基于肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)/磷脂酯肌醇 3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号轴研究赤芍-附子药对对慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)大鼠的治疗作用及对肝细胞再生的影响.采用牛血清白蛋白皮下及尾静脉注射联合脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)+D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)腹腔注射构建ACLF大鼠模型,实验设置正常对照(NC)组、模型(vehicle)组、赤芍-附子药对(SFYD,5.85 g·kg-1)组、促肝细胞生长颗粒(HGFG,4.05 g·kg-1)组.苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察大鼠肝组织病理变化.全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(alanineamino transferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transa-minase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL).ELISA 法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)炎症因子水平.免疫荧光染色检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞增殖相关抗原(antigen identified by monoclonal antibody,Ki67)及细胞周期蛋白(cell cycle protein B1,CyclinB 1)阳性表达.实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测HGF、结合蛋白Gab1(grb2 associated binding protein 1,Gab1)、PI3K、Akt、磷酸化 PI3K(phosphorylation PI3K,p-PI3K)、磷酸化 Akt(phosphorylation Akt,p-Akt)mRNA 及蛋白表达水平.结果显示,与vehicle组比较,SFYD组大鼠肝组织病理评分降低,肝功能及炎症反应改善,PCNA、Ki67、CyclinB 1荧光表达增强.同时与模型组相比,SFYD组HGF、Gab1蛋白表达上调,PI3K、Akt磷酸化激活.以上研究表明赤芍-附子药对通过减轻肝细胞炎症损伤以及促进肝细胞再生来达到抗肝衰竭的效应,其具体调控机制可能与激活HGF/PI3K/Akt信号通路有关.

目的 研究D-半乳糖(D-galactose,D-gal)对小鼠睾丸TM4支持细胞连接功能损伤以及淫羊藿素(icaritin,ICT)的改善作用机制.方法 首先将TM4细胞分为正常对照组、不同浓度D-gal处理组,Western blot检测TM4细胞连接功能相关蛋白(ZO-1、Occludin、β-catenin 和 Cx43)以及 ERα/FAK信号通路相关蛋白(ERα、FAK和pY397-FAK)表达水平的变化;随后MTT筛选ICT药物浓度,并将TM4细胞分为正常对照组、D-gal处理组、D-gal处理+不同浓度ICT组,Western blot检测上述蛋白表达水平变化;分子对接研究ERα与ICT之间的相互作用,并预测两者之间的亲和力;最后将TM4细胞分为正常对照组、D-gal处理组、ERα抑制剂组、D-gal+ICT组、ERα抑制剂+ICT组,Western blot检测上述蛋白表达水平的变化.结果 D-gal可浓度依赖性下调连接功能相关蛋白(ZO-1、Occludin、β-catenin 和 Cx43)以及 ERα/FAK信号通路相关蛋白(ERα、FAK和pY397-FAK)表达水平;给予ICT药物后,上述蛋白表达水平均明显上调;ERα和ICT分子对接结果显示,ERα的Asp351氨基酸残基与ICT之间形成2个距离为3.4 ?和2.4 ?的氢键,且两者之间的对接结合能小于-7 kcal·mol-1;ERα抑制剂处理TM4细胞后,上述蛋白表达水平均明显下调,给予ICT后,上述蛋白表达水平未有明显变化.结论 D-gal可导致TM4细胞连接功能损伤,而ICT可改善其损伤,机制可能与上调ERα/FAK信号通路相关.

