目的:探讨前列腺癌细胞内肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)的表达变化及其对侵袭转移能力的影响。方法:设计合成过表达MYPT1基因的慢病毒质粒(pLenti6.3-MYPT1)，转染前列腺癌PC3及DU145细胞48 h，设定对照组(转染对照pLenti6.3-Ctrl)和过表达组(转染pLenti6.3-MYPT1)；采用细胞划痕和Transwell实验检测24 h及48 h细胞迁移和侵袭能力；免疫荧光(IF)染色检测细胞骨架变化；蛋白质印迹法(Western blot)和定量聚合酶链式反应(qPCR)检测细胞株(PC3、DU145)转染后MYPT1和上皮-间充质转化(EMT)相关分子标志物：N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、锌指结构蛋白(Snail)和E盒结合锌指蛋白1(ZEB-1)的mRNA及蛋白相对表达水平。组间统计分析采用独立样本 t检验。 结果:转染pLenti6.3-MYPT1后，PC3和DU145细胞内MYPT1相对表达水平明显上调，差有统计学意义(Western blot：0.834±0.055、0.849±0.044比0.487±0.026、0.526±0.045， t＝8.098，7.212， P<0.01；qPCR：3.134±0.280、2.091±0.099比0.967±0.034、1.019±0.150， t＝10.860，8.449， P<0.01)。细胞划痕和Transwell实验显示转染过表达质粒后细胞迁移( t＝8.342，6.776， P<0.01)和侵袭( t＝11.670，11.870， P<0.001)能力明显减弱。免疫荧光染色表明，与对照组比较，过表达MYPT1的细胞表面变光滑，丝状伪足和片状伪足减少，F-肌动蛋白(F-actin)从细胞质富集到细胞膜，着色变浅。两细胞株过表达组N-cadherin、MMP-2、MMP-9、Snail、ZEB-1显著低于对照组( P<0.05)。 结论:过表达MYPT1能抑制前列腺癌细胞的迁移侵袭能力，其作用机制可能与细胞骨架重构及EMT相关。

探讨茯苓多糖对心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MI/RI)大鼠心肌细胞凋亡的影响及可能机制.将SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、茯苓多糖低(100 mg·kg-1)剂量组、茯芩多糖高(200 mg·kg-1)剂量组和法舒地尔组(10 mg·kg-1),每组16只.除假手术组外,其他4组均通过结扎左冠状动脉前降支30 min,再灌注2 h以构建MI/RI模型.TTC染色检测心肌梗死面积;HE染色观察心肌组织形态学变化;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况;ELISA检测血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)和白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18水平以及心肌组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malon-dialdehyde,MDA)水平;Western blot检测大鼠心肌组织中B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、裂解半胱氨酸蛋白酶-3(cleavage cysteine protease-3,cleaved caspase-3)、Ras 同源基因家族成员 A(Ras homolog gene A,RhoA)、肌球蛋白磷酸酶靶亚基 1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT-1)及磷酸化 MYPT-1(p-MYPT-1)、Rho 相关螺旋卷曲蛋白激酶 1(Rho-associated coiled-coil forming kinase 1,ROCK1)表达水平.结果显示,模型组大鼠心肌组织局灶性坏死,心肌细胞肿胀,边界不清并伴有中性粒细胞浸润,茯苓多糖低、高剂量组和法舒地尔组大鼠上述病理变化有所减轻.与模型组比较,茯苓多糖低、高剂量组和法舒地尔组大鼠心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率明显降低.与假手术组比较,模型组大鼠血清LDH、CK-MB、IL-1β及IL-18水平和心肌组织中MDA水平显著升高,Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK1及p-MYPT-1蛋白相对表达水平显著升高,心肌组织中SOD水平、Bcl-2蛋白相对表达水平显著降低;与模型组比较,茯苓多糖给药组和法舒地尔组大鼠血清LDH、CK-MB、IL-1β及IL-18水平和心肌组织中MDA水平显著降低,Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK 1及p-MYPT-1蛋白相对表达水平显著降低,心肌组织中SOD水平、Bcl-2蛋白相对表达水平显著升高.茯苓多糖对MI/RI大鼠心肌组织病理损伤、心肌细胞凋亡具有一定预防作用,这可能与抑制Rho-ROCK信号通路激活进而降低机体氧化和炎症反应有关.

