目的:观察Bufalin(蟾蜍灵)、AMD3100(普乐沙福)作为药物单独或联合作用于胆囊癌细胞株(GBC-SD)后，观察其对细胞增殖、迁移、凋亡以及CD133表达的影响，探讨其在胆囊癌中的作用。方法:收集2017年1月至2021年12月郑州大学第二附属医院手术切除的胆囊癌标本20例，通过免疫组织化学法检测CD133在肿瘤以及癌旁组织的表达的差异。用不同浓度的Bufalin(80、160、320 nmol/L)；AMD3100(10、20、40 μmol/L)及联合用药(Bufalin 160 nmol/L+AMD3100 20 μmol/L)干预人胆囊癌(GBC-SD)细胞，细胞计数试剂盒(CCK-8)法观察药物对肿瘤细胞增殖产生的影响，Transwell小室法检测肿瘤细胞迁移能力，膜联蛋白V(Annexin V)/碘化丙锭(PI)法检测细胞凋亡，流式细胞法检测细胞CD133分子表达。率的比较采用 χ2检验，组间比较用单因素及双因素方差分析。 结果:免疫组织化学结果示CD133分子在人胆囊癌组织中的阳性表达率为85%，明显高于癌旁组织表达率[30%， χ2＝10.23， P<0.01]，表达定位于胞质和胞核，流式结果显示CD133在GBC-SD细胞中阳性表达。Bufalin(80、160、320 nmol/L)作用(24、48、72 h)后与对照比较实验组细胞增殖受到明显抑制( F＝21.389、57.231、73.444， P<0.05)。160 nmol/L的Bufalin作用后细胞迁移数为(114.33±5.51)，明显低于对照组(270.67±13.65， F＝241.989， P<0.01)。CD133分子表达水平为(1.48±0.14)，低于对照组(3.22±0.46， F＝202.589， P<0.01)，细胞凋亡率[(32.57±0.69)%]高于对照组[(16.35±0.33)%， F＝171.288， P<0.01]。AMD3100组中，与对照组比较AMD3100 20 μmol/L作用48 h细胞活性为(87.58±7.10)%，40 μmol/L作用48 h为(67.84±0.75)%( F＝57.231， P<0.05)，40 μmol/L作用72 h[(72.57±10.23)%， F＝73.444， P<0.05]使细胞增殖明显受抑。40 μmol/L的AMD3100作用后，与对照组细胞迁移个数[(270.67±13.65)个]明显低于实验组[(193.33±8.08)个， F＝241.898， P<0.01]。CD133分子表达水平实验组为3.07±0.11，对照组为3.22±0.46，差异无统计学意义( F＝202.589， P>0.05)。凋亡率对照组为(16.35±0.33)%，实验组为(16.37±1.81)%，差异无统计学意义( F＝171.228， P>0.05)。联合用药组(Bufalin 160 nmol/L+AMD3100 20 μmol/L)与对照组比较各时间(24、48、72 h)细胞增殖均受到抑制( F＝21.389、57.231、73.444， P<0.05)；细胞迁移个数为(270.67±13.65)个，实验组为(133.67±6.50)个，差异有统计学意义( F＝241.898， P<0.01)。CD133分子表达水平(2.19±0.68)低于对照组(3.22±0.46， F＝202.589， P<0.01)。细胞凋亡率[(33.58±1.67)%]高于对照组[(16.35±0.33)%， F＝171.228， P<0.01]。 结论:CD133在GBC-SD细胞中阳性表达，在胆囊癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织。Bufalin、AMD3100可抑制胆囊癌细胞增殖、迁移。Bufalin单独以及与AMD3100联合用药抑制胆可囊癌细胞增殖、迁移、并促进细胞凋亡、抑制CD133分子表达。

Background::Previous studies have shown that bufalin exerts antitumor effects through various mechanisms. This study aimed to determine the antineoplastic mechanism of bufalin, an extract of traditional Chinese medicine toad venom, in ovarian cancer.Methods::The 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), 5-ethynyl-2 ′-deoxyuridine (EdU), and colony formation assays were used to investigate the antiproliferative effect of bufalin on the ovarian cancer cell line SK-OV-3. Molecular docking was used to investigate the combination of bufalin and epidermal growth factor receptor (EGFR) protein. Western blotting was performed to detect the expression of EGFR protein and its downstream targets. Results::Bufalin inhibited the proliferation of SK-OV-3 cells in a dose- and time-dependent manner. Bufalin was confirmed to combine with EGFR protein using molecular docking and downregulate expression of EGFR. Bufalin inhibited phosphorylation of EGFR, protein kinase B (AKT), and extracellular signal-regulated kinase (ERK).Conclusion::Bufalin suppresses the proliferation of ovarian cancer cells through the EGFR/AKT/ERK signaling pathway.

