目的:评价长链非编码RNA-肺癌转移相关转录本1/微小RNA-145/Bcl-2和腺病毒E1B19k Da相互作用蛋白3(Lnc-MALAT1/miRNA-145/BNIP3)信号通路在舒芬太尼预处理对大鼠心肌保护效应中的作用。方法:大鼠H9C2细胞以1×10 6个/ml密度接种于6孔培养板或培养瓶，采用随机数字表法分为5组( n＝30)：对照组(C组)、缺氧复氧组(H/R组)、舒芬太尼预处理组(S组)、真核细胞表达载体pcDNA3.0组(pcDNA组)和pcDNA-MALAT1组(MALAT1组)。S组用10 μmol/L舒芬太尼孵育2 h，随后制备缺氧复氧损伤模型；pcDNA组和MALAT1组分别用pcDNA3.0及pcDNA-MALAT1转染，转染后24 h用10 μmol/L舒芬太尼孵育2 h，随后制备缺氧复氧损伤模型。于复氧后2 h时，采用Real-time PCR法检测Lnc-MALAT1、miRNA-145及BNIP3 mRNA的表达水平；采用CCK-8法检测细胞存活率；采用流式细胞仪检测细胞凋亡率；分别采用硫代巴比妥酸显色法、羟胺法和微板法检测细胞MDA、SOD水平及LDH漏出量；采用Western blot法检测Bcl-2、Bax及cleaved-caspase-3表达水平。 结果:与C组比较，其余4组细胞存活率降低，凋亡率升高，MDA水平及LDH漏出量升高，SOD水平降低，LncRNA-MALAT1、BNIP3 mRNA、Bax和cleaved-caspase-3表达上调，miRNA-145和Bcl-2表达下调( P<0.05)；与H/R组比较，S组和pcDNA组细胞存活率升高，凋亡率降低，MDA水平及LDH漏出量降低，SOD水平升高，LncRNA-MALAT1、BNIP3 mRNA、Bax和cleaved-caspase-3表达下调，miRNA-145和Bcl-2表达上调( P<0.05)；与S组比较，MALAT1组细胞存活率降低，凋亡率升高，MDA水平及LDH漏出量升高，SOD水平降低，LncRNA-MALAT1、BNIP3 mRNA、Bax和cleaved-caspase-3表达上调，miRNA-145和Bcl-2表达下调( P<0.05)。 结论:舒芬太尼预处理对大鼠心肌保护效应的机制与抑制Lnc-MALAT1/miRNA-145/BNIP3信号通路有关。

目的:采用离体实验评价蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51 (PTPIP51)调节的线粒体相关内质网膜(MAMs)结构改变在七氟烷致大鼠海马神经元程序性坏死中的作用。方法:原代培养SD大鼠胎鼠的海马神经元，培养7 d时，以5×10 5个/ml细胞密度接种于培养孔(100 μl/孔)或培养瓶(3 ml/瓶)中，采用随机数字表法分为4组( n＝19)：对照组(C组)、七氟烷组(Sev组)、七氟烷＋siRNA-PTPIP51转染组(Sev＋siPTPIP51组)和七氟烷＋无义siRNA转染组(Sev＋siNC组)。将Sev组、Sev＋siPTPIP51组和Sev＋siNC组神经元置于含2%七氟烷的培养箱中37 ℃培养5 h。收集神经元，采用MTT法检测存活率，采用流式细胞术检测胞浆游离钙离子浓度([Ca 2＋] i)及程序性坏死率，采用Western blot法检测PTPIP51、受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)、RIPK3和磷酸化人混合系列蛋白激酶样结构域(p-MLKL)的表达，透射电镜下观察并记录MAMs长度、内质网周长和线粒体周长。 结果:与C组比较，Sev组神经元活力下降，[Ca 2＋] i、程序性坏死率升高，PTPIP51、RIPK1、RIPK3和p-MLKL表达上调，MAMs长度/内质网周长比值和MAMs长度/线粒体周长比值升高( P<0.05)。与Sev组比较，Sev＋siPTPIP51组神经元活力升高，[Ca 2＋] i和程序性坏死率降低，PTPIP51、RIPK1、RIPK3和p-MLKL表达下调，MAMs长度/内质网周长比值和MAMs长度/线粒体周长比值降低( P<0.05)，Sev＋siNC组上述指标差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:PTPIP51表达上调介导MAMs的结构改变参与了七氟烷诱发海马神经元程序性坏死的过程。