目的 探讨RhoA/ROCK信号转导通路在高糖诱导大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖和胶原合成中的作用.方法 将SD大鼠肝星状细胞株HSC-T6在1640培养基中培养24 h,实验设置对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(含25 mmol/L葡萄糖)、高渗透压组(5.5 mmol/L葡萄糖 +19.5 mmol/L甘露醇)、高糖 + 法舒地尔(12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L)组.采用MTS法检测细胞增殖率;采用羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)试剂盒测定细胞上清中Hyp水平;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)测定Ⅰ和Ⅲ型前胶原mRNA的相对表达量;采用Western blot检测肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)和p38MAPK的磷酸化和总体水平.结果 与对照组相比,高糖组MYPT1(0.270±0.007 vs 0.090±0.008,P＜0.001)、ERK(0.851±0.027 vs 0.175±0.038,P＜0.001)、JNK(0.869±0.037 vs 0.488±0.022,P＜0.001)和p38MAPK(0.498±0.020 vs 0.144±0.011,P＜0.001)磷酸化水平显著增高,HSC增殖率(A值)(2.372±0.098 vs 1.588±0.087,P＜0.001)和Hyp水平(27.924±1.069 vs 17.643±0.112,P＜0.001)显著增高,Ⅰ型前胶原mRNA(2.783±0.167 vs 1.004±0.008,P＜0.001)和Ⅲ型前胶原mRNA(4.958±0.143 vs 1.098±0.014,P＜0.001)表达显著上调.与高糖组相比,高糖+法舒地尔(25 μmol/L、50 μmol/L)组MYPT1(0.110±0.007,P＜0.001;0.101±0.006,P＜0.001)、ERK(0.473±0.025,P＜0.001;0.223±0.031,P＜0.001)、JNK(0.688±0.024,P = 0.019;0.576±0.035,P＜0.001)和p38MAPK(0.350±0.021,P = 0.012;0.305±0.015,P = 0.019)磷酸化水平显著降低,HSC增殖率(A值)(1.819±0.104,P＜0.001;1.613±0.103,P＜0.001)和Hyp水平(21.430±0.714,P＜0.001;18.574±0.825,P＜0.001)显著降低,Ⅰ型前胶原mRNA(1.580±0.154,P＜0.001;1.167±0.157,P＜0.001)和Ⅲ型前胶原mRNA(3.166±0.073,P＜0.001;2.524±0.085,P＜0.001)表达显著下调.高糖+法舒地尔12.5 μmol/L组MYPT1、ERK、JNK和p38MAPK磷酸化水平及Hcy水平均显著高于高糖+法舒地尔25 μmol/L组和高糖+法舒地尔50 μmol/L组(P均＜0.001),高糖+法舒地尔25 μmol/L组显著高于高糖+法舒地尔50 μmol/L组(P均＜0.001).结论 RhoA/ROCK信号转导通路可能通过激活下游的MAPKs介导了高糖诱导的肝HSC的增殖和胶原合成,ROCK可能是防治糖尿病肝纤维化的新靶点.