目的:探讨大黄素在D-氨基半乳糖胺（D-galactosamine，D-GalN）/脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的急性肝损伤中的保护作用及其机制。方法:将40只BALB/c雄性小鼠按随机数字法分为5组（ n=8），对照组、大黄素组、D-GalN/LPS组、大黄素+ D-GalN/LPS组和自噬抑制剂3-MA+大黄素+ D-GalN/LPS组。经小鼠腹腔注射D-GalN （700 mg/kg）/LPS （10 μg/kg）诱导急性肝损伤模型。3-MA（15 mg/kg）和（或）大黄素（20 mg/kg）腹腔注射于模型建立前30 min，6 h后在麻醉下处死小鼠并采集血、肝组织标本。采用比色定量法检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平、肝组织髓过氧化物酶（MPO）活性，采用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的水平，HE染色观察肝组织病理学改变，Western blot检测肝组织自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达量，并分析实验动物生存率。定量资料比较采用单因素方差分析，采用SNK- q检验进行两两比较，方差不齐时采用Games-Howell检验。 结果:与对照组相比，D-GalN/LPS组AST、ALT、TNF-α、IL-6水平和MPO活性[（2 476.80±263.14）U/L、（271.71±47.15）U/L、（537.92±89.35）pg/mL、（169.74±25.52）pg/mL、（1.37±0.22）U/mg]显著升高（ P<0.05）。与D-GalN/LPS组相比，大黄素+D-GalN/LPS组AST、ALT、TNF-α、IL-6水平和MPO活性[（1 248.01±380.70）U/L、（142.59±34.63）U/L、（288.91±67.21）pg/mL、（61.83±13.64）pg/mL、（0.80±0.21）U/mg]显著降低（ P<0.05）。与D-GalN/LPS组相比，大黄素+D-GalN/LPS组可明显减轻肝组织肝细胞的病理损伤，提高小鼠生存率。与对照组相比，D-GalN/LPS组肝组织LC3-Ⅱ、Beclin1表达下降；而与D-GalN/LPS组相比，大黄素+ D-GalN/LPS组肝组织LC3-Ⅱ、Beclin1表达升高。联合自噬抑制剂3-MA后大黄素的肝保护效应被逆转，AST、ALT、TNF-α、IL-6水平和MPO活性[（2 398.78±233.57）U/L、（242.79±43.46）U/L、（505.07±67.89）pg/mL、（151.46±14.11）pg/mL、（1.27±0.15）U/mg]升高（ P<0.05），肝组织病理损伤加重。 结论:大黄素减轻D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤，这可能与激活LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白恢复自噬有关。

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）介导CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）信号分子在急性肝衰竭小鼠炎症反应中的作用机制。方法:以C57BL/6小鼠为研究对象，腹腔注射D-氨基半乳糖（D-GalN）联合脂多糖（LPS）建立小鼠急性肝衰竭模型。用Wy-14643激活PPARα、用质粒促进CHOP表达，检测小鼠肝脏病理改变、血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酯（AST）评价肝脏功能，实时荧光定量PCR检测肝组织中炎性因子mRNA表达水平。LPS刺激巨噬细胞建立炎症模型，用siRNA抑制PPARα、CHOP的表达，实时荧光定量PCR检测细胞中炎性因子mRNA表达水平。结果:D-GalN/LPS诱导急性肝衰竭小鼠中，促进PPARα活性抑制了小鼠肝脏出血和炎症，降低了血清转氨酶水平，也降低了肝组织中炎症因子的mRNA水平（ P < 0.01）。促进CHOP表达，逆转了PPARα激活带来的肝脏保护作用，肝脏损伤加重，炎症因子表达增加（ P < 0.01）。细胞水平上，PPARα活性抑制促进了炎症因子的增高（ P < 0.01），同时抑制CHOP活性后使炎症因子重新下降（ P < 0.01）。 结论:急性肝衰竭肝损伤中PPARα和CHOP分子是调节炎症反应的重要信号分子，促进PPARα可下调CHOP抑制炎症因子发挥对小鼠肝衰竭的保护性作用。

目的:利用代谢组学技术对比不同证型糖尿病高危足受试者的血清代谢谱，并探讨其代谢规律。方法:将符合入选标准的2018年4-12月上海中医药大学附属医院上海市中西医结合医院糖尿病高危足131例受试者经辨证分为寒凝瘀阻证(44例)、热毒伤阴证(54例)、气血两虚证(33例)，另选取体检中心32位健康人血样作为健康对照组，采用气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)检测血清尿素、L-亮氨酸、天冬氨酸、 9H-嘌呤、D-葡萄糖、D-吡喃葡萄糖、β-1-半乳糖吡喃糖苷、血清丁酸、苯、咪唑并[1,2-a]吡啶、β-D-葡萄糖醛糖含量，采用多维数据处理方法对血清代谢物轮廓进行比较。 结果:与健康对照组比较，糖尿病高危足组血清尿素[(2.41±1.57)×10 5比(3.32±2.10)×10 5]、L-亮氨酸[(4.94±3.15)×10 5比(6.39±3.57)×10 5]、天冬氨酸[(3.94±4.48)×10 5比(9.62±6.93)×10 5]、 9H-嘌呤[(1.74±1.95)×10 5比(3.34±2.23)×10 5]含量降低( P<0.05或 P<0.01)，D-葡萄糖[(3.72±1.71)×10 5比(2.21±1.32)×10 5]、D-吡喃葡萄糖[(3.32±2.10)×10 5比(1.35±1.43)×10 5]含量升高( P<0.01)，涉及能量代谢、氨基酸代谢和糖代谢。糖尿病高危足寒凝瘀阻证受试者L-络氨酸含量高于健康对照组，热毒伤阴证受试者尿素、嘌呤、亮氨酸、天冬氨酸含量低于健康对照组，气血两虚证受试者嘌呤含量低于健康对照组( P<0.01)。寒凝瘀阻证受试者血清丁酸、β-1-半乳糖吡喃糖苷水平高于热毒伤阴证，热毒伤阴证受试者血清尿素水平高于寒凝瘀阻证、气血两虚证( P<0.01)。 结论:糖尿病高危足不同证型受试者的血清代谢物存在一定差异，可从体内代谢物角度反映不同证型糖尿病高危足的代谢规律。