1例36岁异位妊娠患者采用药物保守治疗。医嘱为米非司酮100 mg口服，1次/d，连续3 d；第4天甲氨蝶呤（MTX）80 mg入0.9%氯化钠注射液40 ml静脉泵入。第4天，当班护士未严格核对医嘱，误将规格为1 000 mg/瓶的MTX全部入0.9%氯化钠注射液40 ml并在30 min内静脉泵入。13 h后，患者出现恶心、呕吐、腹痛等症状。2 d后实验室检查示血清肌酐325 μmol/L，尿素氮8.6 mmol/L，尿酸501 μmol/L。考虑为急性肾衰竭，与MTX有关。患者转院并接受血液透析和对症治疗6 d后好转，12 d后复查：血清肌酐73 μmol/L，尿素氮4.1 mmol/L，尿酸363 μmol/L。

目的 探讨负载miR-34a的Bio-Oss?骨粉与转谷氨酰胺酶交联明胶(transglutaminase crosslinked gela-tin,Col-Tgel)的联合使用对辐照损伤大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化作用及对辐照区骨缺损修复的作用.方法 本实验已获得单位实验动物伦理委员会批准.取2周龄SD大鼠长骨骨髓,培养BMSCs并进行鉴定.当BMSCs生长至贴满瓶底80%时,进行2 Gy 剂量X线照射,制备BMSCs辐照损伤模型备用.将2.5、5 μL Col-Tgel分别加入10 mg Bio-Oss?骨粉(P)中,制备复合骨替代材料PG-2.5和PG-5,通过体外和体内实验筛选骨粉与水凝胶合适比例.将lipofectamine 2000分别与Cy3-agomiR-34a、agomiR-34a或agomiR NC混合,然后将各组混合液分别加入10 mg Bio-Oss?骨粉(P)并进行冷冻干燥.将上述负载各组miR的 10 mg Bio-Oss?骨粉和未负载miR的Bio-Oss?骨粉分别与 2.5 μL Col-Tgel混合,制备PG-Cy3-miR-34a、PG-miR-34a、PG-miR NC、PG组复合骨替代材料.将辐照后的BMSCs与PG-Cy3-miR-34a组复合骨替代材料共培养,使用共聚焦显微镜观察转染效果.将辐照后的BMSCs与PG-miR-34a组、PG-miR NC组、PG组复合骨替代材料共培养,使用RT-qPCR检测miR-34a表达、CCK-8检测细胞增殖,并在成骨诱导14 d后利用RT-qPCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达.取8周龄SD大鼠进行双侧胫骨15 Gy 剂量X线照射,3周后在胫骨干骺端骨骺线下方2～3 mm处制备直径3 mm、深度2 mm的胫骨缺损,缺损区分别置入PG-miR-34a组、PG-miR NC组、PG组复合骨替代材料,植入8周后取材行micro-CT和HE切片观察体内骨缺损修复效果.结果 2 Gy辐照影响BMSCs成骨分化能力,辐照组ALP染色浅于非辐照组,辐照组茜素红染色矿化结节少于非辐照组.10 mg Bio-Oss?骨粉与2.5 μL Col-Tgel构建的复合材料具有较好的操作性能和成骨性能,并用于后续实验.PG-Cy3-miR-34a可将负载的Cy3-agomiR-34a转染入辐照损伤BMSCs中.PG-miR-34a可提高辐照损伤BMSCs中miR-34a的表达水平,对细胞增殖无抑制作用,并能显著促进成骨相关基因Runx2、ALP、OCN的表达.在辐照区骨缺损修复实验中,micro-CT显示PG-miR-34a组骨缺损区新生骨体积高于其他组,HE切片染色结果也验证了PG-miR-34a可促进骨缺损修复.结论 miR-34a骨粉复合胶原基水凝胶可促进辐照损伤BMSCs体外成骨分化,促进辐照区骨缺损修复.

目的 基于质量源于设计(Quality by Design,QbD)理念,开发一种具有较高生物量与较高菌体活力培养特点的大肠埃希菌摇瓶阶段培养工艺.方法 以不同摇瓶配置为考察因素,菌体悬浮液A600值、培养物湿菌重和菌体活力值为培养结果考察指标,采用方差分析分析培养结果以获得具有高生物量和高菌体活力的第3次扩增摇瓶配置.以摇床温度和摇床转速为试验因子进行2因子2水平全因子试验,菌体悬浮液A值为响应值,培养累计时间为变量因素,摇床实时在线温度与摇床设备自测转速为补充变量因素,采用函数型主成分分析(functional principal component analysis,FPCA)方法进行广义回归,拟合生长曲线模型,通过生长曲线模型获得优化后的培养停止时间及培养工艺,对响应值添加随机噪声蒙特卡洛模拟(Monte Carlo simulation,MCS),再次优化获得摇床培养工艺设计空间,选择设计空间中最劣条件作为验证试验设定条件,以不同培养停止时间分阶段进行连续10批次验证试验.结果 第3次扩增摇瓶配置:5L一次性高效摇瓶,大面积透气膜盖.培养工艺设计空间:摇床温度36.5～37.5 ℃,摇床转速220～230 r/min,设计培养停止时间18 h.最劣条件验证试验表明,停止培养时间为16 h时,可获得较高菌体活力值且较低生物量的培养结果,停止培养时间为18 h时,可获得较高水平的生物量及菌体活力值.结论 本研究设计的大肠埃希菌摇瓶阶段培养工艺具有较高生物量及较高菌体活力培养特点,同时可依据此培养工艺适应性调整以满足不同培养需求.

