血栓性血小板减少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP）为一种少见、严重的血栓性微血管病，其主要临床特征包括微血管病性溶血性贫血（MAHA）、血小板减少、神经精神症状、发热和肾脏受累等 [1]。TTP的发病机制主要涉及血管性血友病因子（VWF）裂解酶（ADAMTS13）活性缺乏，也与血管内皮细胞VWF异常释放、补体异常活化、血小板异常活化等相关。血浆中ADAMTS13活性缺乏导致内皮细胞异常释放的超大分子VWF（UL-VWF）不能及时降解，UL-VWF可自发结合血小板，导致微血管内血栓形成、微血管病性溶血，进而引起相应器官缺血、缺氧及功能障碍，引起临床症候群 [2,3,4,5]。

目的:探讨适合临床实验室使用的血管性血友病因子（VWF）与血小板结合活性（VWF：GPIbM）检测的性能验证方法和指标。方法:参考美国临床和实验室标准协会（CLSI）系列文件和我国卫生行业标准，使用Sysmex CS-5100仪器及配套试剂，设计方案并验证其检测VWF：GPIbM的性能。（1）精密度验证：使用正常值、低值质控品和3种不同活性的混合血浆（活性范围为5.0%~150.0%），每天重复检测各样品5次，连续5 d，计算批内和批间变异系数（ CV），依据产品说明书标示的性能要求设定精密度评价标准；（2）正确度验证：将配套校准物稀释成活性参考值分别为5.2%、31.2%、62.4%、104.0%和138.7%的样品，各样品重复检测次数与精密度实验相同，计算检测均值与参考值的偏倚，依据允许总误差设定正确度评价标准；（3）线性验证：配制10种不同活性的混合血浆（活性理论值范围为3.6%~160.4%），用于低活性水平和正常活性水平校准曲线的线性验证，重复检测各样品3次，计算检测均值和理论值的线性回归方程的斜率、 R2以及偏差，依据行业标准和产品说明书的要求设定线性评价标准；（4）定量限验证：将配套校准物稀释成活性为3.3%和2.7%的样品，重复检测各样品12次，依据CLSI文件设定评价标准。 结果:精密度验证的批内和批间 CV分别为1.0%~2.5%和1.1%~2.6%；正确度验证结果的偏倚分别为-0.4%、1.0%、-2.6%、0.3%和-2.7%；低活性水平（3.6%~31.8%）和正常活性水平（28.4%~160.4%）线性验证结果显示，回归方程的斜率分别为1.021 7和0.996 2， R2分别为0.993 5和0.993 9，各样品检测结果的偏差为0~1.8%、-10.1%~0，均符合要求；定量限验证检测结果的偏差为-0.4%~0.3%，均符合要求。 结论:VWF：GPIbM方法的精密度、正确度、线性和定量限验证结果均满足产品说明书标示的性能要求或本研究设定的评价标准，可为临床实验室的性能验证提供参考。

目的:探讨血管性血友病因子裂解酶ADAM金属肽酶含血小板反应蛋白1型13(ADAMTS13)间隔区结构域在血管性血友病因子(vWF)裂解过程中的生物学功能,阐明ADAMTS13在血栓性血小板减少性紫癜(TTP)发病机制中的作用.方法:将ADAMTS13间隔区结构域中的氨基酸残基TEDRLPR以点突变技术逐个基因突变(突变体M1～M7),将构建的ADAMTS13与其突变体质粒转染至人胚肾HEK293细胞,稳定表达后提纯重组蛋白.观察野生型和突变型ADAMTS13在变性条件、剪切应力作用和ADAMTS13抗体处理后裂解vWF的能力.结果:荧光共振能量转移(FRET)实验,与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)对FRET-vWF73剪切能力降低(P＜0.05).变性条件下,野生型ADAMTS13可以将vWF多聚体裂解,与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)的裂解活性明显降低(P＜0.01).在体外剪切应力作用下,与野生型 ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体 M4(R635A)和突变体M7(R638A)裂解vWF多聚体的能力明显降低(P＜0.01).与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)与vWF之间的结合力差异无统计学意义(P＞0.05),表明ADAMTS13的C末端与vWF之间存在多个结合位点.ADAMTS13抗体处理可在一定程度上抑制野生型和突变型ADAMTS13裂解vWF的能力.结论:间隔区突变后ADAMTS13的活性降低.ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)可能是ADAMTS13在底物识别时的重要作用位点.