目的 探索蟾毒灵通过Janus激酶2(JAK2)/信号转导子和转录激活子3(STAT3)通路抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭的机制研究.方法 将人结直肠癌HT29细胞随机分为对照组和低、中、高剂量实验组;对照组细胞不做处理,低、中、高剂量实验组细胞分别给予2.5、5.0、10.0 μmol·L-1的蟾毒灵处理48 h.用FLAG STAT3慢病毒感染HT29细胞后,细胞分为慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染(10.0μmol.L-1)组.用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞存活率;用克隆实验验证细胞增殖率;用Transwell实验验证蟾毒灵作用后细胞的迁移能力;用蛋白质印迹(Western blot)法检测慢病毒转染效率以及细胞相关蛋白表达情况.结果 药物作用48 h后,对照组和低、中、高剂量实验组细胞数分别为(1 003.25±255.53)、(698.00±152.25)、(562.13±31.56)和(449.50±82.40)个,侵袭细胞数分别为(932.00±188.84)、(742.22±108.64)、(514.67±124.82)和(343.56±86.42)个,p-JAK2蛋白相对表达水平分别为1.37±0.27、0.97±0.06、0.74±0.06 和 0.39±0.12;对照组、高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组细胞数分别为(906.88±211.71)、(389.00±143.08)、(1 279.38±210.34)和(604.75±12.52)个,侵袭细胞分别为(671.22±44.74)、(246.11±28.16)、(1 080.78±119.13)和(574.78±16.23)个.中、高剂量实验组的细胞增殖数量、细胞侵袭数量和p-JAK2蛋白相对水平与对照组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05);高剂量实验组、慢病毒感染组、高剂量实验+慢病毒感染组细胞增殖数量、细胞侵袭数量与对照组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 蟾毒灵可通过激活JAK2/STAT3信号通路抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭.

目的:在乏氧微环境中探讨蟾毒灵(bufalin,BU)抑制耐药结肠癌细胞诱导M2 型巨噬细胞极化对普通结肠癌细胞的作用.方法:培养基中加入氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)模拟乏氧环境,佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导人源单核细胞THP-1 分化为M0 巨噬细胞.分别采集乏氧条件下耐药结肠癌细胞、普通结肠癌细胞和BU作用于耐药结肠癌细胞的条件培养基(conditioned medium,CM),然后放入M0 巨噬细胞中.通过流式细胞术、Realtime PCR、ELISA 实验检测M2 型巨噬细胞极化标志因子的表达;运用CCK-8 和蛋白免疫印迹(western blot,WB)实验检测耐药结肠癌和普通结肠癌条件培养基诱导M2 型巨噬细胞极化后的上清对普通结肠癌的作用.结果:在缺氧环境下,与普通结肠癌细胞相比,耐药结肠癌细胞CM促进M2 型巨噬细胞标志物IL-10、TGF-β、CD11b、CD206 升高(P<0.01,P<0.05).极化巨噬细胞的上清液增加了普通结肠癌细胞中P-gp和Bcl-2 的表达,同时降低了Bax的表达和对奥沙利铂的敏感性.耐药结肠癌细胞经BU处理后,M2 型巨噬细胞标志物IL-10、TGF-β、CD11b、CD206 表达降低(P<0.01,P<0.05).此外,P-gp和Bcl-2 的表达减少,而Bax的表达增加,导致对OXA的敏感性增加.结论:乏氧条件下,结肠癌耐药细胞CM促进M2 型巨噬细胞极化,蟾蜍灵可通过调节M2 型巨噬细胞极化过程逆转结肠癌耐药.

