目的:探讨长期节食状态下大鼠体内胆汁酸的变化及其机制。方法:20只健康雄性Wistar大鼠分为对照组和节食组，每组10只。对照组大鼠正常量饮食，节食组大鼠给予正常饮食量的50%饲养，12周后麻醉，采集各组大鼠血清、胆汁、肝脏和回肠组织样本，分离腹部脂肪称重，并计算腹部脂肪/体重比。计算胆汁流速。采用试剂盒和高效液相色谱串联质谱法测定各样本中总胆汁酸（TBA）及β-鼠胆酸（β-MCA）、牛磺β-鼠胆酸（Tβ-MCA）、胆酸（CA）、牛磺胆酸（TCA）、甘氨胆酸（GCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）、甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）、去氧胆酸（DCA）、牛磺去氧胆酸（TDCA）、甘氨去氧胆酸（GDCA）、石胆酸（LCA）、甘氨石胆酸（GLCA）、牛磺猪去氧胆酸（THDCA）、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）、甘氨熊去氧胆酸（GUDCA）的浓度，采用实时荧光定量聚合酶链反应测定肝脏和回肠组织法尼醇X受体（Fxr）“肠-肝轴”通路上胆汁酸相关核受体、代谢酶和转运体小异二聚体伴侣（ Shp） 、成纤维细胞生长因子15（ Fgf15） 、胆固醇7α-羟化酶（ Cyp7a1）、甾醇12α-羟化酶（ Cyp8b1） 、胆酸盐输出泵（ Bsep） 、多药耐药相关蛋白2（ Mrp2） 、Na +依赖性胆酸盐转运体（ Asbt）等的mRNA表达量。组间比较采用 t检验。 结果:与对照组相比，节食组大鼠体重与腹部脂肪/体重比均显著降低（ P<0.01）；血清TBA水平以及胆汁流速和胆汁酸经胆汁排泄量显著升高（ P<0.05）；肝组织中β-MCA、CA、GCA、CDCA、GCDCA、DCA、GDCA、LCA、GLCA、TUDCA和GUDCA的浓度显著升高（ P<0.05），而TCA、TDCA和THDCA的浓度显著降低（ P<0.05）；回肠组织中Tβ-MCA、TCA、DCA和TDCA浓度均显著降低（ P<0.05）；肝脏中次级胆汁酸和非结合型胆汁酸浓度明显增高（ P<0.05），回肠中结合型胆汁酸浓度显著降低（ P<0.05）。与对照组比较，节食组大鼠回肠和肝脏部位 Fgf15基因表达量均显著降低，回肠 Asbt基因表达量显著上调，肝脏中 Shp和 Cyp7a1的mRNA表达水平均显著上调，而 Cyp8b1的mRNA表达量显著降低（均 P<0.05）。 结论:节食大鼠饮食结构的改变促使体内胆汁酸呈现明显的特征性变化，究其机制可能与Fxr“肠-肝轴”的适应性调控有关。

目的 探究中脑星形胶质细胞神经营养因子(mesen-cephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)在利福平(rifampicin,RFP)诱导的胆汁淤积性肝损伤中的作用.方法 借助肝细胞MANF特异性敲除(hepatocyte-specific MANF knockout,HKO)小鼠模型,观察MANF基因缺失对RFP诱导的小鼠胆汁酸转运体表达的影响.体外观察MANF敲减后对人肝癌细胞HepG2的核因子红细胞系2相关因子2(nu-clear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)的影响.结果 与野生型(wild type,WT)小鼠相比,RFP处理的WT小鼠的胆盐输出泵(bile salt export pump,BSEP)以及多药耐药相关蛋白 4(multidrug resistance-associated protein 4,MRP4)的蛋白和基因表达水平增加.然而,与RFP处理的WT小鼠相比,HKO小鼠中BSEP、多药耐药蛋白1(multidrug resistance protein 1,MDR1)、MRP2/3/4 和有机溶质转运蛋白 α(organic solute transporter α,OSTα)的蛋白和(或)基因表达水平明显降低.体外细胞MANF敲减会削弱RFP诱导的Nrf2的表达以及核内移.结论 MANF可能通过调节Nrf2的表达调控BAT的适应性表达,在RFP诱导的肝损伤中发挥保护作用.

