减少乳酸和氨积累一直是动物细胞培养的一个目标,保持培养过程中较低浓度葡萄糖和谷氨酰胺的工艺控制法是最便捷和高效的优化策略.基于在线拉曼检测技术和比例-积分-微分(proportional-integral-derivative,PID)自动反馈控制技术,实现了 BHK-21细胞伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)疫苗生产过程中低葡萄糖浓度(0.5 g/L左右)和低谷氨酰胺浓度(1.5 mmol/L左右)控制,乳酸和氨积累量分别降低了 26.0％和30.3％,病毒接毒时pH维持在6.75以上,并利用在线活细胞检测技术确定了最佳补料时间、最佳接毒时间及最佳收毒时间.经过补料操作后,细胞比生长速率最大值延迟了 12 h,且细胞高活性状态维持了更长时间(24～48 h),在保持单细胞产毒能力的同时,有效提高了接毒时的细胞密度,最大病毒滴度达到高糖对照组的10倍及手动流加组的1.4倍.替代传统手动补料操作,成功建立了基于低葡萄糖和谷氨酰胺浓度以及在线拉曼和在线活细胞检测的BHK-21细胞反应器过程分析技术(PAT)控制的PRV疫苗智能生产工艺,为实现生物药物的智能制造奠定了基础.

目的:研究M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移及能量代谢重编程的影响.方法:利用终浓度为320 ng/mL佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)刺激 THP-1 细胞为巨噬细胞(M0)后,利用 100 ng/mL PMA+IL-4(20 ng/mL)+IL-13(20 ng/mL)刺激 48 h 诱导成 M2 型巨噬细胞,qRT-PCR 检测 iNOS、IL-1 β、TNF-α、Arg-1、CCL-18、IL-10的表达,免疫荧光检测CD206、CD86的表达.收集M0型(M0-CM)及M2型巨噬细胞条件培养基(M2-CM),利用M0-CM、M2-CM分别作用肺癌细胞(A549、H1299)48 h后,EdU检测细胞增殖能力变化;Annexin V-FITC/PI双染检测肺癌细胞凋亡;Transwell检测细胞侵袭及迁移能力;LC-MS/MS检测肺癌细胞能量代谢变化.结果:与M0巨噬细胞比较,M2型巨噬细胞中iNOS(P＜0.01)、IL-1 β(P＜0.01)、TNF-α(P＜0.01)的表达显著降低,Arg-1(P＜0.01)、CCL-18(P＜0.01)、IL-10(P＜0.01)的表达显著升高;表面抗原CD206的表达显著升高,而CD86的表达显著降低.与M0-CM比较,M2-CM可显著促进肺癌细胞(A549、H1299)增殖(P＜0.01)、抑制肺癌细胞(A549、H1299)凋亡(P＜0.01)、促进肺癌细胞(A549、H1299)侵袭及迁移(P＜0.01).与M0-CM比较,M2-CM可显著促进D-木酮糖5-磷酸、磷酸乙醇胺、尿苷5-单磷酸、肌苷-1-磷酸、腺苷酸、葡萄糖、D-核酮糖5-磷酸、6-磷酸葡萄糖酸、果糖1,6-二磷酸、2-磷酸-D-甘油酸等含量,降低谷氨酰胺、酪氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸等含量.KEGG富集分析发现,差异代谢产物主要富集在氨基酸生物合成、胺酰tRNA生物合成、矿物质吸收、蛋白质的降解及吸收等通路.结论:M2型肿瘤相关巨噬细胞可促进肺癌细胞增殖、侵袭及迁移,抑制肺癌细胞凋亡;其机制可能与调控肺癌细胞能量代谢重编程相关.

