目的:探讨血必净注射液上调紧密连接蛋白claudin-5表达的信号通路。方法:利用脂多糖（LPS）建立急性呼吸窘迫综合征（ARDS）动物模型和细胞模型。①体内实验：将20只雄性SD大鼠随机分为4组，每组5只。正常对照组大鼠不做任何处理；LPS诱导组腹腔注射10 mg/kg LPS 12 h；血必净对照组腹腔注射1 mg/kg血必净注射液，每日2次，连续3 d；血必净干预组用血必净注射液预处理后腹腔注射10 mg/kg LPS 12 h。取大鼠肺脏，检测肺湿/干质量比值（W/D）和大鼠肺组织形态学改变；免疫组织化学染色（IHC）和蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测大鼠肺组织claudin-5、磷酸化叉头框蛋白O1（p-FOXO1）、总叉头框蛋白O1（t-FOXO1）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（p-Akt）、总Akt（t-Akt）蛋白表达。②体外实验：将人肺微血管内皮细胞（HPMECs）分为6组，每组5孔。正常对照组、血必净对照组（与2 g/L血必净共同孵育24 h）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）通路抑制剂LY294002对照组（与10 μmol/L LY294002共同孵育1 h）、LPS诱导组（与1 mg/L LPS共同孵育12 h）、血必净干预组（用2 g/L血必净预处理24 h后与1 mg/L LPS共同孵育12 h）、LY294002干预组（与10 μmol/L LY294002共同孵育1 h后加入2 g/L血必净孵育24 h，然后再与1 mg/L LPS共同孵育12 h）。用Western blotting检测每组HPMECs中claudin-5、p-FOXO1、t-FOXO1、p-Akt、t-Akt蛋白的表达。结果:体内实验结果：①肺组织W/D比值：LPS诱导组较正常对照组显著升高（6.79±0.42比4.19±0.13），经血必净干预后较LPS组明显下降（4.92±0.38比6.79±0.42， P<0.01）。②肺组织形态学改变：与正常对照组比较，LPS诱导组损伤严重，经血必净干预后明显改善。③ claudin-5、p-Akt/t-Akt、p-FOXO1/t-FOXO1蛋白表达水平：LPS诱导组各蛋白均较正常对照组明显降低〔claudin-5蛋白（claudin-5/GAPDH）：0.33±0.03比1.03±0.07，p-Akt/t-Akt：0.18±0.02比1.01±0.13，p-FOXO1/t-FOXO1：0.16±0.06比1.00±0.19，均 P<0.01〕；经血必净干预后表达水平较LPS诱导组显著增高〔claudin-5表达（claudin-5/GAPDH）：0.53±0.05比0.33±0.03，p-Akt/t-Akt：0.56±0.12比0.18±0.02，p-FOXO1/t-FOXO1：0.68±0.10比0.16±0.06，均 P<0.01〕。体外实验结果：LPS诱导组及血必净干预组claudin-5蛋白均较正常对照组明显降低（claudin-5/β-actin：0.45±0.03、0.80±0.08比1.01±0.15，均 P<0.01）；LY294002干预后claudin-5表达较血必净干预组明显下降（claudin-5/β-actin：0.41±0.02比0.80±0.08， P<0.01）。 结论:血必净通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路上调claudin-5，从而改善ARDS的肺血管屏障功能。