目的:对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达，鉴定其酶活特性。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence：NZ_CP045783.1)设计扩增引物，以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长，使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白，使用N 2＋层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，测定KP PepA对其水解能力，并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子，观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用 t检验。 结果:扩增出长度为1 527 bp的KP PepA基因，并获得可溶性KP PepA蛋白，大小为56.1×10 3，与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00) μmol/L比(8.00±2.00) μmol/L， t＝63.36， P<0.01]，表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37 ℃，最适pH值为pH 8.0。Co 2＋、Mn 2＋均可以提高KP PepA酶活性，其中Co 2＋激活作用最强，加入Co 2＋组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00， t＝16.44， P<0.01)；Zn 2＋、Fe 2＋均可以抑制KP PepA酶活性，其中Zn 2＋抑制作用最强，加入Zn 2＋组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00， t＝8.49， P<0.01)。 结论:肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

目的:探讨真皮内注射二甲氨基乙醇(DMAE)复合制剂(赛雷弗 ?)对D-半乳糖诱导的亚急性衰老大鼠皮肤胶原合成代谢的影响。 方法:2014年4—10月，在青岛大学解剖教研室进行实验研究。30只Wistar雄性大鼠分为衰老对照组、衰老治疗组、正常组，每组各10只。衰老对照组、衰老治疗组两组颈背部皮下注射D-半乳糖125 mg·kg -1·d -1, 42 d。从18 d开始于衰老对照组、衰老治疗组臀背部分别注射生理盐水和赛雷弗 ? 1 ml，每周1次，连续4周。每次治疗后3 d，共聚焦显微镜(RCM)检测大鼠皮肤。42 d取大鼠注射药物区域皮肤，观察各组皮肤真皮厚度、胶原纤维密度、皮肤羟脯氨酸含量变化，RT-PCR法检测皮肤组织Ⅰ、Ⅲ型前胶原(ColⅠ、ColⅢ)、转化生长因子(TGF)β1、Smad3 mRNA表达，以及免疫组织化学检测成纤维细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、TGFβ1表达。 结果:RCM显示，随着真皮内注射赛雷弗次数增加，衰老大鼠皮肤胶原纤维的密度逐渐增加。注射4次后，衰老治疗组大鼠真皮厚度、羟脯氨酸含量、TGFβ1 mRNA和蛋白表达高于衰老对照组，但仍低于正常组( F值分别为25.45、98.90、37.94、21.35，均 P<0.05)；胶原纤维密度、ColⅠ、Smad3 mRNA表达高于衰老对照组( F值分别为44.46、29.54、10.01，均 P<0.05)；和正常组比较，差异无统计学意义( P>0.05)。PCNA表达低于正常组，和衰老对照组比较，差异无统计学意义。各组ColⅢ mRNA表达差异均无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:真皮内注射赛雷弗可能通过正调节TGFβ1/Smads通路分子表达促进Ⅰ型胶原蛋白合成。