目的:基于核磁共振氢谱(1 H NMR)研究电针"内关"穴对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠血清和心肌组织代谢物的影响,探讨电针"内关"穴对M IRI大鼠代谢模式的影响.方法:30只SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组、电针组.对照组:不予电针,仅用鼠板束缚大鼠,每次20 min,每日1次,持续7 d;模型组予心肌缺血再灌注造模:至第7天后结扎冠状动脉左前降支40 min后恢复血流60 min;电针组(频率10 Hz/50 Hz,脉冲宽度0.5 ms,强度1 mA):每日电针双侧"内关"穴1次,时间20 min,持续7 d,于第7天电针后造模.造模结束后,收集3组大鼠的血清和心肌组织.利用1 H NMR进行代谢物检测并利用多元统计方法主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)进行模式识别.结果:与对照组相比,模型组大鼠血清的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、3-羟基丁酸、乳酸、丙氨酸、赖氨酸、醋酸盐、N-乙酰糖蛋白、丙酮、乙酰乙酸、琥珀酸、谷氨酰胺、多不饱和脂肪酸、肌酸、甘油磷酸胆碱、甘氨酸均浓度下降,低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白、葡萄糖浓度上升;其中除丙酮、乙酰乙酸和多不饱和脂肪酸外,低密度脂蛋白/极低密度脂蛋白在电针后下降到接近对照组水平,其它代谢物浓度均在电针后上升到接近对照组水平,电针组大鼠血清的代谢模式更接近对照组.与对照组相比,模型组大鼠心肌组织的乳酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甘油磷酸胆碱、肌酸、牛磺酸、甘氨酸、苏氨酸、腺苷一磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度下降,葡萄糖浓度明显上升;其中肌酸、甘油磷酸胆碱、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度在电针后上升,葡萄糖浓度在电针后下降;此外,电针组大鼠心肌组织苏氨酸、腺苷一磷酸浓度较模型组进一步下降;电针组大鼠心肌的代谢模式虽然有向对照组偏移的趋势,但与对照组差异还是较大.结论:电针"内关"穴可调节M IRI大鼠糖代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢及能量代谢,对心肌具有一定的保护作用,但其具体的代谢通路及机制需要进一步研究.

目的 探讨谷氨酰胺对宫颈癌术后盆底野外放疗患者肠道的保护作用.方法 选取90例宫颈癌术后拟行放疗的患者,随机分为试验组和对照组,各45例.试验组采用谷氨酰胺补充疗法;对照组则采用等量的等渗葡萄糖液静脉滴注.对比2组患者放疗前后的血浆谷氨酰胺浓度、DAO、D-乳糖及外周血淋巴细胞与白细胞计数的变化.结果试验组患者放疗后RTOG急性放射损程度明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);放疗后7天检测血浆谷氨酰胺浓度、DAO浓度及D-乳糖浓度比较,试验组明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);放疗后7天试验组CD8+及外周白细胞总数明显低于对照组,CD4+相对计数明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 宫颈癌术后盆底野外放疗过程中补充谷氨酰胺能够有效减轻患者的胃肠道反应,保护肠道黏膜功能,可以更好地改善患者预后.

目的 运用基于核磁共振(NMR)的代谢组学研究方法,探索无胆囊结石的健康人/肝移植供体和胆囊结石患者的血清和胆汁中代谢物质的差别,分析与胆囊结石发病机制相关的代谢变化.方法 前瞻性收集2016年3月至2016年12月期间于四川大学华西医院接受腹腔镜胆囊切除术的19例胆囊结石患者的血清标本(17例)和胆汁标本(19例),同时收集同期于四川大学华西医院行体检的10位健康体检者的血清标本,以及15例肝移植供体的胆汁标本,采用1H-NMR代谢组学技术比较无胆囊结石的健康人/肝移植供体和胆囊结石患者的血清和胆汁中代谢物质的差异.结果 与无胆囊结石的健康人比较,胆囊结石患者血清中的缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙酮酸、肌酸酐、胆碱、α-葡萄糖、β-葡萄糖、酪氨酸、组氨酸及次黄嘌呤的浓度均明显降低(P＜0.05),而乳酸盐、乙酰乙酸及1,2-丙二醇的浓度均明显升高(P＜0.05).与肝移植供体比较,胆囊结石患者胆汁中的牛磺酸结合的胆汁酸、甘氨酸结合的胆汁酸、胆碱及磷脂酰胆碱的浓度均明显降低(P＜0.05),而胆固醇的浓度明显升高(P＜0.05).结论 胆囊结石患者的血清和胆汁代谢物和无胆囊结石的健康人/肝移植供体存在明显差异,1H-NMR代谢组学方法有助于研究胆囊结石的发病机制.