目的:探讨1个遗传性血管性血友病 (von Willebrand disease, vWD) 2N型家系的表型诊断和基因型分析结果, 明确患者的发病机制.方法:对该家系的先证者和家系成员进行出血时间、活化部分凝血活酶时间、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集 (ristocetin induced platelet aggregation, RIPA) 试验、血管性血友病因子 (von Willebrand factor, vWF) 瑞斯托霉素辅因子、vWF抗原、vWF活性测定、vWF胶原结合试验、凝血因子Ⅷ (coagulation factorⅧ, FⅧ) 活性、vWF与FⅧ结合试验检测, 并作出表型诊断.提取先证者的外周血基因组DNA, 用PCR法扩增VWF基因和F8基因的所有外显子及侧翼序列, 通过直接测序分析VWF基因和F8基因变异.结果:vWD家系先证者的活化部分凝血活酶时间和出血时间明显延长, 血浆瑞RIPA试验、vWF瑞斯托霉素辅因子、vWF抗原、vWF活性和vWF胶原结合试验检测结果均正常, FⅧ活性下降, vWF与FⅧ的结合能力降低.对先证者进行基因测序, 发现其VWF基因19号外显子存在c.2446C＞T (p.Arg816Trp) 错义突变, 其儿子在该位点为杂合突变, 而先证者及家系成员的F8基因未发现突变.结论:c.2446C＞T (p.Arg816Trp) 错义突变是导致该家系先证者发生2N型遗传性vWD的原因.

背景:血管性血友病因子水解蛋白酶13(a disintegrin and metaloproteinase with a thrombospondin type 1 motif,member 13,ADAMTS13)可结合并酶切血管性血友病因子,在防止血小板过多聚集和血栓的形成中起到关键作用.重组ADAMTS13通常选择在真核细胞中表达分泌,然而对于其表达纯化目前仍缺乏一个明确高效的途径.目的:寻找合适的宿主细胞,得到稳定表达野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的细胞株,建立高纯度ADAMTS13的纯化方法,进而研究其生物学功能.方法:以野生型ADAMTS13重组质粒为模板,利用位点突变试剂盒得到功能增强型ADAMTS13重组质粒.比较CHO-S细胞、CHO-K1细胞、293T细胞对ADAMTS13的表达效果,挑选出合适的宿主细胞.通过Ni柱亲和层析和分子筛纯化蛋白;采用7.5％SDS-PAGE、Western-blot鉴定野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的纯度及特异性;利用原子力显微镜技术检测野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的相互作用,鉴定两种蛋白的活性.结果与结论:相对于CHO-S和CHO-K1,293T细胞更适合作为野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的表达宿主;经Ni柱亲和层析和分子筛纯化后,所得到的野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13质量浓度分别为103.7,149.7 mg/L,且两种蛋白纯度均约90％;原子力显微镜检测结果显示,野生型ADAMTS13、功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的黏附频率分别为11.37％,14.70％,表明功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的结合亲和力更高,这与近期ADAMTS13构象研究一致.

已知血管性血友病因子(vWF)参与介导血小板对血管和微血管的粘附作用,并且vWF在慢性肾病患者血浆中的水平明显升高.为了揭示vWF和血管性血友病因子裂解酶(vWF-CP)在紫癜性肾炎患者血浆中的表达,以及vWF和vWF-CP在发病机制中的作用.本研究采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和残余胶原蛋白结合试验分别检测紫癜性肾炎患者(HSPN组,n=62)、微小病变性肾小球病患者(MCN组,n=16)和健康体检者(对照组,n=10)血浆vWF水平和vWF-CP活性.应用免疫组织化学法检测肾组织中vWF和vWF-CP的表达.另外,应用ELISA检测了紫癜性肾炎患者血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,并分析了各指标间的相关性.研究结果显示,HSPN组和MCN组的vWF水平均显著高于对照组,而vWF-CP活性均显著低于对照组.随着ISKDC分级的升高,紫癜性肾炎患者的vWF水平逐渐升高.而vWF-CP活性则随着ISKDC分级的升高而显著降低.大量蛋白尿组(≥2.0 g/24 h)的vWF水平((183.4±27.37)％)显著高于非大量蛋白尿组(＜2.0 g/24 h,(132.64±19.79)％),而大量蛋白尿组的vWF-CP活性((44.47±6.63)％)显著低于非大量蛋白尿组((74.86±11.17)％).HSPN组和MCN组的TNF-α水平均显著高于对照组.在紫癜性肾炎患者和微小病变性肾小球病患者中,vWF的阳性表达率显著高于健康对照组(p＜0.05),而vWF-CP显著低于健康对照组(p＜0.05).紫癜性肾炎患者的vWF水平与TNF-α水平显著正相关(r=0.452,p=0.010),而vWF-CP活性与TNF-α水平显著负相关(r=-0.496,p=0.006).本研究初步结论表明vWF和vWF-CP参与紫癜性肾炎的发病机制,并且与病情严重程度密切相关,且vWF和vWF-CP的合成和分泌可能受到TNF-α等促炎症因子的调节.

