目的:探讨微小RNA(miRNA，miR)-628-3p调控的DNA解螺旋酶对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:首先收集2013年1月至2017年12月郑州大学第二附属医院骨科收治的股骨骨肉瘤患者60例，同期收集股骨创伤性骨折患者60例作为对照组，采用定量聚合酶链反应(qPCR)检测和比较外周血循环miR-628-3p的表达水平差异，并根据随访结果进行生存分析。以人骨肉瘤细胞U2OS和HOS为研究对象，过表达miR-628-3p，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和集落形成实验检测其增殖活性，采用流式细胞术检测其凋亡率。根据Starbase预测miR-628-3p可与Bloom综合征解螺旋酶(BLM)结合，故进一步采用蛋白质印迹法(Western blot)、qPCR和荧光素酶报告基因实验进行检测。两组间计量资料比较采用独立样本 t检验，计数资料比较采用 χ2检验。 结果:骨肉瘤患者外周血和肿瘤组织中miR-628-3p的表达水平(相对表达量分别为0.203±0.047、0.217±0.054)均明显低于正常对照组(相对表达量分别为0.951±0.106、1.013±0.072， P<0.01)，差异有统计学意义，受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-628-3p在骨肉瘤患者中的表达，曲线下面积(AUC)＝0.707( P<0.01)，K-M生存分析显示miR-628-3p低表达患者生存时间明显短于高表达患者。CCK-8和集落形成实验检测显示miR-628-3p过表达后可抑制骨肉瘤细胞U2OS和NOS的增殖；流式细胞术检测显示miR-628-3p过表达后可促进骨肉瘤细胞的凋亡；qPCR和Western blot检测显示miR-628-3p过表达后，BLM的表达水平明显低于miR-628-3p nc组( P<0.01)，差异有统计学意义。荧光素酶报告基因实验显示miR-628-3p mimc与BLM-mt共转染骨肉瘤细胞U2OS和NOS后，其荧光值明显低于其他转染组(U2OS：0.208±0.017比1.082±0.046， t＝4.698， P<0.01；HOS：0.224±0.047比0.966±0.053， t＝5.548， P<0.01)，差异有统计学意义。裸鼠成瘤证实miR-628-3p过表达后肿瘤大小和重量明显低于miR-628-3p nc组[(1.419±0.274) g比(2.825±0.148) g， t＝3.717， P<0.01]，差异有统计学意义。 结论:miR-628-3p在骨肉瘤患者中存在低表达现象，与患者的不良预后和生存时间相关，miR-628-3p过表达可下调DNA解螺旋酶BLM，抑制骨肉瘤细胞的增殖。

目的:了解铁对问号钩端螺旋体生长繁殖和能量代谢的影响，确定LA_2690与LA_3598基因产物为问号钩端螺旋体储铁蛋白及其亚铁氧化酶功能。方法:采用Petroff-Hausser计数法了解缺铁对问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株在EMJH培养基中生长繁殖的影响。分光光度法和化学发光法检测缺铁抑制问号钩端螺旋体DNA和ATP合成的作用。采用生物信息学软件分析问号钩端螺旋体LA_2690和LA_3598基因结构与功能。构建LA_2690和LA_3598基因原核表达系统，Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rLep2690和rLep3598。分光光度法检测rLep2690和rLep3598亚铁氧化酶活性。实时荧光定量RT-PCR检测问号钩端螺旋体56601株感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和单核细胞(THP-1)时LA_2690和LA_3598基因转录水平变化。结果:在缺铁EMJH培养基中，问号钩端螺旋体生长繁殖能力、DNA和ATP合成水平均显著下降( P<0.05)。