目的:建立并验证慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠模型,运用代谢组学的方法研究CAG大鼠模型代谢组学特征及生物标志物,探讨胃经穴位与胃之间是否存在一定的相对特异性联系.方法:将32只SD大鼠随机分为空白组和模型组,通过MNNG联合乙醇灌胃、饥饱失常法复制CAG大鼠模型.HE染色观察大鼠胃组织病理学变化,采用1H-NMR检测足三里穴区及胃组织代谢物并分析所得数据.结果:造模结束后,模型组大鼠胃黏膜色苍白,黏膜层变薄,弹性减少,皱襞变平,黏液减少,有散在出血点,HE染色结果可见大量炎性细胞浸润,大量主细胞坏死空泡样变化,大量纤维组织充填,并有诸多集中出血点,腺体结构紊乱减少,固有腺体出现萎缩.与空白组对比,模型组大鼠胃组织共有17个差异性代谢物,其中,乳酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、N-乙酰天门冬氨酸、尿苷二磷酸葡萄糖、肌糖、腺嘌呤核糖核苷酸7个代谢物浓度显著升高,而亮氨酸、牛磺酸、N,N-二甲基甘氨酸、甜菜碱、丝氨酸、磷酸胆碱、乙酰磷酸胆碱、尿嘧啶、尿苷、苯丙氨酸10个代谢物浓度显著降低.模型组大鼠足三里穴区组织中谷氨酰胺、琥珀酸、赖氨酸、富马酸、次黄嘌呤、一磷酸腺苷显著降低,而N-乙酰天门冬氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、磷酸胆碱/甘磷酸胆碱、酪氨酸、苯丙氨酸、黄嘌呤、肌苷显著升高.结论:代谢组学得出CAG模型大鼠足三里穴区与胃组织之间在病理上相互关联,可初步表明胃经穴位与胃之间存在一定的相对特异性联系.

为了深入理解在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞流加培养过程中氨对抗体融合蛋白表达和N-糖基化的作用,认识氨影响N-糖基化加工的作用位点,考察了在细胞维持期(产物表达期)不同氨浓度条件与CHO细胞维持与代谢、抗体融合蛋白表达和N-糖链结构的关系.结果 显示,氨浓度在5-12 mmol/L范围内对维持期的细胞生长曲线、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸和氨的生成情况没有明显影响.但当氨浓度大于5 mmol/L时,随着氨浓度的升高,抗体融合蛋白的唾液酸化程度和半乳糖化程度均不断降低,而岩藻糖基化程度和高甘露糖糖型比例则没有变化.当氨浓度升高至大于9 mmol/L后,抗体融合蛋白的表达能力和最终表达量开始降低.因此,应在细胞培养工艺过程开发时控制氨的生成至小于5 mmol/L,以避免氨的累积导致产物的半乳糖化和唾液酸化程度降低以及产物表达量下降.