目的:探讨FOXO4-DRI能否逆转放射性肺纤维化(RIPF)及其作用机制。方法:将C57BL/6小鼠随机分为对照组、FOXO4-DRI组、照射组、照射＋ FOXO4-DRI组，照射组和照射＋ FOXO4-DRI组小鼠右侧全胸接受17 Gy X射线照射，FOXO4-DRI组和照射＋ FOXO4-DRI组小鼠照射后第16周和第20周分别腹腔注射FOXO4-DRI。照射后第24周收集小鼠右肺组织，进行HE染色和Masson三色染色，观察肺组织形态学改变和胶原沉积情况；免疫组织化学染色法检测肺组织中col1α1和α-SMA的表达；β-半乳糖苷酶(β-gal)染色观察衰老细胞；活性氧试剂盒检测肺组织活性氧水平；RT-PCR检测P21、P16 Ink4a和衰老相关分泌表型(SASP)mRNA的表达；Western blot检测相关蛋白表达水平。 结果:FOXO4-DRI减少了RIPF小鼠肺组织中胶原组织的沉积( t＝6.18， P<0.05)，降低了col1α1和α-SMA的表达( t＝4.69、3.20， P<0.05)。FOXO4-DRI减少了RIPF小鼠肺组织中β-gal阳性细胞的数量( t＝6.09， P<0.05)。FOXO4-DRI能够抑制RIPF小鼠肺组织中P21和P16 Ink4a基因、蛋白的表达( t＝5.31、3.32和4.77、3.37， P<0.05)，抑制SASP基因IL-1α、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNFα)和MMP2的表达( t＝4.36、4.84、4.47、3.82， P<0.05)。FOXO4-DRI能够降低RIPF小鼠肺组织中活性氧水平( t＝2.84， P<0.05)，促进p-AKT和p-PI3K蛋白的激活( t＝－7.13、－12.61， P<0.05)。 结论:FOXO4-DRI通过激活PI3K/AKT信号通路减少氧化应激、抑制细胞衰老，逆转RIPF。

目的:筛选儿童非综合征型颅缝早闭中颅缝间充质干细胞（suture mesenchymal stem cell，SMSC）的差异表达基因。方法:选取2018年6月至2021年6月在南京医科大学附属儿童医院接受治疗的3例非综合征型单侧冠状缝早闭患儿早闭侧及正常侧相关颅缝组织，分离并培养两侧SMSC，提取SMSC进行RNA测序筛选出差异表达基因，GO富集分析及KEGG富集分析寻找差异表达基因的基因功能。最后，利用定量PCR验证来源于冠状缝和人字缝两侧SMSC中差异表达基因的表达情况。结果:RNA测序共获得4 782条差异表达基因片段，其中上调基因片段2 379个、下调基因片段2 403个。GO富集分析提示差异表达基因的分子功能主要涉及蛋白结合、钙离子结合等，KEGG富集分析发现差异表达基因主要与MAPK通路、PI3K/Akt通路、FOXO通路等信号通路相关。定量PCR发现，与正常侧细胞相比，冠状缝和人字缝早闭侧SMSC高表达IGFBP2、COL8A1、MFAP5、COL11A1，而低表达AEBP1、SERPINE2，差异有统计学意义（均 P<0.05）。 结论:儿童非综合征型颅缝早闭中早闭侧SMSC的差异表达基因包括上调基因IGFBP2、COL8A1、MFAP5、COL11A1及下调基因AEBP1、SERPINE2。

目的 探讨红花提取物(Carthamus tinctorius L.ex-tract,CTLE)对酒精诱导的肝损伤小鼠氧化应激、脂质代谢和凋亡水平的影响及其作用机制.方法 采用慢性酒精喂养加急性酒精灌胃的酒精性肝病小鼠模型造模.小鼠被随机分为4组,造模期间每天观察小鼠状态变化并记录体质量.造模结束后,收集各组小鼠血液和肝脏组织.对小鼠血液进行生化分析.HE染色和油红O染色进一步评价小鼠肝脏病理损伤程度.应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和 Western blot 法检测 p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-FoxO1、FoxO1、p-FoxO3a、FoxO3a、p-FoxO4、FoxO4、BCL-2和BAX因子的mRNA和蛋白表达水平.结果 与模型组相比,CTLE给药组小鼠肝脏病理损伤程度和脂质沉积有所改善;小鼠血清及肝脏中的生化相关指标,如ALT、AST、TG、TC、MDA水平有所降低,GSH、SOD水平有所升高.并且通过调控PI3K/Akt/FoxO通路产生了更多的 SOD,减少了活性氧(reactive oxygen species,ROS)对机体的损伤和细胞凋亡.结论 CTLE可以通过PI3K/Akt/FoxO通路发挥抗氧化应激和抗凋亡作用,减轻小鼠的酒精性肝损伤,为治疗酒精性肝病和开发相关药物提供新的思路.