LA_2690和LA_3598基因产物分别为细菌铁蛋白(Bfr)和细菌DNA结合铁蛋白(Dps)，均含有双亚铁氧化酶中心，但后者缺乏亚铁血红素结合位点和亚铁氧化酶核心。LA_2690和LA_3598基因原核表达系统能高效表达目的重组蛋白rLep2690和rLep3598，提纯后经SDS-PAGE检测均显示为单一的蛋白质条带。rLep2690和rLep3598亚铁氧化酶活性分别为1 238.619和60.052 U/L。感染细胞时，LA_2690和LA_3598基因mRNA水平均显著升高( P<0.05)。 结论:铁离子参与问号钩端螺旋体生长繁殖、DNA和ATP合成。LA_2690和LA_3598基因(Bfr和Dps)均为问号钩端螺旋体感染细胞时所需，其中LA_2690基因产物具有较强亚铁氧化酶活性。

例1 　女，18岁。因周身鳞屑性红斑伴发热及关节疼痛8年，于2020年6月就诊于我院皮肤科。患者8年前无明显诱因出现多发红斑伴脱屑，5年前逐渐弥漫至全身，2年前先后出现双膝关节、足跖、足跟、足趾关节及腰部疼痛。1年前就诊于我院风湿免疫科，诊断为银屑病性关节炎，给予甲氨蝶呤7.5 mg每周1次，治疗1月余，疗效欠佳，后自行停药。体检：体温37.9 ℃，心率125次，呼吸23次，血压115/80 mmHg。心肺听诊无异常，腹部柔软，无压痛、反跳痛等；腋下及腹股沟可触及多个肿大淋巴结。皮肤科情况：头面、躯干、四肢弥漫肿胀性红斑伴脱屑，累及98%体表面积；双手足指（趾）均可见水肿性红斑伴脱屑，有关节压痛，不伴关节肿胀、变形；双手足指（趾）甲均可见甲板增厚，部分远端分离。骶髂关节、双膝关节、足跟和足底疼痛。母亲有银屑病史。实验室检查：血常规白细胞9.98 × 10 9/L，血小板602 × 10 9/L，中性粒细胞6.84 × 10 9/L，单核细胞0.85 × 10 9/L；尿常规示尿潜血++，尿白蛋白±，尿白细胞酯酶+++；红细胞沉降率59 mm/1 h，C反应蛋白17.2 mg/L，血人类白细胞抗原B27测定阴性。骶髂关节CT平扫示双侧骶髂关节面密度增高、毛糙，关节面下可见多发锯齿样骨质破坏，双侧骶髂关节间隙变窄。血电解质、血脂、梅毒甲苯胺红不加热血清试验、梅毒抗体、梅毒螺旋体明胶凝集实验、HIV抗体、抗核抗体、抗dsDNA抗体、类风湿因子、丙型肝炎病毒抗原、抗体和乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原、e抗体、核心抗体定量检测以及结核感染T细胞检测均无异常，乙型肝炎病毒表面抗体阳性，乙型肝炎病毒DNA低于检测下限（100 IU/ml）。胸CT检查：两肺间质纹理增多。诊断：红皮病型银屑病（erythrodermic psoriasis，EP）合并关节病型银屑病。治疗：于2020年6月26日给予依奇珠单抗皮下注射，第0周160 mg，之后第2、4、6周各80 mg。2周时红斑脱屑明显好转，银屑病皮损面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index，PASI）评分改善达50%，关节疼痛明显减轻，但2周后皮疹复发，于第6周时恢复至治疗前的周身弥漫性红斑伴发热，关节疼痛较治疗前好转。于2020年8月5日更换为阿达木单抗皮下注射，第0周80 mg，第1周40 mg，之后每2周40 mg，随访至第16个月。阿达木单抗治疗第3周时，患者周身弥漫性红斑伴脱屑较前明显改善，皮肤肿胀消退，PASI评分改善达30%。第5周时，皮损较前进一步好转，仅遗留散在细碎鳞屑，出现正常色泽皮肤，达到PASI60。第12周时，原有弥漫性红斑脱屑基本消退，仅四肢及头皮可见少量点状红斑及鳞屑，达到PASI95，关节疼痛症状也基本消失。见图1。随访至2021年11月，患者未出现严重不良事件。

染色质结构域解螺旋酶DNA结合5(CHD5)位于1p36.3,首次被发现于神经母细胞瘤中一个频繁缺失的区域,是染色质重塑家族CHD家族中的第五个成员,通过核小体重塑以及形成去乙酰化复合体从而调节特定基因的转录.CHD5已被确定在多种恶性肿瘤中发挥抑癌基因的作用.有研究表明,CHD5在神经母细胞瘤及其他恶性肿瘤中常通过启动子区超甲基化而表达下调,其表达降低与不良临床表现及预后密切相关.本文主要围绕CHD5在恶性肿瘤中的作用进行综述,旨在为今后的研究提供理论依据.