目的 观察蟾毒灵联合索拉非尼对肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭能力的干预作用及对Ras同源基因蛋白A(RhoA)/含Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)/缺氧诱导因子1α(HIF1α)通路相关蛋白表达的影响.方法 取对数生长期的肝癌HepG2细胞,分别加入蟾毒灵、索拉非尼单药或联合处理24 h,CCK-8方法检测细胞增殖情况,明确后续实验药物干预浓度;将肝癌HepG2细胞分为空白对照组、蟾毒灵组、索拉非尼组、蟾毒灵联合索拉非尼组,空白对照组不进行任何处理,其余组加入相应药物培养24 h,观察肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭情况,West-ern blot 法检测RhoA/ROCK/HIF1α通路相关蛋白表达情况.结果 蟾毒灵、索拉非尼均可抑制肝癌HepG2细胞增殖,选择蟾毒灵4 μg/mL、索拉非尼20 μmol/L为后续实验干预浓度.各药物组肝癌HepG2细胞的迁移与侵袭率和索拉非尼组、蟾毒灵联合索拉非尼组肝癌HepG2细胞中RhoA、ROCK1、ROCK2、HIF1α蛋白相对表达量均明显低于空白对照组(P均＜0.05),且蟾毒灵联合索拉非尼组肝癌HepG2细胞的迁移与侵袭率和各蛋白相对表达量均明显低于蟾毒灵组和索拉非尼组(P均＜0.05).结论 蟾毒灵联合索拉非尼可通过调控RhoA/ROCK/HIF1α通路加强对肝癌HepG2细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用,可能是两者联合使用抑制肝癌复发转移的潜在机制.

目的 探索蟾毒灵对长春新碱所致的大鼠疼痛行为的影响及对脊髓内瞬时受体电位香草酸亚型 1(TRPV1)蛋白和星形胶质细胞活化的影响.方法 32 只SD雄性大鼠随机分为 4 组(n = 8):对照组(Control组)、长春新碱组(Vcr组)、长春新碱+蟾毒灵低剂量组(Vcr+Bufalin 0.25 mg·kg-1)、长春新碱+蟾毒灵高剂量组(Vcr+Bufalin 0.5 mg·kg-1).连续 10 d腹腔给予长春新碱(75 μg·kg-1)造模,治疗组连续10 d腹腔给予相应剂量的蟾毒灵.分别测定大鼠的热缩足潜伏期(TWL)和机械缩足反应阈(MWT).qPCR检测大鼠脊髓内trpv1、trpv4 mRNA的表达情况,Western blot法检测大鼠脊髓内TRPV1 蛋白表达情况.免疫荧光检测脊髓星形胶质细胞的活化情况.ELISA实验检测脊髓内肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达水平.结果 蟾毒灵可以提高大鼠热痛阈值及机械痛阈值,降低大鼠脊髓内TRPV1 蛋白表达水平,并可抑制长春新碱诱导的脊髓内星形胶质细胞的活化,降低TNF-α、IL-1β的过表达.结论 蟾毒灵可缓解长春新碱诱导的大鼠神经病理性疼痛,并可降低脊髓TRPV1蛋白的过表达及抑制星形胶质细胞活化和炎性反应.

目的 探讨蟾毒灵在体外对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的作用及初步机制.方法 以不同浓度的蟾毒灵处理MDA-MB-231细胞,M T T 法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡水平,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐法测定活性氧(ROS)水平,RT-PCR检测细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2 mRNA表达水平.结果 蟾毒灵可剂量依赖性地降低MDA-MB-231细胞的存活率,诱导细胞凋亡(P<0.01).蟾毒灵处理细胞后,细胞内ROS水平增加(P<0.01),Bax mRNA表达增加,而Bcl-2 mRNA 表达减少(P<0.05或P<0.01).结论 蟾毒灵在体外能抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖,诱导细胞凋亡,该作用可能与其升高细胞内ROS水平、上调Bax/Bcl-2的比例有关.