运用网络药理学和体外实验探究黄芩苷是否诱导HepG2细胞发生铁死亡并探讨潜在机制.体外培养HepG2细胞,CCK-8法检测细胞活力.TCGA数据库获取肝癌转录组测序数据,FerrDb V2数据库获取铁死亡基因数据.使用DEG2程辑包筛选差异表达基因,并与铁死亡基因取交集,得到介导铁死亡调节肝癌进程的靶向基因.通过基因本体数据库(Gene Ontology,GO)与京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)以 P＜0.05、| log2(fold change)|＞0.5为标准,分析模块相关的分子功能及结构.DCFH-DA探针检测细胞活性氧(reactive oxygen spe-cies,ROS)水平变化.试剂盒检测细胞还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、Fe2+水平.实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测谷胱甘肽过氧化物酶 4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、溶质载体家族 7 成员 11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)mRNA 表达.蛋白质印迹法检测 GPX4、SLC7A11、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表达.CCK-8检测结果显示,200 μmol·L-1黄芩苷干预48 h,能显著抑制HepG2细胞活力.网络药理学结果显示,可通过PI3K/Akt信号通路调节肝癌中铁死亡的发生.细胞实验结果显示,黄芩苷可下调SLC7A11,降低GSH水平和GPX4表达,诱导HepG2细胞ROS累积,增加Fe2+产生.铁死亡抑制剂(ferrostatin-1,Fer-1)可减少黄芩苷诱导的ROS累积,上调SLC7A11、GSH和GPX4表达,减弱PI3K、Akt、FoxO3a磷酸化.综上,黄芩苷可通过抑制ROS介导的PI3K/Akt/FoxO3a通路诱导HepG2细胞铁死亡.

目的 探究磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞(hPASMC)及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响.方法 细胞实验部分,将hPASMC分为4组:(1)空白对照组;(2)血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)组;(3)PDGF-BB+LY294002 组;(4)PDGF-BB+紫杉醇(paclitaxel)组.采用 TUNEL 检测细胞凋亡,采用蛋白质印迹法检测Bcl-2、裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平.动物实验部分,将12只SD大鼠随机分为4组:(1)空白对照组;(2)野百合碱(MCT)组;(3)MCT+LY294002组;(4)MCT+paclitaxel组.采用Western blot检测Bcl-2、cleaved caspase-3和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平.结果 细胞实验部分:相比于PDGF-BB组,PDGF-BB+LY294002 组与 PDGF-BB+paclitaxel 组的 Bcl-2 表达水平下降(P＜0.01),cleaved caspase-3 表达水平上升(P＜0.01);相比于空白对照组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的凋亡率增加(P＜0.01).动物实验部分:相比于MCT组,MCT+LY294002组与MCT+paclitaxel组Bcl-2、磷酸化Akt与磷酸化FoxO1表达水平下降(P＜0.01),cleaved caspase-3与FoxO1表达水平上升(P＜0.01).各组之间PI3K表达水平无显著差异.结论 PI3K/Akt/FoxO1信号通路抑制hPASMC与肺动脉高压大鼠肺组织的细胞凋亡.