目的 探讨含 OTU 结构域的泛素醛结合蛋白 2(OTUB2)影响RNA解螺旋酶 54(DDX54)的活性及其对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成和结直肠癌(CRC)细胞活力、侵袭的影响.方法 分离CRC患者和健康对照组的外周血中性粒细胞,并使用佛波酯(PMA)或脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)刺激中性粒细胞4 h;Western blot检测NETs标记物髓过氧化物酶(MPO)和瓜氨酸组蛋白H3(Cit-H3)的表达;干预SW480 细胞中OTUB2 或DDX54 的表达并将其和中性粒细胞共培养,细胞分为如下组:对照组(不做任何处理),NETs 组、vector 组、OTUB2 组、NETs+si-OTUB2 组(SW480 细胞、转染了vector、OTUB2 过表达质粒和si-OTUB2的SW480 细胞分别与 PMA 处理的中性粒细胞共培养),OTUB2+DNase Ⅰ组(转染了OTUB2 过表达质粒的SW480细胞与DNase Ⅰ处理的中性粒细胞共培养),si-OTUB2 组、OTUB2+si-NC 组和 OTUB2+si-DDX54 组(转染了 si-OTUB2、OTUB2 过表达质粒和 si-NC、OTUB2 过表达质粒和si-DDX54 的 SW480 细胞分别与中性粒细胞共培养).ELISA检测 SW480 细胞上清液中 MPO-DNA 复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度;MTT和Transwell检测SW480 细胞活力和侵袭能力;RNA测序筛选OTUB2 调控的下游基因并使用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、免疫共沉淀(co-IP)和谷胱甘肽 S-转移酶(GST)亲和纯化(GST-pull-down)、His-tag pull-down实验验证 DDX54 和OTUB2 的相互作用.结果 与健康对照相比,CRC患者外周血中NETs的形成增加.与对照组相比,NETs组CRC细胞活力和侵袭增加(P<0.05).与vector组比较,OTUB2 组MPO-DNA复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度增加,细胞活力和侵袭增加(P<0.05);而与OTUB2 组比较,OTUB2+DNase Ⅰ组MPO-DNA复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度减少,细胞活力和侵袭减少(P<0.05).Co-IP 实验、GST pull down 实验和His-tag pull down实验表明OTUB2 和DDX54 之间存在相互作用.与 OTUB2+si-NC 组比较,OTUB2+si-DDX54 组MPO-DNA复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度减少,细胞活力和侵袭减少(P<0.05).结论 去泛素化酶OTUB2 可以通过上调DDX54 的增加NETs的形成并促进CRC细胞活力和侵袭.

