中国一级保护野生兰科植物共33种,隶属于兜兰属、杓兰属、兰属、石斛属、蝴蝶兰属和虾脊兰属,具有重要的观赏和药用价值.本研究对这些种类的杂种登录情况、亲本选择、授粉及播种时期选择、属间杂交进展、杂交育种存在的问题等进行综述,并结合育种现状提出了未来育种方向.研究表明,以中国一级保护野生兰科植物为亲本已有3611个杂种在英国皇家园艺学会上登录,杂种数最多的前10名均为兜兰属植物,包括巨瓣兜兰、波瓣兜兰、白旗兜兰等,其次为美花兰,而红花兜兰、广东兜兰、紫斑兜兰和暖地杓兰未见杂种登录.绿叶兜兰、曲茎石斛、霍山石斛、文山红柱兰等为极具潜力的优秀种质资源,但以其为亲本的杂种较少.建议未来开展杂交育种工作时,应当充分利用上述野生种质资源、加强属间杂交,并利用分子标记辅助育种加速新品种培育,以提高野生兰科种质资源的利用水平.本研究可为中国一级保护野生兰科植物的杂交育种工作提供参考,为兰科植物种质资源创新和兰花产业持续发展提供支撑.

蝴蝶兰在种苗生产中主要是以腋芽再生的方式进行繁育.本研究以大辣椒、四季春2个蝴蝶兰品种为试材,利用Illumina HiSeq-(TM) 2000平台对他们在组织培养过程中3个诱导增殖阶段的转录组进行了测序.结果表明,测序共获得52.77 Gb的Clean Data,6个样品的Clean Data平均达到了6.78 Gb.对Clean Data进行过滤并组装,共获得86 130条Unigenes;其中长度在1kb以上的Unigenes有16 723条.参照无参基因组在数据库中进行比对分析,其中28 430条Unigenes可进行有效注释.对2个品种、3个诱导增殖阶段的全部Unigenes进行SNP分析表明,四季春的杂合性SNP分布密度明显低于大辣椒品种.另外,对转录组数据进行了差异表达基因分析,共获得了7 638条差显基因.

该研究借助RACE技术克隆了铁皮石斛己糖转运蛋白(hexose transporter,HT)基因DoHT1,对其序列特征进行生物信息分析,并采用定量PCR分析基因表达模式.结果表明,DoHT1基因(GenBank注册号KU160469)cDNA全长1 586 bp,ORF长1 536 bp,编码1条由511个氨基酸组成的多肽,56.18 kDa,等电点9.08.DoHT1蛋白含有糖转运蛋白协助扩散超家族保守结构域(22 ～ 483)、糖转运基序1(139～164)、糖转运基序2(338 ～355)和功能基序;无信号肽,含11个跨膜域,预测定位在质膜,与多种植物HTs蛋白有较高的一致性(54.7％ ～80.7％),隶属于MST(单糖转运蛋白)分支,与小兰屿蝴蝶兰亲缘关系最近.DoHT1基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛叶中显著最高,茎中次为,分别为根中的19.36,1.82倍.该研究获得DoHT1基因全长及分子特征,为进一步研究其在铁皮石斛糖代谢调控中的作用奠定基础.

蝴蝶兰花器官中基因功能的研究受遗传转化效率低和遗传转化周期长的制约,而花瓣瞬时表达体系是一种快速分析基因功能的有效手段.该研究以蝴蝶兰'大辣椒'花瓣和萼片为实验材料,通过农杆菌介导的瞬时转化方法,分析了侵染的菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等4个因素对β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因表达效率的影响,以探寻其瞬时表达的最佳条件;并将查尔酮合成酶( chalcone synthase ,CHS )基因RNAi干扰载体瞬时转化蝴蝶兰花瓣,共培养3 d后观察转化材料中花色表型以及色素的变化,并利用半定量 RT-PCR来检测C H S基因转录水平的表达.结果表明:(1 )农杆菌菌液 OD600为0 .6 、侵染时间60 s ,在重悬液中添加150 μmol/L乙酰丁香酮,共培养3 d ,GUS瞬时表达率最高(85 .01%) . (2)转基因蝴蝶兰花瓣颜色明显变淡,色素含量降低. (3)半定量PCR检测表明,C H S基因的转录活性相比于对照组显著降低.该实验成功的在蝴蝶兰花器官中建立了一种快速基因功能验证方法,为后期蝴蝶兰基因功能研究和育种工作提供技术支持.

运用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和巢式PCR技术克隆出铁皮石斛硫氧还蛋白超家族基因(Thiore-doxin like 2,DoTrxL2).序列分析表明DoTrxL2基因开放阅读框(ORF)长度为639 bp,编码213个氨基酸,编码产物含有一个硫氧还蛋白家族保守的CXXC功能结构域,通过两个半胱氨酸的双硫键得失电子,起到氧化还原作用.分子进化分析显示,DoTrxL2同小兰屿蝴蝶兰、石刁柏亲缘关系较近.qRT-PCR分析显示,DoTrxL2在铁皮石斛原球茎不同发育时期及不同组织中均有表达差异,其中在原球茎形成早期表达量较高,表明该基因对原球茎形成有着促进作用;而在种子和花中表达量高,表明该基因对植物组织的生殖发育具有重要调控作用.