目的 基于体外实验及网络药理学,初步探讨二肽激肽酶4(DPP-4)抑制剂对鱼藤酮(ROT)诱导神经细胞帕金森病(PD)的干预作用及其相关机制.方法 神经细胞株PC-12分为对照组、模型组、模型+西格列汀组、模型+利格列汀组、模型+维格列汀组,除对照组外各组均使用ROT建立PD体外模型,模型+西格列汀组、模型+利格列汀组、模型+维格列汀组在使用ROT建模的同时在培养基中分别加入DPP-4抑制剂西格列汀、利格列汀、维格列汀.倒置显微镜观察各组细胞形态学变化,CCK-8法观察各组细胞增殖能力.从Swiss Target Prediction、SEA等数据库分别获取DPP-4抑制剂西格列汀、利格列汀、维格列汀、沙格列汀及阿格列汀的药物靶点,通过DisGeNet、OMIM及GeneCards等数据库获取PD相关的疾病靶点,利用韦恩图将药物与疾病靶点取交集得到DPP-4抑制剂作用于PD的相关靶点.通过String数据库构建蛋白—蛋白相互作用(PPI)网络,选取基因满足度(Degree)值>平均值的基因作为DPP-4抑制剂对PD产生作用的关键靶点,将DPP-4抑制剂作用于PD的关键靶点基因输入到DAVID数据库进行GO基因功能和KEGG作用通路分析.将DPP-4抑制剂治疗PD的关键靶点以及KEGG信号通路导入到Cytoscape 3.7.2软件构建药物—疾病—靶点—通路网络,筛选与PD相关信号通路关系最为密切的靶点作为DPP-4抑制剂治疗PD的核心靶点,采用CB-Dock 2对接平台进行核心靶点的分子对接验证.结果 对照组细胞形态完整,增长状态良好,细胞呈多角形,细胞之间类似突触样连接,且突触较长;模型组细胞密度减少,细胞皱缩,细胞与细胞间的突触样连接断裂,且观察到较多圆形的损伤细胞;模型+西格列汀组、模型+利格列汀组、模型+维格列汀组较模型组细胞形态得到改善,恢复到正常状态下的细长、多角形态.模型组细胞存活率低于对照组、模型+西格列汀组、模型+利格列汀组、模型+维格列汀组(P均<0.05).共收集西格列汀药物靶点486个、利格列汀药物靶点665个、维格列汀药物靶点524个、沙格列汀药物靶点507个、阿格列汀药物靶点408个,PD疾病相关靶点1121个;将DPP-4抑制剂靶点与PD疾病相关靶点取交集共得到DPP-4抑制剂作用于PD的36个相关靶点.PPI网络显示,DPP-4抑制剂作用于PD相关靶点中Degree值>平均值的关键靶点共有16个,分别为ALB、IGF1、STAT3、CASP3、EGFR、ESR1、MAPK14、PPARG、MAPK1、HMOX1、NOS3、REN、MMP3、IL2、AR、IGF1R.GO分析结果显示,DPP-4抑制剂作用于PD的关键靶点共同涉及的生物过程主要包括信号转导、细胞迁移的正向调控和细胞凋亡的负向调控等,细胞组分主要包括细胞质、细胞质膜、细胞核等,分子功能主要包括酶结合、蛋白质结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等.KEGG通路富集分析共得到20条信号通路,与PD较为相关的信号通路为PI3K-AKT信号通路、FoxO信号通路、MAPK信号通路.药物—疾病—靶点—通路网络图显示,在PI3K-AKT、FoxO及MAPK信号通路中均有富集的靶点为IGF1、EGFR、IGF1R及MAPK1.分子对接结果显示,5种DPP-4抑制剂均与PD相关核心靶点蛋白有较好的结合,其结合能均小于-5.0 kcal/mol.结论 DPP-4抑制剂对PD体外模型细胞具有积极地干预作用,其可能通过IGF1、EGFR、IGF1R及MAPK1等核心靶点作用于PI3K-AKT、FoxO、MAPK等信号通路来发挥作用.

目的 探究低剂量丙泊酚对心肺转流术(CPB)引起的术后认知功能障碍(POCD)的影响.方法 12 月龄的SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组、丙泊酚组与丙泊酚+LY294002 组,通过CPB模型诱导POCD,Morris水迷宫检测大鼠学习与记忆功能,电生理测试检测海马区神经元长时程增强,尼氏(Nissl)染色检测海马区神经元状态,Western印迹检测海马区神经元Toll样受体(TLR)4/叉头蛋白(Fox)O1 与磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)表达.结果 与对照组相比,CPB模型导致大鼠逃避潜伏期明显增加,穿越平台次数与第Ⅰ象限停留时间明显减少(P<0.05).与模型组相比,丙泊酚明显减少了大鼠逃避潜伏期,明显增加了穿越平台次数与第Ⅰ象限停留时间(P<0.05).与模型组相比,丙泊酚组长时程电位水平明显增加,神经元状态明显损伤,且炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β与IL-6 含量明显增加,海马神经元中TLR4 表达明显降低,p-FoxO1,p-PI3K与p-Akt表达明显增加(P<0.05).与丙泊酚组相比,LY294004 通过降低p-PI3K与p-Akt表达明显增加大鼠逃避潜伏期,明显减少穿越平台次数与第Ⅰ象限停留时间,且丙泊酚诱导的长时程电位升高与神经元状态改变也被LY294002 明显逆转(P<0.05).结论 低剂量丙泊酚可能通过激活PI3K/Akt信号通路,降低TLR4 表达,减少炎性细胞因子的释放,改善海马神经元凋亡,从而减轻CPB诱导的POCD.