竹黄菌Shiraia sp.的子座或子实体是我国传统中药——竹黄,具有化痰止咳、活血祛风、利湿的功效,其主要活性成分为苝醌类化合物——竹红菌素,竹红菌素具有抗肿瘤、抗病毒的光敏活性.从短穗竹Brachystachyum densiflorum茎秆中分离筛选到1株内生竹黄菌Shiraia sp.S8,其无性菌丝培养可产胞外漆酶.在自然pH、28 ℃、150 r/min振荡摇瓶培养8 d后,胞外漆酶的酶活达1 361 U/L.胞外漆酶粗酶液的最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.0且在pH为6.0～7.0时具有较好的稳定性,108 h后残余酶活为50％.竹黄菌S8菌株胞外漆酶在33.33 μmol/L 2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)或266.66 μmol/L乙酰丁香酮介导作用下,可使活性蓝19、孔雀石绿和中性红快速脱色,60 min内脱色率分别可达85.06％、88.55％和81.13％.在竹黄菌转录组数据分析的基础上,克隆得到编码漆酶的cDNA序列(lcc1).该cDNA编码的蛋白具备完整的真菌漆酶保守结构域,前18个N末端氨基酸残基为典型信号肽序列,lcc1全长1 785 bp,开放阅读框(ORF)全长1 002 bp,编码594个氨基酸,预测其分子量为6.53×104,pI为6.05.本研究为真菌漆酶的生产提供了新的菌株资源,并为漆酶在染料废水处理上的应用提供了参考.

[背景]砂姜黑土地区存在秸秆腐解缓慢、秸秆还田后作物幼苗生长不良等问题.[目的]从砂姜黑土区农田筛选一株兼具秸秆腐解能力的玉米促生菌 MC29,以促进秸秆腐解和玉米作物生长.[方法]通过 16S rRNA基因序列分析对该菌株进行鉴定;采用液态摇瓶及盆栽试验验证菌株实际促腐、促生能力及土壤养分的提升效果,并且探究菌株的最佳生长及产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)条件;采用电击转化法将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因导入菌株细胞,并通过 PCR 琼脂糖凝胶电泳进行验证.[结果]分离筛选的玉米促生菌鉴定为纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans).该菌株 MC29 羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)酶活可达 13.32 U/mL,产IAA量为 8.63 mg/L.与对照相比,施用菌株MC29 后秸秆腐解率显著提高 24.8%;玉米soil and plant analyzer development(SPAD)值、植株总重、根表面积和根长分别提高 7.6%、21.3%、30.9%和 18.3%;土壤碱解氮含量显著提高 68.1%,土壤速效磷及土壤速效钾含量分别提高5.8%及6.0%.菌株MC29最佳生长条件为pH 7.0、装液量为25/250 mL、碳源为麦芽糖、氮源为酵母粉;最佳产IAA条件为pH 7.0、装液量为 50/250 mL、碳源为果糖、氮源为硝酸钾;成功构建荧光标记菌株MC29-GFP,并据此追踪到其接入砂姜黑土 15 d后定殖量为 2.8×105-9.5×105 copies/g.[结论]所筛选的纤维化纤维微细菌MC29 对于指导砂姜黑土区多功能秸秆促腐菌剂、微生物菌肥的研制及提升作物产量有一定的积极意义,并为探究其在砂姜黑土中的实际应用奠定基础.