目的 分析了解深圳市输入性恶性疟原虫耐药基因突变情况,帮助评估抗疟药的疗效和指导有效用药.方法 收集2022-2023年从境外输入深圳市的恶性疟荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)阳性的样本85例,提取基因组DNA,使用巢式PCR扩增耐药基因:恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因(Plasmodium falciparum Kelch 13,PfK13)、多药耐药基因 1(multidrug resistance 1,Pfmdr1)、氯喹抗性转运基因(chloroquine resistance transporter,Pfcrt)、二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolate reductase,Pfdhfr)和二氢蝶酸合成酶基因(dihydropteroate synthase,Pfdhps),并进行双向测序,使用MEGA11.06软件分析这些耐药基因突变情况.结果 研究发现PfK13错义突变(S549P)1例,同义突变4例.Pfmdr1 62.69％样本存在Y184F突变,未检测到N86Y突变体.Pfcrt基因中,未检测到72和73位点的突变,M74I、N75E和K76T突变分别占17.46％、15.87％和15.87％.Pfcrt基因野生型占主导(82.54％,52例),其次是I74E75T76三重突变体(15.87％,10例).Pfdhfr最常见的突变型为I51R59N108(91.78％,67例),其次是野生型(2.74％,2例).Pfdhps野生型占60.32％(38例),单突变K540E为最常见突变类型,检测到S436A、G437A、K540E、A581G、A613S、I431V、G556K、G579E位点突变.Pfdhfr-Pfdhps组合突变中,I51R59N108-E540是频率最高的组合突变(11.48％),59.02％样本为Pfdhfr单独突变体.结论 在本研究中,PfK13突变率低,且无报导的耐药突变,Y184F成为Pfmdr1突变主导,未发现有N86Y.Pfcrt野生型为主,其次为I74E75T76三重突变体,Pfdhfr I51R59N108三重突变非常普遍,本研究并未发现Pfdhfr-Pfdhps完全抗性和超抗性突变体,但有其他的五重七重突变型.在未来的工作中,需要继续加强疟原虫耐药基因的监测,同时进一步结合体内疗效的监测来有效指导临床用药.

目的 探究中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)在骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及其相关机制.方法 纳入骨肉瘤患者和健康受试者各 20 例,通过ELISA检测血清中PAD4 和H3cit水平.提取两组人群外周血中性粒细胞,比较NETs形成差异.将NETs与骨肉瘤细胞MG63共孵育,期间加入DNA降解酶DNase Ⅰ,分为对照组、NETs组和NETs +DNase Ⅰ组.通过蛋白质印迹检测CCDC25 蛋白表达水平,CCK8 检测细胞增殖水平,Transwell 检测细胞迁移和侵袭水平.将 si-NC 和 si-CCDC25 转染至MG63,加入NETs共孵育,分为si-NC组和si-CCDC25 组,通过蛋白质印迹检测CCDC25 蛋白表达水平,CCK8 检测细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移和侵袭水平.结果 与健康受试者比较,骨肉瘤患者血清中 PAD4 和 H3cit 水平升高(P<0.05),NETs 形成能力增强.与对照组比较,NETs 组CCDC25 蛋白表达升高,细胞增殖、迁移和侵袭水平升高(P<0.05).与NETs组比较,NETs + DNase Ⅰ组CCDC25 蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05).与 si-NC 组比较,si-CCDC25 组CCDC25 蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05).结论 NETs通过释放的DNA激活骨肉瘤细胞CCDC25 表达,从而促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭.

