目的:建立复制型慢病毒(replication competent lentivirus, RCL) VSV-G qPCR检测方法，并进行方法学性能验证及初步应用。方法:以慢病毒载体包膜VSV-G基因为目标序列，建立荧光定量PCR检测方法，并对方法的专属性、线性、扩增效率、精密度、准确度、线性范围、检测限、定量限及耐用性进行验证。利用所建立的方法进行CAR-T细胞、慢病毒载体生产终末细胞及慢病毒载体收获液样品的初步应用性研究。结果:建立的VSV-G荧光定量PCR法，专属性较好，对293T细胞、PBMC细胞及C8166细胞均无特异性扩增，线性范围为1×10 2拷贝/test～1×10 9拷贝/test， R2能够达到0.998以上，扩增效率在93%～98%之间，精密度RSD<12%，准确度回收率为85%～106%，最低检出限和最低定量限分别为5拷贝/test和40拷贝/test。另外，该方法的耐用性较好。各项验证结果均表明该方法能够满足检测的要求。利用该方法对54批样品(包括CAR-T细胞、慢病毒载体及载体生产终末细胞)进行RCL C8166细胞培养法的终点检测，结果显示54批样品均为阴性。 结论:成功建立了VSV-G实时荧光定量PCR法，各项验证参数均可满足检测要求，该方法的应用将进一步提高慢病毒载体相关产品的安全性。

目的:分析发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)不同基因型和突变体的中和特性。方法:采用VSVΔG-Fluc*G骨架构建SFTSV不同基因型和突变体的假病毒，建立以假病毒为基础的中和抗体检测方法。制备不同基因型DNA疫苗并免疫豚鼠采集血清。对DNA疫苗免疫后血清以及自然感染者的血清进行中和抗体检测，分析其中和特性。结果:成功构建了5个基因型和43株突变体的假病毒。通过条件优化，建立了以假病毒为基础的中和抗体检测方法。利用报告基因表达量的减少，将中和抗体对假病毒的半数感染抑制率所对应的稀释倍数作为中和抗体滴度。以参考株HB29检测，自然感染者的中和抗体滴度在1∶100～1∶43 000之间，不同基因型DNA疫苗免疫后的中和抗体在1∶100～1∶2 500之间。不同基因型和突变体对DNA疫苗免疫的豚鼠血清以及自然感染者血清的中和抗体检测差异无统计学意义。结论:各基因型和突变体的中和特性未发现明显改变，对疫苗毒株的选择具有重要参考价值。

