遗传性血栓性血小板减少性紫癜(congenital thrombotic thrombocytopenic purpura, cTTP)也被称为Upshaw-Schulman综合征，是一种罕见的常染色体隐性遗传病。主要的发病机制为位于染色体9q34上的纯合或双杂合的血管假性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)基因突变，使血浆中裂解血管假性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)多聚体的ADAMTS13严重缺乏，微血管血栓的风险增高，导致各种并发症。随着对cTTP发病机制的研究不断完善，重组人ADAMTS13和基因治疗在cTTP治疗方面取得了突破性进展，本文对cTTP的诊断与治疗的最新进展进行综述。

目的:研究重组人血管性血友病因子裂解蛋白酶(rhADAMTS13)对放射性肠损伤的防护效应。方法:将30只C57BL/6 J小鼠按随机数表法分为健康对照组、12 Gy腹部照射组(单纯照射组)和rhADAMTS13联合12 Gy照射组(联合组)，分别为6、12和12只。联合组于照射前3 d给予2.5 μg/kg rhADAMTS13尾静脉注射，单纯照射组和联合组给予单次12Gy X射线腹部照射。于照射后1和3 d处死，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆血管性血友病因子(vWF)、血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)和C-反应蛋白(CRP)的水平，苏木素-伊红(HE)染色观察肠组织病理学改变，免疫组织化学染色检测肠组织Ki67、TNF- α和MPO表达水平，生化试剂盒检测血浆丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)。结果:与健康对照组比较，单纯照射组照射后1(1.38±0.11)和3 d(1.70±0.10)小鼠血浆vWF水平增高( t＝6.20、12.29， P<0.05)，ADAMTS13水平降低( t＝9.82、22.83， P<0.05)；与单纯照射组比较，联合组照射后1(1.23±0.12)和3 d(1.48±0.09)小鼠血浆vWF水平减低( t＝2.93、3.96， P<0.05)，ADAMTS13水平升高( t＝5.09、9.82， P<0.05)。与单纯照射组比较，照射后3 d联合组绒毛长度缩短程度明显降低( t＝8.51， P<0.05)，免疫组织化学染色显示，联合组照射后3 d隐窝Ki67 +细胞数量明显增加( t＝9.82， P<0.05)，TNF- α和MPO浸润程度明显降低( t＝15.44、14.33， P<0.05)。此外，rhADAMTS13干预能显著降低照射后1和3 d小鼠血浆CRP( t＝5.02、2.96， P<0.05)和MDA( t＝2.47、2.55， P<0.05)的含量，并增加SOD活性( t＝2.64、5.64， P<0.05)和T-AOC( t＝3.05、5.07， P<0.05)。 结论:rhADAMTS13能够通过降低炎症和氧化应激水平减轻电离辐射所致小鼠肠损伤，为放射性肠损伤的防护提供了一种新的策略。