目的:观察不同刺激量电针腧穴对糖尿病胃轻瘫(DG P)大鼠Ras同源物基因组成员A(Rho A)/Ras同源物相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信号表达的影响,探讨刺激量是否为腧穴配伍效应的影响因素.方法:S D大鼠随机分为空白组、模型组、小刺激量组、中刺激量组、大刺激量组,每组12只.采用单次腹腔注射2％ 链脲佐菌素配合高脂高糖饮食喂养8周建立DGP大鼠模型.分别采用0.12 mA、0.24 mA、0.36 mA对小刺激量组、中刺激量组、大刺激量组电针"足三里""梁门""三阴交",每次20 min,每日1次,连续15 d.治疗后,酚红染色观察大鼠胃排空率及小肠推进率;免疫组化、Western blot法检测胃窦平滑肌组织RhoA、ROCK、肌球蛋白磷酸酶靶亚单位1(MYPT 1)、磷酸化MYPT 1(p-MYPT 1)蛋白的表达水平.结果:与空白组比较,模型组大鼠血糖明显升高(P<0.05);胃排空率、小肠推进率和胃窦平滑肌组织RhoA、ROCK、MYPT 1、p-MYPT 1蛋白表达水平明显降低(P<0.05).与模型组比较,小、中、大刺激量组的胃排空率、小肠推进率和胃窦平滑肌组织RhoA、ROCK、MYPT 1、p-MYPT 1蛋白表达水平明显升高(P<0.05).与大刺激量组比较,小刺激量组胃窦平滑肌组织RhoA、ROCK、MYPT 1、p-MYPT 1蛋白表达水平明显降低(P<0.05).结论:电针治疗能通过上调RhoA/ROCK信号的表达有效促进胃平滑肌收缩,改善糖尿病胃轻瘫的症状,且大刺激量电针上调RhoA/ROCK信号的效果优于小刺激量,因此不同的刺激量可能是影响腧穴配伍效应的因素之一.

目的 探讨糖尿病合并肺结核患者外周血T淋巴细胞Rho激酶活性变化及其临床意义.方法 选取2015年1月—2017年1月我院收治的150例糖尿病合并肺结核患者(糖尿病合并肺结核组)和100例糖尿病患者(记为糖尿病组)及同期于我院体检的100例健康志愿者(记为健康组)为研究对象,外周血采集采用RosettSep T细胞提取试剂盒,磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)蛋白表达T细胞中Rho激酶活性,免疫印迹法检测三组MYPT1蛋白表达量,酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测三组细胞因子[白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)]水平,比较三组胰岛β细胞功能[β细胞功能指数(HOMA-β)、胰岛素抵抗指数(HO-MA-IR)],并分析IL-6、IL-10、HOMA-β、HOMA-IR与T淋巴细胞Rho激酶活性的关系.结果 糖尿病合并肺结核组外周血T细胞Rho激酶活性较糖尿病组、健康组明显高,糖尿病组外周血T细胞Rho激酶活性较健康组明显高,各组之间两两比较有统计学意义(P<0.05);糖尿病合并肺结核组IL-6、IL-10较糖尿病组、健康组明显高,差异显著(P<0.05),但糖尿病组IL-6、IL-10与健康组相较无显著差异(P>0.05);糖尿病合并肺结核组HOMA-β最低、HOMA-IR最高,糖尿病组次之,健康组HOMA-β最高、HOMA-IR最低,三组之间两两比较有统计学意义(P<0.05);IL-6、HOMA-IR与T淋巴细胞Rho激酶活性呈明显正相关,HOMA-β与T淋巴细胞Rho激酶活性呈明显负相关(均P<0.05);但IL-10与T淋巴细胞Rho激酶活性无明显相关性(P>0.05).结论 糖尿病合并肺结核患者外周血T淋巴细胞Rho激酶活性较高,存在炎性因子高表达和胰岛β细胞功能异常现象,可为临床新型靶向药物研究提供理论依据.