本研究从蝴蝶兰叶片中克隆了茎部特异基因PhTSJT1的全长序列(GenBank登录号为MF797883),并分析了其在不同组织及低温胁迫下的表达特性.结果表明,PhTSJT1基因全长994bp,编码239个氨基酸,属于Class-Ⅱ谷氨酰胺酰胺基转移酶超家族成员;同源性分析表明,该蛋白与多种植物的茎部特异蛋白和铝诱导蛋白有较高的同源性,进化上与小兰屿蝴蝶兰的茎部特异蛋白亲缘关系最近;该基因在营养器官中表达水平较高,在花器官中表达水平较低;13℃/8℃(昼/夜)的低温胁迫抑制PhTSJT1基因的转录表达,并随着低温胁迫时间的延长,PhTSJT1基因的表达水平逐渐降低,在温度恢复正常时其表达水平升高;4℃冷胁迫低温条件下,PhTSJT1基因在处理1h时,表达水平升高,处理8h时表达水平最高,16h后表达水平逐渐降低.由此推测,PhTSJT1参与4℃冷胁迫的分子调控.本研究不但有助于理解热带亚热带植物的耐冷机制,也为蝴蝶兰新品种的遗传改良提供帮助.

目的 苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物次生代谢与抗逆反应的关键酶类之一,研究PAL基因的序列信息与逆境胁迫响应模式,揭示其蛋白结构与功能及抗逆信号网络.方法 采用RT-PCR、RACE技术获得白及PAL基因cDNA全长;Protparam、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析其编码蛋白的理化特性、结构域等特征;DNAMAN、MEGA软件分别进行氨基酸多序列比对与系统进化分析;实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术进行PAL基因时空表达特异性与外源激素胁迫下响应检测.结果 克隆得到的BsPAL基因cDNA全长为2 708 bp,编码1条797个氨基酸组成的多肽,预测蛋白质相对分子质量为86 216.94,等电点6.24,具有植物PAL酶的典型结构域和活性中心,不具有跨膜结构域,与铁皮石斛、蝴蝶兰的PAL基因亲缘关系最近.qRT-PCR结果表明白及根中PAL表达量显著高于叶与茎.在MeJA处理下,PAL表达量呈逐渐上升再下降的趋势;SA处理下,则是先下降再上升的趋势.结论 白及PAL基因的克隆与序列特征分析、表达检测及响应MeJA和SA胁迫后的表达变化为阐明白及苯丙烷代谢途径与激素信号通路研究提供实验基础.

目的 克隆珍稀濒危兰科药用铁皮石斛F-box蛋白基因即S期激酶相关蛋白(S phase kinase-associated protein)基因DoSKP2A,并进行生物信息学和表达特征分析.方法 采用RACE技术获基因全长;利用生物信息软件预测基因编码蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 7.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建;借助定量PCR检测基因表达模式.结果 克隆到DoSKP2A(GenBank注册号KU160472),cDNA全长1507bp,开放阅读框(ORF)长1 101 bp,编码蛋白含366个氨基酸,相对分子质量39 590,等电点7.9.DoSKP2A蛋白不含跨膜域和信号肽,包含F-box核心结构域(26～88)、亮氨酸重复序列LRR (202～226)和多个保守基序;DoSKP2A与植物SKP2As蛋白一致性为64.6％～72.4％,所在分支隶属于SKP2As分子进化的单子叶植物分支,与小兰屿蝴蝶兰SKP2A亲缘关系近;DoSKP2A基因转录本在石斛3种器官中为组成型表达,根中相对表达量较高,为叶中的6.16倍,茎中次之,叶中表达量很低.结论 获得一个全新的铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A全长、生物信息及其表达特征,为研究其在铁皮石斛生长发育、信号传导和抗逆境胁迫的分子机制提供基础.

GRAS家族是一类植物特有的转录调控因子,参与调控植物生长发育及抵御逆境胁迫,并且在赤霉素(gibberellins,GAs)信号转导过程中具有重要作用.本研究采用RT-PCR结合RACE方法从铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)原球茎中克隆到了一个转录因子GRAS家族基因SCL3 (scarecrow-like 3)并对其进行了表达分析.该基因cDNA序列全长2 278 bp,命名为DoSCL3 (GenBank注册号:MG252261),其编码425个氨基酸,分子量为47.88 kD,等电点(PD为6.21.DoSCL3基因编码的蛋白不含跨膜域和信号肽,具有GRAS转录因子家族特有的保守结构域(22～422);多序列比对表明,DoSCL3与小兰屿蝴蝶兰的SCL3蛋白高度同源(相似性达到83％),同时进化树分析结果显示其与小兰屿蝴蝶兰亲缘关系非常相近.qRT-PCR实验结果显示,DoSCL3基因在铁皮石斛种子共生萌发中随着萌发进程的变化(1～3级,萌发至原球茎阶段)其表达量逐渐升高,并且在种子萌发至2级时,共生萌发组表达量显著高于无菌萌发组(为无菌组2.2倍),表明DoSCL3在兰科药用植物铁皮石斛种子共生萌发中菌根共生关系的建立过程起到重要的调控作用.

FT(Flowering LocusT)及其同源基因被认为是植物开花、花发育相关的重要基因.为了深入研究FT同源基因的功能以及文心兰开花的分子机理,该研究以文心兰品种‘金辉’为试验材料,基于转录组测序结果,克隆获得‘金辉’FT同源基因,命名为OnFT(GenBank登录号为MK967676).OnFT基因编码区长度为537 bp,共编码178个氨基酸;生物信息学分析表明,该蛋白质分子量约为19.99 kD,可能是一种亲水性不稳定蛋白质,属于PEBP家族蛋白;基于FT的系统进化分析表明,文心兰与同科植物桃红蝴蝶兰的亲缘关系较近.qRT-PCR分析结果显示,OnFT在文心兰不同组织的表达差异较大,在花中表达量最高,在根中几乎不表达;OnFT基因在幼嫩花芽中的表达量较低,并且在花的成熟过程中逐渐增加;OnFT基因在叶片和假鳞茎中的表达量随成熟度的增长均呈先上升后降低的变化趋势,在中苗期的叶片和抽芽期的假鳞茎中表达量较高.