目的 分析河南省自赤道几内亚输入性恶性疟原虫抗药性基因多态性,了解恶性疟原虫基因突变情况,评估其流行特征.方法 收集河南省2012-2019年自赤道几内亚输入性恶性疟病例信息和外周血样,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Kelch 13螺旋体(PfK13)基因、恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(Pfcrt)基因、恶性疟原虫多药物抗性基因1(Pfmdr1)、恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(Pfdhfr)基因和恶性疟原虫二氢蝶酸合酶(Pfdhps)基因,琼脂糖凝胶电泳后进行双向测序.获得的基因序列通过MEGA7软件与参考基因组进行比较获得突变位点信息,参考基因组来自GenBank的恶性疟原虫3D7野生虫株(GenBank登录号分别为 PF3D7_1343700、PF3D7_0709000、PF3D7_0523000、PF3D7_0417200 和 PF3D7_1324800).使用 SPPS 21.0软件对数据进行统计学分析.结果 2012-2019年,河南省共报告输入性疟疾病例1 522例,其中自赤道几内亚输入病例117例,包括恶性疟病例97例、卵形疟病例16例、间日疟和三日疟病例各1例、恶性疟原虫/三日疟原虫混合感染和恶性疟原虫/卵形疟原虫混合感染病例各1例.测序获得91份恶性疟原虫样品的PfK1 3基因序列,基因突变率为8.8％(8/91);突变样品中共检测出7个非同义突变位点和3个同义突变位点,其中非同义突变位点分别为M476I混合型(混)、A481V混、A564E混、P574L混、A578S、V589I和N609I混,同义突变位点分别为G625G、N664N和C469C.测序获得91份恶性疟原虫样品的Pfcrt基因序列,基因突变率为18.7％(17/91);检测出 3 种Pfcrt 基因型,分别为野生型 C72V73M74N75K76(81.3％,74/91)、突变型 C72V73I74E75T76(12.1％,11/91)和混合型C72V73M/I74N/E75K/T76(6.6％,6/91).测序获得92份恶性疟原虫样品的Pfmdr1基因序列,基因突变率为77.2％(71/92);检测出 3 个突变位点,分别为 N86Y(41.3％,38/92)、Y184F(75.0％,69/92)和 D1246Y(1.1％,1/92),其中 N86Y 突变率从2012年的 68.8％(11/16)下降到 2016年的 11.1％(1/9)(x2=11.58,P＜0.05);检测出5种Pfmdr1基因型,分别为野生型N86Y184D1246(22.8％,21/92),单基因突变型Y86Y184D1246(1.1％,1/92)、N86F184D1246(34.8％,32/92)、N86Y184Y1246(1.1％,1/92)和双重突变型Y86F184D1246(40.2％,37/92).测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhfr基因序列,基因突变率为96.7％(87/90);检测出3个突变位点,分别为N51I(91.1％,82/90)、C59R(93.3％,84/90)和S108N(96.7％,87/90);检测出 5种Pfdhfr基因型,分别为野生型N51C59S108(3.3％,3/90),单基因突变型 N51C59N108(2.2％,2/90),双重突变型 I51C59N108(1.1％,2/90)、N51R59N108(3.3％,3/90)和三重突变型I51R59N108(90.0％,81/90).测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhps基因序列,基因突变率为97.8％(88/90);检测出 6个突变位点,分别为 1431V(8.9％,8/90)、S436A(27.8％,25/90)、A437G(92.2％,83/90)、K540E(3.3％,3/90)、A581G(1.1％,1/90)和 A613S(2.2％,2/90);检测出 8 种Pfdhps基因型,分别为野生型I431S436A437K540A581A613(2.2％,2/90),单基因突变型 I436A436A43(5.6％,5/90)、I431S436G437K540A581A613(66.7％,60/90),双重突变型 I431A436G437K540A581A613(10.0％,9/90)、I431S436G437E540A581A613(3.3％,3/90),三重突变型V431A436G437K540A581A613(8.9％,8/90)、I431A436G437K540G581A613(1.1％,1/90)和 I431A436G437K540A581S613(2.2％,2/90).89份恶性疟原虫样品的Pfdhfr和Pfdhps基因同时测序成功,其中84例(94.4％)同时发生双基因突变,四重突变体I51R59N108-G437占比最高(64.0％,57/89).结论 自赤道几内亚输入的恶性疟原虫样品中检出多个PfKI3基因突变位点,其中M476I和P574L已被证实与青蒿素类药物抗性相关;随着氯喹的停用,与青蒿素配伍药物抗性相关的Pfcrt和Pfmdr1基因突变率呈下降趋势;恶性疟原虫对磺胺多辛-乙胺嘧啶药物抗性水平多为"部分抗性",未检出"超级抗性"样品.