目的 探讨RhoA/Rho激酶信号通路在大鼠肺动脉高压〔5-羟色胺(HT)诱导〕中对其肺动脉平滑肌细胞的作用及尼索地平(Nis)与此信号通路的关系.方法 将原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)随机分为空白对照组、5-HT(1μmol/L)组,Nis(1×10-5、1×10-6、1×10-7及1×10-8 mol/L)组.噻唑蓝(MTT比色法)测定大鼠PASMCs增殖,Western印迹法及RT-PCR法检测PASMCs增殖细胞的RhoA、Rho激酶mRNA及Rho激酶的调节亚单位p-磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基(MYPT)1水平.结果 不同浓度的Nis均能明显抑制5-HT诱导的PASMCs增殖(P<0.05),呈现出一定的浓度依赖性;并且降低5-HT诱导的RhoA、Rho激酶mRNA表达及MYPT1磷酸化.结论 5-HT作用下肺动脉高压大鼠PASMCs存在增殖及RhoA/Rho激酶信号通路异常表现,Nis能够抑制该细胞异常增殖并调节信号通路表达.

目的 探究白细胞介素(IL)-38对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移的作用和机制.方法 将人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)随机分成4组:对照组(不进行任何处理)、PDGF-BB组(加入20 ng/ml重组人PDGF-BB蛋白处理24h)、PDGF-BB+空质粒组(转染pcDNA3.1空质粒48 h后加入20 ng/ml重组人PDGF-BB蛋白处理24 h)和PDGF-BB+IL-38组(转染pcDNA3.1-IL-38质粒48 h后加入20 ng/ml重组人PDGF-BB蛋白刺激24h).MTT法检测细胞活力、Transwell检测细胞迁移、Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)、RhoA、Rho相关蛋白激酶(ROCK)1、ROCK2、肌球蛋白磷酸酶靶标亚基1(MYPT1)和磷酸化MYPT(p-MYPT)蛋白水平的表达.结果 与对照组相比,PDGF-BB组中细胞活力,迁移细胞数目,PCNA、RhoA、ROCK1、ROCK2的表达和p-MYPT/MYPT1的值均增加,差异均具有统计学意义(均P＜0.05);与PDGF-BB组相比,PDGF-BB+空质粒组中这些指标变化无统计学意义(均P＞0.05);与PDGF-BB+空质粒组相比,PDGF-BB+IL-38组中细胞活力,迁移细胞数目,PCNA、RhoA、ROCK1、ROCK2的表达和p-MYPT/MYPT1的值均降低,差异均具有统计学意义(均P＜0.05).结论 IL-38能够减弱PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移,这种作用可能是通过抑制RhoA/ROCK通路活化发挥作用的.

目的 研究养元通络法指导针刺对糖尿病胃轻瘫(DGP)模型大鼠胃窦平滑肌Ras同源物基因组成员A(RhoA)/Ras同源物相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)通路及肌球蛋白磷酸酶靶亚单位1(MYPT-1)的影响.方法 将50只SD大鼠随机分为空白组、模型组、针刺组、假针刺组、多潘立酮组,每组10只.除空白组外,其余4组均采用链脲佐菌素(STZ)结合高脂饮食诱导造模.各组大鼠分别于相应干预措施2周后,检测胃排空率,小肠推进率,免疫印迹法(WB)检测胃窦平滑肌RhoA、ROCK蛋白表达,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MYPT-1 mRNA的表达.结果 ①与空白组比较,模型组大鼠胃排空率和小肠推进率下降(P＜0.05);与模型组比较,针刺组与多潘立酮组胃排空率和小肠推进率提高(P＜0.05),假针刺组胃排空率与小肠推进率无显著差异(P＞0.05);②与模型组比较,针刺组与多潘立酮组大鼠胃窦PhoA、ROCK蛋白和MYPT-1 mRNA表达升高(P＜0.05),假针刺组胃窦RhoA、ROCK,MYPT-1 mRNA表达无显著差异(P＞0.05).结论 养元通络法指导电针能上调RhoA/ROCK信号通路,提高MYPT-1 mRNA表达,促进DGP大鼠胃窦平滑肌收缩,加速DGP大鼠胃排空.