目的 探讨敲低过氧化物还原酶-6(PRDX6)在利福平(RFP)诱导人肝癌细胞(HepG2)损伤及胆汁酸转运体适应性表达中的作用.方法 将处于对数生长期的细胞均匀接种于 6 孔板中,使用特异PRDX6-siRNA、control-siRNA分别转染HepG2 细胞构建敲低组及对照组.给予细胞 100 μmol/L RFP诱导24h后,Western blot和qRT-PCR检测各组细胞PRDX6、多药耐药蛋白 1(MDR1)、多药耐药相关蛋白2、3、4(MRP2、MRP3、MRP4)、Na+/牛磺胆酸协同转运蛋白(NTCP)的蛋白及基因表达水平;Annexin V-FITC/PI 双染法检测各组细胞凋亡率;CCK-8 法检测各组细胞增殖变化;试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞损伤标志物丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆汁酸(TBA)相对含量变化.结果 RFP 可诱导 HepG2 细胞 MRP2、MRP3、MRP4、MDR1、NTCP及PRDX6 的蛋白和基因表达水平升高(P<0.05),而敲低PRDX6 后,MRP2、MRP3、MRP4、MDR1、NTCP的蛋白和基因表达水平均有不同程度的降低(P<0.05).此外,PRDX6 敲低后HepG2 细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞增殖能力下降(P<0.05),细胞培养上清液中细胞损伤标志物(ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA)水平升高(P<0.05).结论 RFP可增加HepG2 细胞胆汁酸转运体及PRDX6 的蛋白和基因表达量,敲低PRDX6 并用RFP诱导后胆汁酸转运体的蛋白及基因表达量降低,同时细胞损伤加重,表明PRDX6 在RFP诱导的HepG2 细胞适应性反应中发挥保护作用.

目的 基于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路,探讨复方蜥蜴散调控糖酵解降低胃癌顺铂耐药性的效应机制.方法 体外培养人胃癌MKN45、MKN45/DDP(顺铂耐药)细胞,以不同质量浓度顺铂(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/mL)干预,检测其存活率、半数抑制浓度(IC50)和耐药指数.于裸鼠右前腋窝皮下接种MKN45/DDP细胞悬液制备胃癌耐药裸鼠移植瘤模型,将造模成功的裸鼠随机分为模型组、顺铂组(0.002 g/kg)、复方蜥蜴散组(2.8 g/kg)、联合组(剂量同各单药组),每组8只;各药物组裸鼠给予相应药液,每周2次(顺铂,腹腔注射)或每天2次(复方蜥蜴散,灌胃),连续4周.实验期间,监测各组裸鼠体重并计算其肿瘤体积和肿瘤生长抑制率,检测其肿瘤组织中炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6)水平,多药耐药相关蛋白1(MRP1)、P糖蛋白(P-gp)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、乳酸脱氢酶A(LDHA)mRNA及蛋白,以及PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)蛋白的表达情况.结果 在不同质量浓度顺铂的干预下,耐药细胞MKN45/DDP的存活率均显著高于亲本细胞MKN45(P＜0.05);MKN45/DDP和MKN45细胞的IC50分别为(1.0520±0.2219)、(0.3721±0.2380)μg/mL,耐药指数为2.827.与模型组比较,顺铂组、复方蜥蜴散组、联合组裸鼠的肿瘤生长均受到不同程度的抑制,肿瘤生长抑制率显著升高(P＜0.05);肿瘤组织中炎症因子水平,MRP1、P-gp、GLUT1、LDHA mRNA及蛋白的表达(顺铂组除外),PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平(顺铂组除外),以及HK2、PKM2蛋白的表达均显著降低或下调,且联合组的效果显著优于顺铂组(P＜0.05).结论 复方蜥蜴散可通过减少肿瘤相关炎症因子的分泌,抑制糖酵解、耐药相关蛋白及基因的表达,抑制PI3K/Akt信号通路的活化来抑制胃癌耐药细胞移植瘤裸鼠的肿瘤生长,具有一定的顺铂增效及逆转耐药的作用.