目的:探讨柔肝化纤颗粒联合核苷类抗病毒药物对乙型肝炎失代偿期肝硬化患者肝肾功能、门静脉系统血流动力学、血管活性、抗病毒指标及对天冬氨酸氨基转移酶-血小板比值指数（aspartate aminotransferase-platelet ratio index，APRI）的影响。方法:采用病例对照研究方法，收集2017年6月至2019年12月于唐山市传染病院和华北理工大学附属医院住院的乙型肝炎失代偿期肝硬化患者150例。应用计算机随机数字法分为对照组和观察组，每组各75例。对照组给予常规护肝和抗病毒治疗；观察组在对照组治疗的基础上加用柔肝化纤颗粒。观察两组患者的肝肾功能、门静脉系统血流动力学、血管活性、抗病毒指标及对APRI的变化。计量资料的两组间比较采用独立样本 t检验，同组间治疗前后比较采用配对 t检验，计数资料采用 χ2检验。 结果:两组患者性别、年龄、肝硬化病程、肝功能Child分级、治疗前各项指标基数资料比较差异均无统计学意义（均 P>0.05）。治疗后两组患者丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、门静脉内径（diameter of portal vein，Dpv）、脾静脉内径（diameter of splenic vein，Dsv）、内皮素1、一氧化氮、胰高血糖素（glucagon，GLA）、APRI均较治疗前降低；组间比较，观察组ALT（51.60±15.97）U/L、AST（62.65±26.28）U/L、尿素氮（10.25±1.65）mmol/L、肌酐（78.54±14.09）μmol/L、Dpv（10.20±1.10）mm、Dsv（8.08±0.68）mm、内皮素1（31.93±6.35）ng/L、一氧化氮（41.38±8.06）μg/L、GLA（69.54±12.14）mg/L、APRI 3.14±1.35明显低于对照组［（97.49±30.87）U/L、（96.03±25.63）U/L、（17.49±2.55）mmol/L、（116.43±22.77）μmol/L、（13.42±1.26）mm、（10.44±0.83）mm、（44.34±11.88）ng/L、（63.47±15.50）μg/L、（107.11±25.29）mg/L、5.91±1.93］，差异均有统计学意义（ t值分别为11.43、7.87、20.64、12.26、16.62、18.99、7.98、10.96、11.60、10.23，均 P<0.05）。治疗后两组患者白蛋白、门静脉血流速度（portal vein velocity，Vpv）、脾静脉血流速度（velocity of splenic vein blood flow，Vsv）均较治疗前升高，但对照组治疗前后Vsv比较差异无统计学意义（ t=0.51， P=0.613）；组间比较，观察组白蛋白（39.42±7.35）/L、Vpv（25.72±4.06）cm/s、Vsv（24.22±6.15）cm/s明显高于对照组［（34.66±7.95）g/L、（19.38±3.46）cm/s、（19.54±5.88）cm/s］，差异均有统计学意义（ t值分别为3.81、10.28、4.76，均 P<0.05）。治疗后观察组总有效率［96.00%（72/75）与86.67%（65/75）， χ2=4.13， P=0.042］、HBV DNA转阴率［76.00%（57/75）与58.67%（44/75）， χ2=5.12， P=0.024］、HBeAg转阴率［50.67%（38/75）与30.67%（23/75）， χ2=6.22， P=0.013］、HBeAg/HBeAb血清转换［28.00%（21/75）与13.33%（10/75）， χ2=4.92， P=0.027］高于对照组，差异均有统计学意义；HBsAg转阴率［8.00%（6/75）与5.33%（4/75）， χ2=0.43， P=0.513］高于对照组，但差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:柔肝化纤颗粒联合核苷类抗病毒药物对乙型肝炎失代偿期肝硬化患者疗效显著，改善肝肾功能、肝纤维化和门静脉系统血流动力学，增加血管活性功能，降低乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA载量、HBV复制，降低APRI、TLR-4、TGF-β1水平，提高机体免疫状态。

目的:为探究发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)中Gc及其N-糖基化位点与病毒感染性的关系，构建了含有SFTSV Gc糖基化位点突变体的重组假病毒。方法:利用定点突变和同源重组技术构建了SFTSV Gc及3个N-糖基化位点突变的真核表达载体pcDNA3.1(＋)-Gc、pcDNA3.1(＋)-Gc(N291Q)、pcDNA3.1(＋)-Gc(N352Q)和pcDNA3.1(＋)-Gc(N374Q)。验证其在293T细胞中成功表达后，感染VSVΔG-Fluc*G假病毒，构建4株重组假病毒并检测其对细胞感染力的影响。结果:双酶切鉴定和序列测定证实成功构建真核表达载体pcDNA3.1(＋)-Gc、pcDNA3.1(＋)-Gc(N291Q)、pcDNA3.1(＋)-Gc(N352Q)和pcDNA3.1(＋)-Gc(N374Q)。间接免疫荧光和Western blot结果表明4个重组质粒均成功表达。SFTSV Gc重组假病毒对Vero细胞有感染特异性。糖基化位点突变后假病毒感染能力明显降低，且352位糖基化位点突变株感染水平最低( P<0.001、 P＝0.001)。 结论:SFTSV Gc的糖基化位点可能与病毒的感染力相关，且第352位氨基酸突变后，对病毒感染力影响最大。

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤，酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性，流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能，Fortebio测定抗体亲和力，抗体全长测序，经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)；人EGFR单克隆抗体杂交瘤系，经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因，构建scFv，克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接，克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体，使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞，获得包装病毒，感染293V细胞，FACS测定CAR膜表达，ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况，转染激活人外周血T细胞，验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3，具备高度配受体封阻性能，经人源化改造后，亲和力稳定(2.67×10 －10 mol/L)，EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2)，其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后，细胞膜表面表达EGFR-scFv，检测培养上清存在PD-L1-ScFv；CTZ0431-2感染293V细胞后，细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达，双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体，EGFR-CAR中度结合亲和力，此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。