目的:观察针刺结合益气健脾中药复方对糖尿病胃轻瘫(DGP)大鼠胃肠动力的影响,探讨其可能的作用机制.方法:SD大鼠随机分为空白组、模型组、针刺组、中药组、针药组和西药组,除空白组外采用链脲佐菌素(STZ)尾静脉注射及高糖高脂不规则喂养法建立糖尿病胃轻瘫模型.成模后针刺组每日给予三阴交、足三里穴针刺30 min治疗,中药组每日给予益气健脾中药复方5 g/kg灌胃,针药组先给予益气健脾中药复方5 g/kg灌胃再行针刺(操作同针刺组),西药组每日给予多潘立酮3.15×10-3 g/kg灌胃,模型组和空白组每日给予生理盐水10 mL/kg灌胃1次,所有治疗持续4周.治疗过程中记录大鼠一般情况,4周后记录血糖、体质量,酚红灌胃法检测胃排空率及小肠推进率,免疫组化法测定胃窦组织中Ras同源物基因组成员A(RhoA)、Rho蛋白相关卷曲螺旋激酶2(ROCK2)阳性表达,Western blot法测定胃窦组织中磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚单位1(p-MYPT1)、磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)蛋白的表达.结果:与空白组比较,模型组大鼠一般情况较差,胃排空率、小肠推进率和RhoA、ROCK2蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠一般情况明显好转,胃排空率、小肠推进率和RhoA、ROCK2、p-MYPT1、p-MLC蛋白表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01),针药结合组改善最明显.结论:针刺和中药均可有效促进胃排空,增加小肠推进率,改善胃肠动力,其作用机制可能与上调RhoA/ROCK/MLC信号通路有关,且针药结合疗效更显著.

目的 在细胞分子水平上研究RhoA/Rock信号通路在肺支气管上皮细胞发生上皮-间质转化(EMT)向肌成纤维细胞(MFB)转化发挥的作用.方法 使用人外周血单核细胞系(THP-1)构建矽肺纤维化体外模型中人巨噬细胞,再使用100 mg/mL二氧化硅(SiO2)悬液染尘巨噬细胞12 h后,收集上清液.实验设置分为4组:对照组:人肺支气管上皮细胞(HBE)加入上清液;染尘组:HBE加入上清液后,再加入SiO2悬液染尘,染尘剂量分别为50、100、200 mg/mL;RhoA沉默组:利用小干扰RNA(siRNA)在RNA干扰技术下沉默HBE内RhoA,加入上清液;RhoA沉默染尘组:采用RNA干扰技术沉默HBE内RhoA,加入上清液后,再加入SiO2悬液染尘,染尘剂量分别为50、100、200 mg/mL.4组均培养24 h后,使用Western Blot法测定细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮性钙粘附蛋白(E-cad)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)、RhoA及Rock1、肌球蛋白磷酸酶靶亚基(MBS)蛋白磷酸化表达水平.结果 染尘组中染尘剂量为50、100、200 mg/mL时E-cad表达水平分别为1.34±0.60、1.21±0.17和1.01±0.30,而对照组E-cad表达水平为1.54±0.14;RhoA沉默染尘组中染尘剂量为50、100、200 mg/mL时E-cad表达水平分别为1.79±0.12、1.50±0.11和1.19±0.05,而RhoA沉默组E-cad表达水平为2.21±0.38;染尘组与对照组、RhoA沉默染尘组与RhoA沉默组比较,均显示染尘组E-cad表达水平降低,而α-SMA、collagen Ⅰ、RhoA、Rock1以及MBS蛋白磷酸化表达水平增加;且随着染尘浓度增加,差异越明显.经siRNA沉默后,RhoA沉默染尘组较染尘组E-cad的表达增加,而α-SMA、collagen Ⅰ、RhoA、Rock1的表达降低.结论 SiO2粉尘会导致支气管上皮细胞发生EMT,hoA/Rock信号通路介导EMT参与了矽肺纤维化,抑制该信号通路可以抑制EMT,从而对矽肺纤维化具有保护作用.