目的:用体外巨噬细胞实验和全基因敲除小鼠,筛选11.-1β分泌相关的胞膜转运体.方法:分化THP-1细胞株得到人源性巨噬细胞,从人外周血获取巨噬细胞.获取同性别、同年龄的FVB野生型小鼠作为MRP1全基因敲除小鼠的对照,培养小鼠腹腔和骨髓巨噬细胞.使用ABCC1/MRP1、ABCG2/BCRP、ABCB1/P-gp、OATP1B1和MATE转运体抑制剂处理细胞,再使用脂多糖和腺苷三磷酸刺激细胞,采用ELISA、Western blot和细胞免疫荧光法检测IL-1β分泌水平.结果:人和小鼠巨噬细胞抑制剂实验表明,抑制ABCC1/MRP1转运体后,IL-1β分泌显著降低,而抑制其他4类转运体无效果.在动物实验中,MRP1全基因敲除小鼠的骨髓巨噬细胞分泌IL-1β的水平显著低于对照组.结论:ABCC1/MRP1转运体是一种新发现的IL-1β分泌途径,有望成为解决细胞因子释放综合征等临床问题的新靶标.

目的 探究何首乌醇提物对3D肝细胞球的毒性.方法 设置不同的条件以及细胞比例,测量细胞球直径、致密度、圆度,探索最佳培养条件.3D肝细胞球分为对照组和低、中、高剂量实验组,低、中、高剂量实验组给予0.25、1.00和2.50 mg·mL-1何首乌醇提物,对照组给予等量的培养基.用CellTiter-Glo试剂检测细胞球活性,用荧光定量聚合酶链反应(RT-qRCR)检测肝功能相关基因表达水平,用活死细胞双荧光染色试剂检测细胞球的毒性作用.结果 细胞球理想接种条件为每微孔500个细胞,细胞比例为HepG2-Huvec-LX-2=8∶1∶1,圆度为0.91±0.07,坚实度为0.91±0.02,长径比为1.12±0.14,直径为(170.97±14.79)μm;第3、7、10和14天细胞球白蛋白(ALB)mRNA相对表达水平分别为 1.00±0.02、0.96±0.02、0.54±0.07 和0.52±0.07,细胞色素 P4501A2(CYP1A2)mRNA 相对表达水平分别为 1.00±0.10、2.15±0.16、2.45±0.33和1.30±0.03.对照组和低、中、高剂量实验组多药耐药蛋白2(MRP2)mRNA相对表达水平分别为 1.00±0.31、1.38±0.24、1.48±0.06 和 1.90±0.08,细胞球存活率分别为(98.19±0.49)％、(88.53±0.90)％、(71.60±2.91)％和(56.65±5.41)％.低、中、高剂量实验组上述指标与对照组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 建立的肝细胞球共培养模型中Ⅰ/Ⅱ相药物代谢酶、转运体、及肝细胞特异标志性分子白蛋白均有不同程度的表达,可用于中药何首乌的毒性评价,为何首乌的临床应用提供了参考.

目的 研究高原缺氧对血脑屏障(BBB)中ATP-结合盒(ABC)转运蛋白表达的影响,并探讨影响其表达的机制.方法 将Wistar大鼠分为1500 m组(兰州实地)、4010 m组(模拟,低压氧舱,缺氧3 d)、6000 m组(模拟,低压氧舱,缺氧3 d)、苯妥英钠+1500 m组(在1500 m组基础上给予50 mg·kg-1苯妥英钠)、苯妥英钠+4010 m组(在4010 m组基础上给予50 mg·kg-1苯妥英钠)、苯妥英钠+6000 m组(在6000 m组基础上给予50 mg·kg-1苯妥英钠)和缺氧1 d组、缺氧2 d组、缺氧3 d组、缺氧4 d组(模拟海拔4010 m,低氧氧舱,分别缺氧1、2、3和4 d).用蛋白质印迹法检测BBB组织蛋白的表达水平,用高效液相色谱联用质谱法检测脑脊液苯妥英钠的浓度.结果 1500 m、4010 m、6000 m组的P-糖蛋白(P-gp)蛋白相对表达水平分别为1.00±0.04、1.84±0.02和2.10±0.05,多药耐药相关蛋白-4(MRP4)蛋白相对表达水平分别为1.00±0.05、2.77±0.08和4.42±0.03,苯妥英钠在脑脊液中的浓度为(864.78±348.32)、(1 000.22±273.90)和(1 214.17±314.09)ng·mL-1.1500 m组、4010 m组上述指标和6000 m组相比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).缺氧1 d组、缺氧2 d组、缺氧3 d组、缺氧4 d组P-gp蛋白相对表达水平分别为 1.00±0.03、1.85±0.04、3.10±0.02 和 2.17±0.05,MRP4 蛋白相对表达水平分别为 1.00±0.05、1.79±0.10、1.60±0.08和 1.31±0.06,缺氧1 d组、缺氧2 d组、缺氧3 d组上述指标和缺氧4 d组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 不同的高原缺氧环境对BBB中ABC族转运蛋白的表达产生不同的影响,并影响其底物药物在体内的药物浓度.