[背景]鼠传疾病是对人类危害较大的一种人兽共患病,全球化使得鼠传疾病流行区域不断扩大,出现了多种新发鼠传疾病的发生及旧传染病的复燃.[目的]调查新疆阿勒泰地区常见的鼠传致病菌在啮齿动物中的流行状况,为当地自然疫源性疾病防控提供科学依据.[方法]采用夹夜法捕获啮齿动物,无菌收集其脾脏和肾脏组织,提取基因组DNA.应用TaqMan探针法的荧光定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测巴尔通体(Bartonella spp.)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)、莫氏立克次体(Rickettsia mooseri)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)和土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)6 种常见的鼠传致病菌.采用 16S rRNA 基因的通用引物进行常规 PCR 扩增后,应用Illumina测序和Nanopore测序进一步检测致病菌,同时对脾脏组织进行巴尔通体体外分离培养.比较qPCR、16S rRNA基因测序和分离培养的结果.[结果]共捕获啮齿动物 8 种 66 只,其中,乌拉尔姬鼠(Apodemus uralensis)31 只,占捕获总数的 46.97%,其余为褐家鼠(Rattus norvegicus)、小家鼠(Mus musculus)等.qPCR检测常见的鼠传致病菌感染率为巴尔通体 31.80%(21/66)、问号钩端螺旋体 1.50%(1/66)、恙虫病东方体 1.50%(2/66)、莫氏立克次体 3.00%(1/66)和土拉弗朗西斯菌13.60%(9/66),未检出嗜吞噬细胞无形体.16S rRNA基因Illumina测序分析通过质控的 23 份样品检测出致病菌,以巴尔通体为主;16S rRNA基因Nanopore测序分析通过质控的 11 份样品检测出巴尔通体,其他 5 种常见的鼠传致病菌未检出.有 11 份脾脏组织分离培养出巴尔通体,感染率为16.67%(11/66).[结论]新疆阿勒泰地区的啮齿动物可携带巴尔通体等多种鼠传致病菌,应关注并加强该地区相关传染病的防治工作.qPCR、细菌分离培养、16S rRNA基因测序 3 种检测方法可互相补充,更全面地了解当地啮齿动物携带致病菌的状况.

目的 分离鲍曼不动杆菌噬菌体,测定其基因组DNA序列,分析预测穿孔素和裂解酶等重要功能基因及其编码蛋白的性质和功能.方法 利用双层琼脂平板法从医院污水中分离鲍曼不动杆菌噬菌体,透射电子显微镜观察噬菌体的形态特征;提取噬菌体基因组DNA,采用Illumina Hiseq2000测序仪进行全基因组测序;利用生物信息学方法对噬菌体基因组DNA序列进行功能编码基因定位、同源性分析以及对噬菌体重要功能基因编码蛋白的结构和生物功能等进行预测.结果 成功从医院污水中分离获得1株鲍曼不动杆菌噬菌体,命名为噬菌体SWH-Ab-1.噬菌体SWH-Ab-1属长尾噬菌体,对鲍曼不动杆菌具有显著裂解性.噬菌体SWH-Ab-1基因组为全长41 567 bp的双链DNA,G+C％含量为39.42％,包含51个预测功能基因,穿孔素基因和裂解酶基因分别位于噬菌体基因组的ORF02(320 ～655 bp)和ORF03(642～1 199 bp)开放阅读框,穿孔素基因序列全长336 bp,共编码111个氨基酸,其编码的HolSA1为疏水性Ⅰ型跨膜蛋白,相对分子质量为11.957 96×103,理论等电点为4.87,可能在脂肪酸代谢、转运载体及信号转导中发挥重要作用.裂解酶基因序列全长558 bp,共编码185个氨基酸,其编码的LysSA1为亲水性蛋白,相对分子质量为21.010 4×103,理论等电点为9.56,无跨膜区,可能参与氨基酸生物合成、脂肪酸代谢、辅因子生物合成等重要生理过程.两种功能蛋白均不存在信号肽序列,二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主.结论 噬菌体SWH-Ab-1是一种新分离的长尾裂解性噬菌体,其基因组的ORF02和ORF03开放阅读框是穿孔素和裂解酶的编码基因,编码的HolSA1和LysSA1可能组成“二元裂解系统”,协同参与噬菌体对宿主菌的裂解过程.