目的 观察谷氨酰胺如何通过促进骨骼肌MG53二聚化,从而对严重烧伤小鼠骨骼肌膜修复产生影响,并探讨其作用机制. 方法 (1)动物实验.按随机数字表法(分组方法 下同)将179只6～8周龄BALB/c雄性小鼠分为假伤组(43只)、烧伤组(73只)、烧伤+谷氨酰胺组(63只).将假伤组小鼠背部致假伤,将烧伤组和烧伤+谷氨酰胺组小鼠背部造成Ⅲ度30％体表总面积烫伤(以下称烧伤).烧伤+谷氨酰胺组小鼠灌胃谷氨酰胺1 mg/kg,另2组小鼠灌胃等量氨基酸溶液,每天1次,持续14 d.伤后12h,取10只烧伤组小鼠制备烧伤血清,用于后续细胞实验.假伤组在伤后即刻取10只小鼠,烧伤组和烧伤+谷氨酰胺组分别在伤后5、10、14 d各取10只小鼠,心脏采血制备血清,然后处死取整块腓肠肌.伤后10d,3组分别另取6只小鼠处死后取整块趾短屈肌.伤后5、10、14d,3组分别另取9只小鼠处死后取整块腓肠肌.称取整块小鼠腓肠肌质量,考马斯亮蓝法检测小鼠腓肠肌总蛋白含量;双光子激光肌膜打孔检测小鼠趾短屈肌肌膜修复功能;放射免疫分析检测小鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-d)和白细胞介素6(IL-6)含量;采用非还原性电泳-蛋白质印迹法检测小鼠腓肠肌中MG53二聚体及单体表达,蛋白质印迹法检测小鼠腓肠肌中内质网应激标志蛋白CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)蛋白表达.(2)细胞实验.体外培养小鼠骨骼肌前体细胞C2C12,选第2代细胞进行实验.将细胞分为正常对照组、烧伤血清组、烧伤血清+谷氨酰胺组,每组3皿,每皿1×103个细胞,正常对照组细胞加入1 mL含有体积分数10％胎牛血清的DMEM培养液,烧伤血清组细胞加入1 mL含有体积分数10％烧伤血清的DMEM培养液,烧伤血清+谷氨酰胺组细胞加入1 mL含有体积分数10％烧伤血清及4μL终物质的量浓度为8 mmol/L的谷氨酰胺的DMEM培养液.培养24 h后,同前检测小鼠骨骼肌前体细胞分化后肌细胞膜修复功能.另取细胞同前分组及培养,每组3孔,每孔1 ×105个细胞,培养24 h后同前检测细胞中MG53二聚体及单体表达及细胞中内质网应激标志蛋白表达.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验、SNK检验. 结果 动物实验.(1)与假伤组比较,烧伤组伤后5、10、14 d小鼠腓肠肌质量和总蛋白含量均明显降低(P＜0.05);与烧伤组比较,烧伤+谷氨酰胺组伤后5、10、14 d小鼠腓肠肌质量和总蛋白含量均明显增加(P＜0.05).(2)与假伤组的0.9±0.4比较,烧伤组伤后10 d小鼠肌纤维内FM 1-43荧光强度(7.8±0.4)明显升高(t=7.75,P＜0.05);与烧伤组比较,烧伤+谷氨酰胺组伤后10 d小鼠肌纤维内FM1-43荧光强度(4.0±0.4)明显降低(t=-4.31,P ＜0.05).(3)与假伤组比较,烧伤组伤后5、10、14d小鼠血清TNF-α、IL-6含量均明显增加(P＜0.05);与烧伤组比较,烧伤+谷氨酰胺组伤后5、10、14 d小鼠血清TNF-α、IL-6含量均明显减少(P＜0.05).(4)与假伤组(56.97±2.82、44.89±4.72、42.46±1.06,14.26±0.99、62.36±2.74、29.45±0.84)比较,烧伤组伤后5、10、14 d小鼠腓肠肌中MG53二聚体和单体表达均明显降低(6.16±0.25、26.09±1.22、28.86±1.53,5.63 ±0.25、26.74 ±0.79、4.41 ±0.52,P＜0.05);与烧伤组比较,烧伤+谷氨酰胺组伤后10、14d小鼠腓肠肌中MG53二聚体表达(36.79±1.44、43.96±1.62)和伤后14d小鼠腓肠肌中MG53单体表达明显升高(13.16±2.17,P＜0.05).与假伤组比较,烧伤组伤后5、10、14 d小鼠腓肠肌中CHOP、GRP78蛋白表达明显升高(P＜0.05);与烧伤组比较,烧伤+谷氨酰胺组伤后5、10 d小鼠腓肠肌中CHOP、GRP78蛋白表达均明显降低(P＜0.05).细胞实验.(1)与正常对照组的1.76 ±0.25比较,烧伤血清组培养24 h细胞FM1-43荧光强度(9.46±1.22)明显升高(t=12.28,P＜0.05);与烧伤血清组比较,烧伤血清+谷氨酰胺组培养24 h细胞FM1-43荧光强度(4.71±0.45)明显降低(t=-7.59,P＜0.05).(2)正常对照组、烧伤血清组、烧伤血清+谷氨酰胺组细胞培养24 h MG53单体表达相近(P＞0.05).与正常对照组(58.5±1.8)比较,烧伤血清组培养24 h细胞MG53二聚体表达明显降低(14.1 ±1.4,P＜0.05),与烧伤血清组比较,烧伤血清+谷氨酰胺组培养24 h细胞MG53二聚体表达明显升高(30.9±0.6,P＜0.05).与正常对照组比较,烧伤血清组培养24 h细胞CHOP、GRP78蛋白表达明显升高(P＜0.05);与烧伤血清组比较,烧伤血清+谷氨酰胺组培养24 h细胞CHOP、GRP78蛋白表达明显降低(P＜0.05). 结论 谷氨酰胺能通过减轻严重烧伤小鼠内质网应激促进MG53二聚化,加速骨骼肌膜修复,减轻骨骼肌局部炎症反应,减少骨骼肌消耗.