目的:探究灯盏花素对大鼠体内普伐他汀转运过程影响的作用机制,为临床合理用药提供数据支撑.方法:正常SD大鼠24只,随机分为生理盐水组、普伐他汀组、灯盏花素组和普伐他汀+灯盏花素组,每组6只.正常KM小鼠60只,随机分为普伐他汀组和普伐他汀+灯盏花素组,每组30只.按照不同剂量给药后采集大鼠胆汁样品和小鼠组织样品处理,采用高效液相色谱法测定样品中普伐他汀的药物浓度;采用RT-PCR和WB技术检测单独及联合给药对大鼠肝脏中Mrp2转运体基因表达和蛋白表达水平的影响.结果:与普伐他汀组比较,普伐他汀+灯盏花素组中除脑组织以外各组织内普伐他汀的药物浓度显著增加(P<0.05);普伐他汀的胆汁分泌量明显降低(P<0.01);与生理盐水组比较,普伐他汀组Mrp2基因和蛋白表达均无明显变化(P>0.05),灯盏花素组及普伐他汀+灯盏花素组中Mrp2转运体基因表达量明显下降(P<0.05),蛋白含量略有减少,但差异无统计学意义(P>0.05).结论:联用后,灯盏花素可能通过竞争抑制Mrp2转运体功能,使普伐他汀外排转运减慢,体内药物浓度增加,进而提高普伐他汀的临床疗效.

目的 探讨miR-152-3p对紫杉醇耐药人卵巢癌细胞A2780T对紫杉醇耐药性的影响及机制.方法 ①紫杉醇(1.875,3.75,7.5,17和23 μmol·L-1)与人卵巢癌A2780和A2780T细胞作用48 h,MTT法检测细胞存活率,计算抑制细胞存活半数抑制浓度(IC50)值和耐药指数(RI).Western印迹法检测A2780和A2780T细胞耐药蛋白P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)蛋白表达.②实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测A2780和A2780T细胞miR-152-3p表达水平.脂质体瞬时转染技术转染miR-152-3p抑制物降低A2780T细胞中miR-152-3p表达(miR-152-3p抑制物组),同时设转染miR-152-3p阴性对照组,RT-qPCR检测转染效率,MTT法、划痕实验和流式细胞术分别检测转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞存活、迁移和凋亡的影响;Western印迹法检测转染miR-152-3p抑制物对A2780T细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响.③用miRDB,Targetscan,miRWalk和Starbase数据库预测miR-152-3p的靶基因,并用Western印迹法检测转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞磷酸酯酶张力蛋白同源物(PTEN)蛋白表达的变化及RT-qPCR检测A2780和A2780T细胞PTEN mRNA表达水平予以验证.随后,脂质体瞬时转染技术转染PTEN siRNA沉默A2780T细胞中PTEN表达,同时设转染siRNA阴性对照组,RT-qPCR检测转染效率,MTT法检测沉默PTEN表达后A2780T细胞存活率和IC50值,Western印迹法检测P-gp,MRP1和ABCG2蛋白表达.结果 ①紫杉醇处理后A2780和A2780T细胞存活率均降低(P<0.01),A2780T细胞RI为2.8.与A2780细胞相比,A2780T细胞P-gp,MRP1和ABCG2蛋白高表达(P<0.05,P<0.01).②与A2780细胞相比,A2780T细胞miR-152-3p明显高表达(P<0.01).与转染miR-152-3p阴性对照组比较,转染miR-152-3p抑制物后A2780T细胞存活率(P<0.05,P<0.01)和细胞迁移能力(P<0.05)明显降低,细胞凋亡率升高(P<0.01);Bax蛋白表达增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05).③生物信息学数据库分析结果提示,PTEN是miR-152-3p的一个靶基因;Western印迹法验证显示,转染miR-152-3p抑制物组A2780T细胞PTEN蛋白表达低于转染miR-152-3p阴性对照组(P<0.05);RT-qPCR结果显示,A2780T细胞PTEN mRNA表达水平高于A2780细胞(P<0.01).转染PTEN siRNA沉默PTEN表达后,与转染siRNA阴性对照组相比,A2780T细胞存活率(P<0.05,P<0.01)和IC50值(P<0.01)显著降低,P-gp,MRP1和ABCG2蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01).结论 miR-152-3p在A2780T细胞中高表达,其表达下调可抑制A2780T细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡,降低A2780T细胞对紫杉醇的耐药性,该作用可能是通过降低其靶基因PTEN表达发挥的.