目的 从血管内皮活性物质角度探讨免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)气不摄血证血管损伤情况及出血机制的动态变化.方法 采用睡眠剥夺复合免疫法制备ITP气不摄血证小鼠模型,第1周进行睡眠剥夺,第2、3周睡眠剥夺同时注射抗血小板血清(APS)进行免疫.将Balb/C小鼠分为正常组和模型组,各组再分为7、10、21 d时间点,每个时间点正常组10只、模型组12只,观察各时间点小鼠体征,检测小鼠体质量及血小板、抓力、脾脏指数、胸腺指数,ELISA检测血清血管性血友病因子(vWF)、一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)含量,AimPlex流式高通量多因子法检测血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)、可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM-1)含量.结果 与正常组比较,模型组第7日小鼠精神状态萎靡,倦怠蜷缩,极少活动,此状态随时间延长日益加重,体质量、抓力、血小板、脾脏指数、胸腺指数显著降低(P<0.01),vWF、NO、ET-1显著升高(P<0.01);注射APS后,模型组小鼠腹部、腿部有出血点,便血情况发生,第2次注射后出血最为严重,此后逐日减轻,小鼠体质量、抓力、血小板、胸腺指数、VEGF-A、sVCAM-1显著降低(P<0.01,P<0.05),脾脏指数、vWF、NO、ET-1显著升高(P<0.01);第21日模型组小鼠出血较轻,体质量、抓力、血小板、胸腺指数显著降低(P<0.01),脾脏指数、vWF、NO、ET-1、sICAM-1显著升高(P<0.01).结论 ITP气不摄血证小鼠模型存在血管损伤:造模第7日以血管内皮凝血功能紊乱为主,第10日以血管内皮通透性改变为主,第21日以血管内皮免疫功能紊乱为主.

目的 采用密度梯度离心分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs),观察白藜芦醇对EPCs增殖活性的影响.方法 首先采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞,去除非贴壁细胞,培养14 d后获得EPCs.随后免疫荧光法测定细胞表面血小板-内皮细胞粘附因子(CD31)、血管性血友病因子(vWF)、血管内皮生长因子受体(FLK-1)、白细胞共同抗原(CD45),行Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-AC-LDL)和异硫氰酸荧光素荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)双摄取实验,以及基质胶(Matrigel)管状形成实验,鉴定EPCs.运用CCK8法检测细胞增殖活性,采用不同浓度(5、10、25、50、100μmol/L)白藜芦醇干预EPCs 48 h,以及白藜芦醇在不同时间(24～72 h)干预EPCs,分别检测细胞增殖活性.结果 大鼠骨髓单个核细胞分离后,经诱导培养14 d后,呈现"鹅卵石样""铺路石状"外观.超过90％细胞表面表达CD31、vWF、FLK-1,能摄取DiI-AC-LDL和结合FITC-UEA-1,可在Matrigel胶中形成管状结构,经上述方法证实,本实验所分离培养的细胞为大鼠EPCs.与对照组比较,干预48 h,白藜芦醇呈浓度依赖性(5～50μmol/L)增强EPCs增殖活性(P均<0.01).50μmol/L白藜芦醇干预EPCs24 h～72 h后,EPCs的增殖活性呈现时间依赖性增强.结论 采用密度梯度离心法分离培养及免疫荧光法鉴定细胞,证实为大鼠骨髓内皮祖细胞;进一步证实白藜芦醇可增强内皮祖细胞的增殖活性,为后续研究白藜芦醇的心血管保护机制奠定实验基础.

ADAMTS13是一种含I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶家族第13位成员(adisintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin-1 motifs, 13th member of the family,ADAMTS13)[1],此前称为血管性血友病因子裂解酶(yon Willebrand factor-cleaving protease, vWF-CP).虽然血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)发现已逾百年,但对其发病机制的研究一直进展缓慢,直到确定vWF-CP,即ADAMTS13缺乏/活性降低是TTP的根本原因,尤其是ADAMTS13三维结构及其构象激活机制阐明后[2],ADAMTS13与TTP及其他血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy,TMA)关系的研究取得了重大进展.

GPIbα(glycoprotein Ibα)是血小板表面重要的黏附受体GPIb-Ⅸ-Ⅴ复合物的组成部分,其细胞外配体结合片段可在基质金属蛋白酶ADAM17/TACE的作用下发生剪切脱落,削弱血管性血友病因子vWF等配体与血小板的结合,是一种重要的血小板功能调控机制.笔者前期研究发现中药赤芍、红花和黄芪中的活性成分芍药苷(PF)、羟基红花黄色素(HSYA)和某些黄芪皂苷单体(AS-Ⅲ),以及复方活血胶囊均可激活血管内皮细胞中的ADAM17,诱导血管内皮细胞表面多种炎症相关蛋白(如TNFR1和EGFR配体)的胞外片段脱落,调控炎症过程、激活保护性信号通路.本文通过综述血小板膜受体GPIbα的功能、ADAM17的激活机制及其对血小板GPIbα受体的切割作用,推测血小板A DAM 17可能是中药活血化瘀作用的一个重要物质基础,为研究和阐明中药抑制血小板黏附聚集、血栓形成的作用机制提供了新思路.