目的:探讨含WW结构域的转录因子1(WWTR1或TAZ)在创伤后骨性关节炎(PTOA)中对软骨细胞的调控作用。方法:由贵州医科大学动物实验中心提供20只c57bl/6J小鼠简单随机法分为假手术组(Sham)组、内侧半月板(DMM)不稳定组，每组6例，3个月后取材。苏木精-伊红(HE)染色和番红O固绿(Safranin O)染色验证模型是否构建成功和根据国际骨关节炎研究学会(OARSI)对骨关节软骨损伤进行分级，免疫组织化学法检测TAZ的表达。分离培养膝关节原代软骨细胞，将其分为对照组(Control)和TAZ抑制组(TAZ inhibitor-1)进行体外实验。通过免疫荧光检测TAZ inhibitor-1对TAZ表达的影响。蛋白质印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测TAZ inhibitor-1对软骨细胞合成和分解代谢相关因子表达的影响。组间比较采用 t检验。 结果:HE结果显示，DMM组滑膜比对照组有增厚和有炎性细胞浸润。Safranin O染色显示，根据OARSI评分DMM组关节软骨浅层比对照组有降解和软骨下骨增厚[(4.333±1.731)分比(1.000±0.167)分， t＝21.240， P<0.01]。免疫组织化学结果显示，DMM组TAZ表达低于对照组(63.333±2.667比44.500±1.500， t＝19.210， P<0.01)。在体外实验中，免疫荧光结果显示，TAZ inhibitor-1组软骨细胞内TAZ的表达低于对照组(44.406±1.731比54.772±5.419， t＝15.860， P<0.01)。Western blot结果显示，TAZ inhibitor-1组二型胶原酶Ⅰ(Col2a1)、糖胺聚糖(ACAN)表达低于对照组(0.470±0.038比0.937±0.330，0.589±0.015比0.859±0.037， t＝20.830、17.160， P<0.01)，TAZ inhibitor-1组基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、含TSP样基序的去整合素金属蛋白酶(ADAMTS)-7表达高于对照组(0.897±0.004比0.540±0.018、0.956±0.007比0.605±0.013， t＝4.920、8.056， P<0.01)。qPCR结果显示，TAZ inhibitor-1组MMP-13、ADAMTS-7、SOX5等基因表达高于对照组(1.697±0.030比1.000±0.007、5.242±0.343比1.000±0.031、0.769±0.018比1.000±0.030， t＝22.820、23.820、12.270， P<0.01)，TAZ inhibitor-1组COl2a1、ACAN、刺猬因子重组蛋白(IHH)等基因表达低于对照组(0.524±0.047比1.001±0.069、0.664±0.310比1.001±0.624、0.367±0.024比1.002±0.085， t＝10.580、8.875、13.660， P<0.01)。 结论:TAZ在软骨细胞中通过调节软骨细胞的代谢促进PTOA的发生发展。

目的:探讨血管性血友病因子裂解酶ADAM金属肽酶含血小板反应蛋白1型13(ADAMTS13)间隔区结构域在血管性血友病因子(vWF)裂解过程中的生物学功能,阐明ADAMTS13在血栓性血小板减少性紫癜(TTP)发病机制中的作用.方法:将ADAMTS13间隔区结构域中的氨基酸残基TEDRLPR以点突变技术逐个基因突变(突变体M1～M7),将构建的ADAMTS13与其突变体质粒转染至人胚肾HEK293细胞,稳定表达后提纯重组蛋白.观察野生型和突变型ADAMTS13在变性条件、剪切应力作用和ADAMTS13抗体处理后裂解vWF的能力.结果:荧光共振能量转移(FRET)实验,与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)对FRET-vWF73剪切能力降低(P＜0.05).变性条件下,野生型ADAMTS13可以将vWF多聚体裂解,与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)的裂解活性明显降低(P＜0.01).在体外剪切应力作用下,与野生型 ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体 M4(R635A)和突变体M7(R638A)裂解vWF多聚体的能力明显降低(P＜0.01).与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)与vWF之间的结合力差异无统计学意义(P＞0.05),表明ADAMTS13的C末端与vWF之间存在多个结合位点.ADAMTS13抗体处理可在一定程度上抑制野生型和突变型ADAMTS13裂解vWF的能力.结论:间隔区突变后ADAMTS13的活性降低.ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)可能是ADAMTS13在底物识别时的重要作用位点.

目的:研究血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)在无流体剪切力下裂解内皮细胞上特大血管性血友病因子(ULVWF)的分子机制,为探明血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和其他血栓性疾病的发病机理提供理论依据.方法:通过免疫荧光显微镜观察ADAMTS13在无流体剪切力下裂解内皮细胞表面上ULVWF的情况,采用ELISA测定不同条件下培养基中VWF抗原量的变化.ELISA和Western blot分别测定有无流体剪切力或凝血因子Ⅷ(FⅧ)条件培养基中的VWF和蛋白水解片段的数量.多聚体分析评估ADAMTS13裂解内皮细胞上ULVWF的情况.将组胺刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与ADAMTS13和各种N-和C-末端截断的突变体一起孵育,通过免疫荧光显微镜观察与细胞保持结合的ULVWF,ELISA测定内皮细胞释放出的ULVWF,确定降解内皮细胞上ULVWF所需的ADAMTS13结构域.结果:在无流体剪切力下,重组ADAMTS13和血浆ADAMTS13迅速降解了内皮细胞表面上新形成的ULVWF.ULVWF的蛋白水解过程依赖于培养时间、ADAMTS13浓度和剪切力.ADAMTS13介导的蛋白水解释放的VWF分布与组胺刺激下内皮细胞分泌的VWF分布非常相似,提示ULVWF在内皮细胞表面发生裂解.裂解内皮细胞上ULVWF需要ADAMTS13半胱氨酸富集区(Cys-rich,CysR)结构域和间隔区结构域,但不需要ADAMTS13的7个TSP1重复序列(TSP1 2-8)和2个补体结合区(CUB)结构域.结论:内皮细胞上ULVWF聚合物在无流体剪切力下也对ADAMTS13的裂解敏感,这为ADAMTS13裂解内皮细胞结合的ULVWF的分子机制提供了新见解,并可能有助于理解TTP和其他血栓性疾病的发病机理.