目的:探究野生型水疱性口炎病毒印第安纳株(VSV-IN)对小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞移植模型小鼠的免疫调节及肿瘤转移的影响.方法:VSV以MOI=1、MOI=10、MOI=100感染4T1细胞12、24、48 h后,CCK-8法检测4T1细胞死亡率,划痕愈合实验检测细胞迁移能力,qPCR检测细胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9 mRNA的表达.于雌性BALB/c小鼠脂肪垫接种1×106个/mL的4T1细胞0.1 mL,构建4T1细胞荷瘤小鼠模型,待小鼠肿瘤体积达200 mm3,分别向移植瘤内注射PBS、紫杉醇(TAX)(15 mg/kg)、VSV-IN(1×106 pfu/只),每周1次.给药4次后,处死小鼠、剥离完整移植瘤组织,测量肿瘤体积及质量,肺组织病理切片经H-E染色后观察肿瘤肺部转移结节,流式细胞术检测脾组织中T细胞亚群比例,ELISA法检测小鼠血清IL-6及TNF-α水平,利用GEPIA在线分析乳腺肿中迁移相关蛋白mRNA的表达,免疫组化法检测肿瘤中MMP-2、MMP-9与E-cadherin的表达,利用蛋白-蛋白对接技术预测VSV-IN的G蛋白、M蛋白与ERK2、E-cadherin的亲和力.结果:经MOI=10、100的VSV-IN处理48 h后,4T1细胞死亡率显著高于对照组(均P<0.01);与对照组相比,VSV-IN组(MOI=10)细胞迁移率明显降低(P<0.01),MMP-9 mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05);与对照组小鼠相比,VSV-IN组移植瘤生长较对照组减缓且终点体积显著减小(P<0.05),VSV-IN组小鼠肺转移结节数量显著减少[(12.86±1.86)vs(24±3.67)个,P<0.01],脾内CD4+T、CD8+T细胞比例显著升高(均P<0.05),血清TNF-α、IL-6含量显著升高(均P<0.01);GEPIA分析发现在乳腺癌中E-cadherin、MMP-9表达水平均高于癌旁组织(P<0.05);VSV-IN组小鼠肿瘤细胞内MMP-9表达明显低于对照组(P<0.05);VSV-IN的G、M蛋白与ERK2的结合自由能分别为-11.7 kcal/mol、-6.4 kcal/mol.结论:野生型VSV-IN可抑制4T1细胞荷瘤小鼠的移植瘤生长及转移,这可能与其促进抗肿瘤免疫及调控迁移相关蛋白表达有关.

目的 探索土木香内酯体内外的抗病毒作用,并基于Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)通路探究其抗病毒作用机制.方法 CCK-8法检测土木香内酯对A549细胞活力的影响;利用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein,VSV-GFP)感染细胞模型,结合流式细胞术检测土木香内酯对病毒复制的影响;qRT-PCR检测土木香内酯对甲型流感病毒(influenza A virus,H1N1)、脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)复制的影响;Western blotting检测土木香内酯对VSV病毒G蛋白和H1N1病毒NP蛋白表达的影响;利用生物信息学初步分析土木香内酯的抗病毒分子机制;qRT-PCR检测药物处理后干扰素α1(interferon α1,Ifna1)、干扰素β1(interferonβ1,Ifnb1)、干扰素诱导蛋白1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1,Ifit1)、干扰素刺激基因 15(interferon stimulated gene 15,Isg15)的mRNA表达变化;流式细胞术和qRT-PCR检测 Ⅰ型干扰素受体1(type Ⅰ interferon receptor 1,IFNAR1)敲除(Ifnar1-/-)细胞中,土木香内酯的抗病毒作用与干扰素信号通路的关系;构建小鼠H1N1病毒滴鼻感染模型探究土木香内酯的体内抗病毒作用.结果 土木香内酯体外抑制VSV、H1N1和EMCV病毒复制;土木香内酯激活IFN-Ⅰ信号通路;在Ifnar1-/-细胞中土木香内酯抗病毒作用被削弱;土木香内酯提高H1N1感染小鼠的存活率,降低脏器H1N1病毒载量.结论 土木香内酯激活基于IFN-I信号通路的抗病毒天然免疫反应,发挥抵抗多种病毒复制的作用.

