相对分子质量PEI,基于PEI的无机纳米递送载体以及基于PEI的药物与基因共递送载体系统,以期为进一步构建高效低毒的基因递送系统提供理论指导.

目的 将内参蛋白引入新型冠状病毒(SARS-CoV-2)荧光免疫层析检测体系,以监测样本检测各环节的有效性,提高检测准确率.方法 聚乙烯亚胺(PEI)自组装法制备硅核双层量子点微球(SiO2-DQD),分别偶联内参抗体和SARS-CoV-2检测抗体.硝酸纤维素膜双检测线上分别包被内参抗体和SARS-CoV-2的捕获抗体.基于双抗夹心免疫检测原理,构建基于内参辅助的SARS-CoV-2荧光免疫层析检测方法.结果 荧光信号结果显示,在样本检测结果有效的条件下,该方法对SARS-CoV-2抗原的检测限可达0.01 ng/ml,且具有良好的特异性、稳定性.结论 建立了快速的基于内参蛋白检测的SARS-CoV-2荧光免疫层析方法,为SARS-CoV-2抗原检测提供了质控对照,降低检测结果的假阴性率.

目的 制备针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)IgA单克隆抗体,对其表达条件进行优化以提高表达量,并初步探讨IgA抗体在抗SARS-CoV-2中的效应.方法 将编码IgA1-F61抗体序列的质粒与聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)转染试剂混合后转染EXPi293F?细胞,瞬时表达抗体蛋白;通过优化重链(heavy chain,He)、轻链(light chain,Lc)、J链(joining chain,Jc)比例、质粒与PEI比例、转染后收获时间确定单体IgA1(monomeric IgA1,mIgA1)-F61 及二聚体IgA 1(dimeric IgA1,dIgA1)-F61 在EXPi293F?细胞中的最佳培养条件以及最佳表达量.将转染后上清经亲和层析纯化后,BCA法测定浓度,SDS-PAGE及体积排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法分析抗体表达完整性及纯度,假病毒中和试验检测抗体中和活性.结果 当He与Lc比例为1∶2、质粒与PEI比例为1∶3、转染后5d收获上清时,mIgA1-F61最高表达量为123.45 μg/mL,纯化后抗体纯度达95％以上;He∶Lc∶Jc为1∶2∶1时,可获得最大纯度的dIgA1-F61,达90％以上.针对OmicronBA.4/5的假病毒中和试验结果显示,dIgA1-F61呈现优于IgG-F61的中和活性,其最大半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)降低了4倍左右.结论 成功表达了重组抗SARS-CoV-2单克隆抗体mIgA 1-F61和dIgA 1-F61,纯度较高,且dIgA 1在体外展现出优于IgG的中和活性.

基于聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的悬浮人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)转染技术前景广阔,但培养基组分会影响转染效率.简单的离心换液存在污染风险,且影响细胞状态.探究抑制转染效率的关键组分对转染过程的影响机制,有利于从根本上解决该问题.首先通过探究培养基中对转染效率具有潜在影响的组分确定关键组分柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)的抑制作用,然后通过考察柠檬酸铁铵添加对细胞状态、PEI与DNA形成的复合物(PEI-DNA complex,PEI-DNA复合物)结合情况、目的基因表达情况的影响,分析其抑制转染效率的机制.结果表明,高浓度的柠檬酸铁铵对细胞转染存在明显抑制作用,且该抑制作用随着柠檬酸铁铵浓度的升高而逐渐增强.当柠檬酸根和铁离子同时存在时才会抑制细胞转染过程.过高浓度的柠檬酸铁铵使PEI-DNA复合物的粒径显著增加,复合物进入细胞更加困难,导致进入细胞的复合物数量减少,最终引起细胞转染效率的大幅下降.柠檬酸铁铵通过影响PEI-DNA复合物的大小限制DNA进入细胞,从而抑制PEI介导的悬浮HEK293 细胞转染过程.控制转染时柠檬酸铁铵浓度在 20 μmol/L内可解决其对转染过程的抑制作用.本研究深入认识了柠檬酸铁铵对PEI介导的悬浮HEK293 细胞转染过程的影响及其机制,为悬浮HEK293 细胞转染培养基的开发和理性设计提供有力参考.

目的 构建再生基因 4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞 293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV).方法 根据 NCBI 数据库REG4 基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4 载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4 质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1 质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组.荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平.通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶 S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定.结果 经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4 构建成功.转染对照组(pEGFP-C1 质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约 50%,表明转染成功.WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4 质粒)的细胞中检测到Reg IV蛋白.镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,Sephacryl S-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白.结论 成功构建了REG4 基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础.

目的:构建高效的siRNA纳米载体靶向SGC-7901胃癌细胞,并下调胃癌表达的程序性死亡配体1(PD-L1).方法:检测叶酸(FA)-PEG-SS-PEI-SPION纳米载体与siRNA复合后的粒径、电位等表征;体外实验检验siRNA的结合能力、复合物细胞毒性、细胞摄入能力及转染效率;磁共振(MR)成像检测示踪能力;检验胃癌细胞PD-L1下调效应及共培养T细胞的细胞因子水平.结果:N/P比值为10时,FA-PEG-SS-PEI-SPION完全复合siR-NA,形成电位为(9.14±0.80)mV、粒径为(116.7±2.5)nm的多聚复合物.靶向组的转染率为(95.06±0.44)%,与非靶向组的(93.87±1.05)%相当;平均荧光强度为1892.67±81.51,高于非靶向组的1324.33±186.58(P<0.05).普鲁士蓝染色和激光共聚焦显微镜成像证实了复合物的细胞摄入.体外MR成像验证了聚合物的MR造影成像能力.靶向组PD-L1的mRNA最低相对表达量为9.07%±0.79%,Western blot显示PD-L1的表达显著降低.共培养实验显示IFN-γ和TNF-α的分泌水平增加,IL-10的分泌水平降低(P<0.05).结论:本研究构建了FA-PEG-SS-PEI-SPION纳米载体,并证明了其体外靶向细胞及载siRNA下调PD-L1表达的能力和MR示踪的能力,是一种高效和安全的靶向治疗纳米载体.