目的 探讨血管性血友病因子裂解蛋白酶13(ADAMTS13)在急性脑梗死(ACI)患者静脉溶栓后的动态变化及临床意义.方法 收集2020 年1 月至2021 年12 月于广西壮族自治区人民医院接受重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓治疗的83 例轻度、中度ACI患者临床资料,根据患者入院时美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分将其分为轻度组(NIHSS评分≤5 分,44 例)和中度组(5 分＜NIHSS评分＜15 分,39 例).于溶栓前、溶栓后24h和72h采集患者的血清,采用Luminex技术检测ADAMTS13 水平.分析ADAMTS13 水平与ACI病情严重程度及预后的关联性.结果 与溶栓前相比,轻度组和中度组溶栓后的ADAMTS13 水平均呈下降趋势,两组间各时间点ADAMTS13 水平比较差异无统计学意义(P＞0.05).多因素logistic回归分析结果显示,溶栓前ADAMTS13 水平与患者入院时病情严重程度无显著关联[OR(95%CI)= 0.280(0.036～2.196),P =0.226],溶栓后72h较高的ADAMTS13 水平是抑制ACI患者治疗后 90d不良预后发生的保护因素[OR(95%CI)=0.556(0.005～0.991),P =0.049].受试者工作特征(ROC)曲线分析结果提示,溶栓后72h的ADAMTS13 水平具有预测ACI患者治疗后90d预后情况的应用价值[AUC(95%CI)= 0.693(0.547～0.839),P =0.021],其最佳截断值为5.860,对应的灵敏度和特异度分别为76.90%和56.50%.结论 ACI患者静脉溶栓后早期血清ADAMTS13 水平呈下降趋势,溶栓后72h较高的ADAMTS13 水平是抑制ACI患者治疗后90d不良预后发生的保护因素.

背景:血管性血友病因子水解蛋白酶13(a disintegrin and metaloproteinase with a thrombospondin type 1 motif,member 13,ADAMTS13)可结合并酶切血管性血友病因子,在防止血小板过多聚集和血栓的形成中起到关键作用.重组ADAMTS13通常选择在真核细胞中表达分泌,然而对于其表达纯化目前仍缺乏一个明确高效的途径.目的:寻找合适的宿主细胞,得到稳定表达野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的细胞株,建立高纯度ADAMTS13的纯化方法,进而研究其生物学功能.方法:以野生型ADAMTS13重组质粒为模板,利用位点突变试剂盒得到功能增强型ADAMTS13重组质粒.比较CHO-S细胞、CHO-K1细胞、293T细胞对ADAMTS13的表达效果,挑选出合适的宿主细胞.通过Ni柱亲和层析和分子筛纯化蛋白;采用7.5％SDS-PAGE、Western-blot鉴定野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的纯度及特异性;利用原子力显微镜技术检测野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的相互作用,鉴定两种蛋白的活性.结果与结论:相对于CHO-S和CHO-K1,293T细胞更适合作为野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的表达宿主;经Ni柱亲和层析和分子筛纯化后,所得到的野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13质量浓度分别为103.7,149.7 mg/L,且两种蛋白纯度均约90％;原子力显微镜检测结果显示,野生型ADAMTS13、功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的黏附频率分别为11.37％,14.70％,表明功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的结合亲和力更高,这与近期ADAMTS13构象研究一致.