目的 研究异土木香内酯的体外抗病毒作用及机制.方法 CCK-8法检测0.125、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000、64.000 μmol·L-1的异土木香内酯处理24h对人非小细胞肺癌细胞系(A549)细胞活力的影响;表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV-eGFP)以0.02的感染复数(MO1)感染A549细胞制备模型,流式细胞术检测共同孵育12h的异土木香内酯5、10、20μmol·L-1对GFP阳性细胞率的影响;VSV感染(MOI=0.1)A549细胞,Western blotting检测异土木香内酯处理16h对VSV病毒G蛋白表达的影响;分别使用甲型流感病毒(H1N1,MOI=0.1)、脑心肌炎病毒(EMCV,MOI=0.1)感染A549细胞,同时给药共同孵育8h后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测土木香内酯对病毒RNA表达的影响;异土木香内酯分别以预处理12 h、病毒吸附过程中给药2 h、病毒吸附后给药10h3种不同方式给药,通过流式细胞术检测其对VSV-eGFP在A549细胞中复制的影响;异土木香内酯20 μmol·L-1处理胚胎成纤维(MEF)细胞12h,进行转录组测序分析;异土木香内酯5、10、20μmol·L-1处理MEF细胞12 h,qRT-PCR检测干扰素α1(Ifna1)、干扰素β1(Ifnb1)、干扰素诱导蛋白44(Ifi44)、干扰素刺激基因15(Isg15)的mRNA表达.结果 异土木香内酯对A549细胞的半数抑制浓度(IC50)为51.01μmol·L-1;与模型组比较,流式结果显示异土木香内酯显著减少VSV-eGFP阳性细胞率(P＜0.001),但对病毒的吸附过程没有影响,药物预处理及吸附后给药显著抑制VSV病毒复制(P＜0.01、0.001);qRT-PCR结果显示异土木香内酯显著降低H1N1、EMCV病毒的mRNA水平(P＜0.001);Western blotting结果显示异土木香内酯显著抑制VSV的G蛋白表达(P＜0.001);转录组测序分析和qRT-PCR结果表明,异土木香内酯促进Ⅰ型干扰素通路的激活,并诱导Ifnia1、Ifnb1、Ifi44、Isg15(P＜0.001)表达.结论 异土木香内酯通过促进基于干扰素通路的抗病毒天然免疫激活,发挥抑制病毒复制的作用.

目的 以水庖性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)为载体,构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)G蛋白的嵌合型重组VSV.方法 将VSV骨架质粒G基因替换为狂犬病疫苗CTN-1株G基因,与分别表达T7聚合酶及VSV N、P、L蛋白的辅助质粒共转染293T细胞,获得重组病毒.通过RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测RV G基因和G蛋白表达.将重组病毒在Vero细胞上传代培养,检测不同代次病毒滴度并绘制病毒生长曲线.结果 成功获得了重组病毒VSV-RVG,RT-PCR结果表明重组病毒基因组中成功插入了 RV G基因,免疫荧光法和Western blot可检测到RVG蛋白的表达.重组病毒连续传代5次,病毒滴度稳定在7.5～8.51gTCID50/mL之间.结论 成功构建了表达RVG蛋白的嵌合型重组VSV,重组病毒具有良好的遗传稳定性,为以VSV为载体的反向遗传学技术平台的构建奠定了基础.

目的 利用树突状细胞CAL-1的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测平台,以进一步应用于抑制性寡聚脱氧核苷酸的筛选.方法 以含有未甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸CpG(CpG ODN) 0800(3μg/ml)作为刺激剂,将其作用CAL-1细胞(2×105个细胞/孔),48 h后收集上清,作用于L929细胞(2×104个细胞/孔).培养18h,加入水疱性口炎病毒(VSV),培养72 h,检测570 nm处的吸光度值.结果 筛选条件确定为CpG ODN 0800终质量浓度为3μg/ml,CAL-1上清液1∶5倍稀释.L929细胞数在2×104个细胞/孔,反应时间为24 h.应用此条件成功筛选出自行设计的抑制性ODN-SAT05f.结论 建立实验体系,成功检测了自行设计的抑制ODN和CpG ODN诱导的CAL-1细胞的TNF-α的生物学活性.