目的:分析肥胖小鼠在低氧暴露后棕色脂肪组织的差异表达基因及通路,以探讨低氧影响棕色脂肪组织活化的机制.方法:30只雄性C57BL/6J小鼠,其中8只为普通对照组(N,n=8);其余饲喂高脂饲料8周后,肥胖建模成功小鼠随机分为两组:肥胖对照组(OB,n=8)和肥胖低氧组(H,n=8).H组进行11.2％氧浓度8 h/d,6天/周共4周的低氧暴露.4周后,测试血糖、血脂,取肩胛处棕色脂肪组织进行mRNA表达谱芯片扫描和生物信息学分析.利用KOBAS2.0软件对所筛选差异表达基因,并对参与关键生物过程和信号通路的差异基因进行实时荧光qPCR验证.结果:干预结束后,H组较OB组体重和血脂血糖水平显著降低;OB组较N组的上调差异基因802个,下调1 175个,差异基因的功能主要集中在糖脂合成代谢及免疫炎症反应过程;H组较OB组上调基因297个,下调228个,主要参与的生物过程有糖脂代谢、脂质转运过程、肌肉组织发育过程及脉管系统发育过程;低氧暴露调节肥胖机体棕色脂肪的通路主要集中在HIF-1、PI3K-Akt、FoxO和ErbB信号通路等过程.结论:11.2％氧气暴露可通过调节一系列棕色脂肪相关基因表达而提高棕色脂肪活性,从而下调肥胖机体体重.

目的 探讨五味子乙素对脂多糖(LPS)诱导的心肌H9c2细胞炎性损伤的影响及其作用机制,以期为五味子乙素的临床应用奠定基础.方法 2017年3月—2018年1月,将传代培养的心肌H9c2细胞接种于96孔板上并分为正常对照组(A组)、LPS诱导组(B组)、LPS+低剂量五味子乙素组(C组)、LPS+中剂量五味子乙素组(D组)、LPS+高剂量五味子乙素组(E组),细胞生长贴壁后A组心肌H9c2细胞常规培养,B组心肌H9c2细胞仅加入含1 mg/L的LPS,C、D、E组心肌H9c2细胞在B组基础上分别加入10、50、150 mg/L五味子乙素,5组心肌H9c2细胞均培养24 h.比较5组心肌H9c2细胞相对存活率、凋亡率、炎性因子含量及PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1蛋白相对表达量.结果 (1)C、D、E组心肌H9c2细胞相对存活率高于B组,D、E组心肌H9c2细胞相对存活率高于C组,E组心肌H9c2细胞相对存活率高于D组(P<0.05).(2)B、C、D、E组心肌H9c2细胞凋亡率高于A组,C、D、E组心肌H9c2细胞凋亡率低于B组,D、E组心肌H9c2细胞凋亡率低于C组,E组心肌H9c2细胞凋亡率低于D组(P<0.05).(3)B、C、D、E组心肌H9c2细胞白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量高于A组,C、D、E心肌H9c2细胞IL-6、TNF-α含量低于B组,D、E组心肌H9c2细胞IL-6、TNF-α含量低于C组,E组心肌H9c2细胞IL-6、TNF-α含量低于D组(P<0.05).(4)5组心肌H9c2细胞Akt、FoxO1蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05);B、C、D组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量低于A组,C、D、E组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量高于B组,D、E组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量高于C组,E组心肌H9c2细胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相对表达量高于D组(P<0.05).结论 五味子乙素可有效促进LPS诱导的心肌H9c2细胞增殖、抑制心肌H9c2细胞凋亡、降低心肌H9c2细胞炎性因子含量,有利于减轻细胞炎性损伤,其作用机制可能与激活PI3K/Akt/FoxO1信号通路有关.