[目的]通过对甲酸乙酯(ethyl formate,EF)和异硫氰酸甲酯(methyl isothiocyanate,MITC)单剂和混剂(EF+MITC)熏蒸处理的菜豆象Acanthoscelides obtectus转录组数据分析,初步探究EF和MITC对菜豆象的联合作用机制.[方法]采用广口瓶熏蒸法对菜豆象成虫进行EF(22.398μL/L)和MITC(0.854μL/L)单剂和混剂[(EF+MITC)(14.764 μL/L)]熏蒸处理,对照组(CK)不做熏蒸处理;利用Illumina Hi SeqTM 4000测序平台对EF和MITC单剂和混剂(EF+MITC)熏蒸处理的菜豆象成虫进行转录组测序;对差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行GO分类和KEGG通路富集分析;选取6个DEGs进行RT-qPCR验证.[结果]CKvsEF与CKvsMITC比较组分别有171和293个DEGs,上调基因居多;而CKvsEF+MITC比较组的DEGs数量为1 745个,下调基因居多.DEGs的GO分类表明,CK vs EF与CKvsMITC比较组的DEGs富集数最多的条目均为细胞解剖学实体、结合和催化活性,CKvs EF+MITC比较组的DEGs则主要富集在细胞解剖学实体、结合和细胞过程等.DEGs的KEGG通路富集分析表明,CKvsEF比较组的DEGs主要富集在蛋白质消化与吸收、溶酶体和内质网蛋白加工通路上,CKvsMITC比较组的DEGs主要富集在粘着斑、细胞外基质受体相互作用和昆虫激素生物合成等通路上,CK vs EF+MITC比较组的DEGs主要富集中在RNA转运、DNA复制和错配修复等通路上.此外,EF和MITC单剂熏蒸处理后,菜豆象成虫体内分别有2和3个解毒酶基因表达量较CK显著下调,而EF+MITC混剂熏蒸处理后,菜豆象体内5个解毒酶基因表达量较CK显著下调.筛选的6个DEGs的表达趋势与转录组数据基本一致.[结论]本研究结果表明,EF与MITC混用具有协同增效作用,能够诱导菜豆象发生细胞基因毒性损伤,抑制菜豆象解毒酶基因的表达可能是其增效的主要原因,初步明确了 EF与MITC混用最优配方对菜豆象的熏蒸杀虫分子机制,为进一步研究EF与MITC对菜豆象的联合作用机制提供重要参考.

目的 采用HEK-293F细胞瞬时转染表达重组人干扰素λ1(recombinant human interferonλ1,rhIFNλ1),并进行鉴定.方法 通过2种信号肽[T细胞受体(T cell receptor,TCR)和天然信号肽(nature signal peptide,NSP)]、3种载体[pcDNA3.4、泛染色质开放原件(ubiquitous chromatin opening element,UCOE)、PFR]和目的基因 rhIFNλ 1 构建6种信号肽-载体组合的重组质粒,以HEK-293F为宿主细胞,摇瓶规模瞬时转染表达rhIFNλ1.选择NSP及载体UCOE构建低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ,瞬时转染HEK-293F细胞,表达产物经阳离子交换层析(HiTrap SP FF)、蓝胶层析(HiTrap Blue HP)和分子筛凝胶过滤层析(Sephacryl S-100 HR)3步纯化,纯化产物进行Western blot及反相HPLC分析,并检测质谱分子量及N-末端氨基酸序列.结果 6种重组质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确.随着转染时间的延长,6种表达产物的表达量逐渐增加,转染6 d时最高,达10～20 mg/L.低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ经双酶切及测序鉴定,证明构建正确.重组质粒UCOE-Q46-λ转染HEK-293F细胞6 d,细胞培养上清纯化产物的相对分子质量约27 800,纯度达97.372％,且可与小鼠抗人IL-29/IFNλ1单克隆抗体发生特异性结合;反相HPLC检测分析可见2个峰,出峰时间分别为15.6和20.0 min;质谱分子量约为24 000;N-末端5个氨基酸序列为G-P-V-P-T.结论 HEK-293F细胞表达的rhIFNλ1纯度较高,为该蛋白的进一步研究奠定了基础.

以款冬幼嫩叶柄为材料,研究植物生长调节剂对其离休培养与植株再生的影响,建立了款冬离体快繁技术体系.结果表明:款冬叶柄切段较理想的灭菌方法为75％乙醇浸泡30 s,转入饱和漂白粉上清液浸泡15 min;适合愈伤诱导的培养基为MS +6-BA 3.0 mg·L-1 +2,4-D 2.0 mg·L-1,诱导率96.2％;在培养基MS +ZT2.0 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1上芽苗分化效果较好,分化率91％,平均芽数8.26个;较佳的不定芽增殖培养基为MS+KT 1.0 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1,增殖倍数为11.81,平均苗高4.9 cm;生根培养基为1/2MS+ IBA 0.2 mg·L-1,生根数平均为5.68条,生根率为95.22％以上;瓶苗移栽于河沙-有机肥3∶1的基质中生长良好,成活率达90％以上;大田试验表明:同等栽培条件下款冬组培株、栽培株和野生株在生长量与花粒产量等方面存在显著差异,以组培株生长量与花粒产量相对较高.组培品与野生品有效成分含量基本一致.