目的:通过小鼠动物模型探讨阳离子抗菌肽Cathelicidin-PY（PY）治疗急性肝衰竭的可行性。方法:内毒素鲎试验（LAL assay）检测不同浓度抗菌肽PY体外中和内毒素/脂多糖（LPS）能力；CCK-8法检测不同浓度抗菌肽PY对小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）的毒性作用；体外溶血实验评价抗菌肽PY对健康人红细胞的溶血活性；构建D-氨基半乳糖联合LPS诱导的小鼠急性肝衰竭模型，观察抗菌肽PY对模型小鼠存活率的影响；通过HE染色观察肝脏病理学变化，并通过免疫组织化学、蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。组间比较采用 t检验、方差分析，率的比较采用χ 2检验。 结果:体外实验显示极低剂量（0.01 μmol/L）可达到较高的内毒素中和率，中等剂量（10～40 μmol/L）中和率可超过70%，且不同浓度组间比较，差异有统计学意义（ F = 569.22， P < 0.05）。中等剂量抗菌肽PY有较强的中和内毒素作用，较低的细胞毒性及溶血活性。进一步体内实验显示中等剂量抗菌肽PY可改善模型小鼠的肝脏损伤程度并显著提高存活率，且免疫组织化学检测结果显示中等剂量抗菌肽组较肝衰竭组肝组织内Caspase-3表达明显减少，与蛋白质印迹法检测结果一致。 结论:抗菌肽PY具有较强中和内毒素的能力且毒副作用小，特定剂量抗菌肽PY可以减轻肝细胞凋亡，并显著提高模型动物存活率，为肝衰竭治疗的研究提供了新思路。

目的:观察小鼠肠道菌群的变化，探讨粪菌结合益生菌移植干预急性严重肝损伤的结局。方法:选雄性BALB/c小鼠40只，随机分为空白对照组10只，模型组10只，普通粪菌移植组10只，粪菌+益生菌移植组10只，除空白对照组外，其余各组给予D-氨基半乳糖（3.0 g/kg）腹腔注射制备急性严重肝损伤模型，普通粪菌移植组和粪菌+益生菌移植组在造模同时分别给予普通粪菌液和益生菌+粪菌液灌肠（1次/d），48 h后取血清用于检测丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素，取肝组织用于病理学检测。取结肠内容物用于提取DNA进行16S V3-V4区高通量测序，用生物信息学分析技术对测序结果进行可操作分类单元聚类分析，α多样性分析，β多样性分析，线性判别分析找到不同分组小鼠的结肠内容物特征性差异细菌。临床生物化学指标组间差异比较采用 t检验，16S V3-V4区测序结果组间差异采用Wilcoxon检验。 结果:模型组小鼠血清肝脏生物化学指标高于其他3组，差异有统计学意义（ P < 0.05），模型组肝脏HE染色结果显示肝组织镜下呈严重炎性改变；普通粪菌移植组和粪菌+益生菌移植组较模型组明显减轻，炎症减轻。16S rRNA高通量测序分析结果显示，空白对照组小鼠群菌结构与其他3组的Shannon差异无统计学意义，Observed Species差异有统计学意义，菌群构成差异大，粪菌移植增加小鼠肠道内物种数量。β-多样性分析结果显示，空白对照组与其他3组的组间差异大于疾病组之间的组间差异，粪菌+益生菌移植组改变疾病小鼠肠道菌群结构的差异细菌多为产丁酸盐细菌。 结论:粪菌+益生菌增强粪菌移植治疗效果，改善肝脏炎症，增加肠道内产丁酸盐细菌数量。

目的:对1例ABO血型Bel亚型新等位基因(c.620T>C)先证者进行分子生物学研究，以揭示该突变对α-1，3-半乳糖苷转移酶(GTB)结构的影响。方法:选取2023年2月11日于郑州大学第一附属医院输血科就诊的1例先证者为研究对象。首先采用血清学方法进行ABO表型的鉴定，接着对 ABO基因的7个外显子进行直接测序，进一步采用单倍体特异性引物进行单链测序，最后用Modeller软件对突变的GTB进行同源建模，并用PyMOL软件分析突变对GTB空间结构的影响。 结果:先证者血清学表型为Bel亚型，直接测序发现了1个新的突变位点c.620T>C，导致多肽链发生p.Leu207Pro氨基酸替换。结合单链测序，最终确定基因型为 ABO* BELnew/ ABO* O.01.02。蛋白质三维结构建模显示，与野生型相比，脯氨酸与p.Gly272之间的1条氢键距离变大，另1条氢键消失。 结论:上述研究鉴定出1例新的B等位基因突变c.620T>C(p.Leu207Pro)，该突变影响了GTB空间结构的稳定性，酶的活性减弱导致了B抗原表达减弱，血清学表现Bel亚型。