大肠癌是一种复杂的疾病,其发生发展涉及多个信号通路的异常.中医药在大肠癌的治疗中发挥了积极的作用,可以通过调控多个信号通路,影响大肠细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞衰老、细胞自噬、化疗耐药、上皮-间质转化、细胞侵袭和转移、血管生成等生物过程,从而发挥治疗的作用.研究显示,藤龙补中汤可以调控p16/p21-Rb信号通路,阻滞大肠癌细胞周期,促大肠癌细胞衰老.斑蝥素、白花蛇舌草、藤龙补中汤等中药可以调控大肠癌细胞凋亡通路,激发大肠癌细胞凋亡.黄芩素、和厚朴酚、左金丸等中药可以调控大肠癌核转录因子(NF)-κB通路,抑制大肠癌细胞增殖、促大肠癌细胞凋亡,增强化疗药的敏感性.澳洲茄胺、苦参碱、透脓散等中药可以调控大肠癌磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路,抑制大肠癌细胞增殖、促大肠癌细胞凋亡.Diterpenoid C,蟾毒灵,凌草乙素等可以调控大肠癌有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,抑制大肠癌细胞增殖、促大肠癌细胞凋亡或自噬.姜黄素、半枝莲、健脾复方等可以调控大肠癌分泌型糖蛋白(Wnt)/β-链蛋白(β-catenin)通路,抑制大肠癌细胞增殖或转移.去甲斑蝥素、乌索酸、海带多糖等可以调控大肠癌表皮生长因子受体(EGFR)通路,抑制大肠癌细胞增殖,阻滞细胞周期或激发细胞凋亡.氧化苦参碱、健脾解毒方、片仔癀等可以调控转化生长因子(TGF)-β/Smad通路,抑制大肠癌上皮-间质转化和转移.白花蛇舌草、半枝莲、肠复康等可以调控Hedgehog通路,抑制大肠癌血管生成.

目的:探讨蟾蜍灵对人脑胶质瘤的作用.方法:将不同浓度的蟾蜍灵作用于胶质瘤细胞后,用CCK-8法检测细胞增殖抑制率,克隆形成实验检测细胞法检测增殖抑制,Western-blot测定人端粒酶逆转录酶(hTERT)的蛋白表达,Real time-PCR检测hTERT基因表达水平,CCK-8法检测蟾蜍灵对人原代胶质瘤细胞的杀伤作用.结果:蟾蜍灵对胶质瘤细胞株细胞U251、U87增殖具有抑制作用,且呈时间和剂量依赖性,并且能够有效抑制U251及U87细胞的克隆形成.Western-blot结果显示hTERT蛋白表达随药物浓度增加而递减,Real time-PCR结果证实蟾蜍灵降低了hTERT基因表达.同时体外实验证明,蟾蜍灵对人原代胶质瘤细胞具有明显杀伤作用.结论:蟾蜍灵能够抑制胶质瘤细胞系细胞及人原代胶质瘤细胞增殖,同时通过抑制hTERT表达降低端粒酶活性以发挥其抗肿瘤的作用.

BF211,a bufalin (BF) derivative,exhibits stronger anti-cancer activity than BF but with potential cardiotoxicity.Fibroblast activation protein-α (FAPα) is a membrane-bound protease specifically expressed by carcinoma-associated fibroblasts,thus has been used for the selective delivery of anticancer agents.In this study,we used a FAPα-based prodrug strategy to synthesize a dipeptide (Z-GlyPro)-conjugated BF211 prodrug named BF211-03.BF211-03 was hydrolyzed by recombinant human FAPα (rhFAPα) and cleaved by homogenates of human colon cancer HCT-116 or human gastric cancer MGC-803 xenografts.In contrast,BF211-03 showed good stability in plasma and in the homogenates of FAPα-negative normal tissues,such as heart and kidney.In HCT-116 and MGC-803 cells with low levels of FAPα expression,BF211-03 displayed a lower in vitro cytotoxicity than BF211 with approximately 30 to 40-fold larger IC50 values,whereas in human breast cancer MDA-MB-435 cells with high levels of FAPα expression,the IC50 value difference between BF211-03 and BF211 was small (approximately 4-fold).Although the cytotoxicity of BF211-03 against tumor cells was dramatically decreased by the chemical decoration,it was restored after cleavage of BF211-03 by rhFAPα or tumor homogenate.In HCT-116 tumorbearing nude mice,doubling the dose of BF211-03,compared with BF211,caused less weight loss,but showing similar inhibitive effects on tumor growth.Our results suggest that BF211-03 is converted to active BF211 in tumor tissues and exhibits anti-tumor activities in tumor-bearing nude mice.FAPα-targeted BF211-03 displays tumor selectivity and may be useful as a targeting agent to improve the safety profile of cytotoxic natural products for use in cancer therapy.