血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)是一组微循环障碍性疾病.发病的根本原因为血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)遗传性或获得性缺陷,血管性血友病因子(VWF)多聚体裂解障碍、导致微血栓形成.在疾病发现最初,TTP死亡率超过90％,随着研究进展,以全血交换输血、血浆输注、血浆置换(PEX)为主要治疗方式,生存率提高到78％.此后近20年TTP的治疗几乎没有新进展.但目前出现了一批新型靶向治疗药物,有望将TTP治疗从经验性治疗推向靶向治疗的新时代,进一步降低死亡率及复发率.本文就TTP发病机理以及治疗新进展进行综述.

目的 探究过表达miR-140-5p的人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)对骨关节炎的治疗作用.方法 从正常足月剖宫产健康新生儿脐带标本中分离和培养hUC-MSC.用过表达miR-140-5p的重组慢病毒载体pLenO-DCE-Puro-miR-140-5p或空慢病毒载体转染293T细胞,收集重组慢病毒悬液.将hUC-MSC分为感染组(过表达miR-140-5p组)、空病毒组和对照组,分别应用相应的慢病毒悬液处理感染组和空病毒组hUC-MSC,MTT法测定hUC-MSC增殖能力.将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组(n=15)、模型组(n=15)、空病毒组(n=15)和过表达miR-140-5p的重组慢病毒组(miR-140-5p组,n=15).通过切断大鼠右膝关节的前交叉韧带建立骨关节炎模型.空病毒组和miR-140-5p组大鼠分别关节腔内注射50μl空病毒或过表达miR-140-5p的重组慢病毒感染的hUC-MSC(1×106个细胞),假手术组和模型组大鼠注射等体积PBS,共给药8周,每周注射3次.番红O-固绿染色和OARSI评分考察软骨退变情况.RT-PCR或Western blot检测大鼠软骨组织中miR-140-5p、SOX9、collagenⅡ、Aggrecan、NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的表达.结果 感染组、空病毒组和对照组的细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05).与模型组相比,miR-140-5p组大鼠的番红O染色明显加深.miR-140-5p组的OARSI评分均显著低于模型组(P<0.05).miR-140-5p组collagenⅡ(COL2A1)、Aggrecan和SOX9的表达水平均显著高于模型组(P<0.05).miR-140-5p组NLRP3、caspase-1、MMP13和ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平均显著低于模型组(P<0.05).结论 通过关节腔内注射过表达miR-140-5p的hUC-MSC可显著抑制骨关节炎大鼠的软骨退变并提高软骨修复功能.

为探究转移相关肺腺癌转录本 1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)对 miR-146a 的调控作用及其对关节软骨细胞凋亡和基质降解的影响,采用RT-PCR检测临床软骨组织中miR-146a和MALAT1的表达,分析其变化的相关性;双荧光素酶报告基因试验检测miR-146a和MALAT1的靶向作用关系;之后分组并转染miR-146a mimics或MALAT1重组过表达载体,经过IL-1β处理,采用RT-PCR检测miR-146a表达,CCK-8检测细胞增殖水平,Hoechst检测细胞凋亡水平,Western blotting检测活化型半胱天冬酶3(cleaved caspase 3,cl-CASP3)、B细胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相关 X 蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、基质金属蛋白酶 13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素金属蛋白酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS-5)、Ⅱ型胶原蛋白(collagen Ⅱ,COL2)、聚蛋白聚糖蛋白水平.结果显示,相比于普通关节软骨组织,骨关节炎(osteoarthritis,OA)关节软骨组织MALAT1相对表达水平升高(P＜0.05),miR-146a相对表达水平降低(P＜0.05),MALAT1与miR-146a表达呈负相关(r=-0.907 8,P＜0.001);双荧光素酶报告基因试验显示,miR-146a和MALAT1存在靶向作用关系;相比于IL-1β组,miR-146a组细胞增殖水平降低,细胞凋亡率及cl-CASP3、Bax相对蛋白表达水平升高,Bcl-2相对蛋白表达水平降低,同时MMP-13和ADAMTS-5相对蛋白表达水平升高,COL2和聚蛋白聚糖相对蛋白表达水平降低(均P＜0.01);MALAT1过表达可显著降低miR-146a的表达水平,提高细胞增殖活性并抑制其凋亡,同时降低MMP-13和ADAMTS-5相对蛋白表达水平,提升COL2和聚蛋白聚糖相对蛋白表达水平(均P＜0.01).该研究提示,MALAT1可通过靶向作用于miR-146a发挥对软骨细胞的抗凋亡作用.