目的:探讨加味茵陈蒿汤治疗α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的胆汁淤积小鼠肝损伤的作用机制.方法:24只雄性SPF级C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(Normal组)、ANIT造模组(ANIT组)、加味茵陈蒿汤组(JWYCH组)、熊去氧胆酸组(UDCA组),每组6只.Normal组与ANIT组灌胃给予饮用水,持续10d;JWYCH组灌胃给予加味茵陈蒿颗粒剂水溶液,UDCA组灌胃给予熊去氧胆酸悬液,持续10d.第7天,小鼠用ANIT油溶液(50 mg/kg)造模.末次给药后,采用全自动生化仪检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)及总胆红素(TBiL)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织形态学变化;采用RT-qPCR检测肝组织法尼醇X受体(FXR)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、FGF受体4(FGFR4)mRNA表达;Western blot检测肝组织FGF15、FXR、磷酸化FXR(p-FXR)、FGFR4、外排型转运体[胆盐输出泵(BSEP)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)]、摄取型转运体[钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)、有机阴离子转运多肽2(OATP2)]蛋白表达.结果:血清肝功能生化学指标显示,与 Normal 组相比,ANIT 组 ALT、ALP、AST、TBA、TBiL 水平明显升高(P＜0.05);JWYCH 组和 UDCA 组 ALT、ALP、AST、TBA、TBiL水平明显低于ANIT组(P＜0.05);与UDCA组相比,JWYCH组的TBA水平明显下降(P＜0.05).肝组织病理结果显示,光镜下ANIT组可见胆管内胆栓形成,其汇管区以及胆管周国可见大量炎性细胞浸润,提示造模成功;JWYCH组、UDCA组病理损伤较ANIT组有明显改善.Western blot结果显示,与Normal组比较,ANIT组FGF15、FXR、p-PXR、FGFR4、BSEP、MRP2蛋白表达均明显减少(P＜0.05),提示造模成功;与 ANIT组比较,JWYCH组和 UDCA 组 FGF15、FXR、p-PXR、FGFR4、BSEP、MRP2 蛋白表达明显增加(P＜0.05,P＜0.01),而 NTCP、OATP2表达明显减少(P＜0.05).RT-qPCR结果显示,与Normal组比较,ANIT组小鼠肝组织FXR、FGF15、FGFR4的mRNA表达明显降低(P＜0.05);与ANIT组比较,UDCA组和JWYCH组FXR、FGF15、FGFR4的mRNA表达明显增加(P＜0.05);与UDCA组相比较,JWYCH组FGF15、FGFR4的mRNA表达明显增加(P＜0.05).结论:加味茵陈蒿汤能降低总胆汁酸水平,改善胆汁淤积和肝组织损伤.其作用机制可能是通过上调肝细胞FGF15、FGFR4表达,上调FXR和p-FXR水平,从而下调其下游摄取型转运体(NTCP、OATP2)水平以及上调外排型转运体(BSEP、MRP2)水平.