以有机质含量仅为0.65％的低碳冲积沙土为栽培基质,以当年生山定子幼苗为试材,分别添加与土壤本体微生物生物量碳(MBC)等量的碳量(2 g·kg-1)、5倍MBC碳量(10 g·kg-1)的葡萄糖,以不添加葡萄糖为对照,处理后0～30 d内定期采集根系样品,研究外源葡萄糖对低碳土壤中山定子幼苗生长、根系构型及氮素代谢的影响.结果表明:5倍MBC碳源处理后山定子幼苗的株高、总生物量、总根长和根表面积分别显著增加12.3％、26.4％、23.2％和14.6％,而茎粗、根体积和平均直径无显著变化.等量及5倍MBC碳源处理均显著提高了山定子的根系活力,分别在第3和15天达到峰值,高于对照119.1％和75.7％.在整个处理期间,等量及5倍MBC碳源处理显著增加了根中NO3-、NO2-和NH4+含量;整体上,等量及5倍MBC碳源处理均显著增强根系中硝酸还原酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸合酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性,其中5倍MBC处理的作用最显著.5倍MBC的外源葡萄糖浓度更有利于促进低碳土壤中山定子根系中氮素的吸收代谢过程,诱导植株生长、干物质积累和根系构型改变.

目的:调查某院消化道恶性肿瘤患者围手术期全肠外营养(TPN)的临床应用情况,为临床合理用药提供参考.方法:采用回顾性调查的方法,对2018年1月至2018年7月某院收治的96例消化道恶性肿瘤患者围手术期TPN处方情况进行统计与适宜性分析.结果:96例消化道恶性肿瘤患者以老年人为主,胃癌占57.3％;围手术期共接受TPN治疗918例次,以术后营养支持为主,平均疗程(9.6±4.2)d.TPN处方平均热量供给为(21.1±4.4)kcal·kg-1·d-1,39.5％的处方热量低于20 kcal·kg-1·d-1;糖脂供能比为1±0.4,41.6％的处方糖脂比小于1;氨基酸平均用量为(1.3±0.4)g·kg-1·d-1,84.4％的处方热氮比为80～150:1;丙氨酰谷氨酰胺的使用率为81.3％,有41.7％的处方使用比例超过20％.肠外营养液的渗透压、氨基酸浓度、葡萄糖浓度及一价和二价阳离子达标率分别为95.8％、92.7％、96.8％及94.8％和95.9％.结论:该院消化道恶性肿瘤围手术期营养支持以术后为主,缺乏术前个体化营养风险评估和营养支持;围手术期TPN处方基本合理,部分处方存在热量/蛋白供给不足、脂肪乳供能占比较高、热氮比不适宜、电解质与药物浓度超标的现象.临床营养支持是一项多学科参与的工作,临床药师应积极协助医师,制定个体化的营养支持方案,提升临床营养治疗的安全性和有效性.