[目的]结合数据挖掘及网络药理学,探讨运脾法治疗儿童功能性便秘的用药规律及作用机制.[方法]收集562例功能性便秘患儿病案,采用SPSS Statistic 24.0软件进行聚类分析,SPSS Modeler 18.0软件进行关联规则分析,Liquorice软件进行复杂网络分析,得出核心方药.运用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)、中药分子机制 生物信息学分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine,BATMAN-TCM)数据库筛选核心方活性成分及靶点,通过基因组注释数据平台(Genome Annotation Database Platform,GeneCards)数据库筛选功能性便秘相关靶点,取交集后获得预测靶标.基于蛋白质基因相互作用分析(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins,STRING)数据库构建靶基因蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI),利用Cytoscape 3.8.0软件建立核心方成分-便秘-靶点网络图,借助Network Analyzer工具进行拓扑分析,确定核心靶点.基于STRING数据库,使用R语言4.2.2进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析.[结果]所纳病案包含1 121诊次方药记录,各疗程的症状改善率在86％～97％,便秘三大主症的改善率均在90％左右.涉及中药119味,药性以寒、平为主,药味以苦、甘居多,归经多属胃、脾.通过药物关联、聚类和复杂网络分析得到9味药物构成的核心组方.核心组方调治便秘的主要活性成分为槲皮素、甲基庚烯酮、胆汁三烯、烟酸、木犀草素、山柰酚、汉黄芩素.关键靶点包括前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、V-Jun肉瘤病毒17癌基因同源物(V-Jun sarcoma virus 17 oncogene homolog,JUN)、蛋白激酶B1(protein kinase B1,AKT1)、磷酸肌醇-3-激酶调节亚基 1(phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1,PIK3R1)、磷脂酰肌醇-3-激酶 α 催化亚基(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-3-kinase catalytic subunit alpha isoform,PIK3CA).对炎症相关通路如磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)的调节可能是核心组方改善便秘的作用机制.[结论]运脾法治疗小儿便秘核心方包括麸炒枳实、厚朴、生白术、鸡内金、焦山楂、连翘、决明子、火麻仁、胡黄连,其主要成分可能通过影响炎症因子水平、修复肠道黏膜以恢复肠道平滑肌功能,改善便秘症状,对运脾法的临床应用及儿童功能性便秘的中医药治疗有一定借鉴意义.

微RNA(microRNAs,miRNAs)是一种与肿瘤等多种疾病的发生发展密切相关的短序列非编码RNA,其具有丰度低、序列同源性高和易降解等特点,因此,miRNAs的高灵敏、高特异检测面临巨大挑战.具有RNA切割活性的脱氧核酶是新兴的一类功能性单链DNA分子,此类酶能在金属离子的辅助下对核酸底物特异性切割,释放miRNA进行循环再利用,实现信号放大.目前,基于脱氧核酶催化放大检测miRNA的新方法研究是近年来科研人员的重点关注方向之一.本文根据脱氧核酶结合不同的生物传感新技术和新材料,对近年来发展出的基于脱氧核酶催化放大检测miR-NAs 的新方法进行分类与回顾,归纳为脱氧核酶DNA自组装、脱氧核酶偶联等温扩增以及脱氧核酶结合新型纳米材料的3类方向,并逐一阐述各个方向的基本原理及其在生物传感领域、医学检测方向的最新研究进展与应用实例,旨在为进一步的精准灵敏检测miRNAs新策略研究提供参考.

聚合度 2?6 的可溶性纤维寡糖是一种具有多种生物功能的低聚糖,它能够促进双歧杆菌(Bifidobacteria)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracei)等肠道益生菌的增殖,因此对人体肠道微生态具有调节作用.本研究通过在大肠杆菌中表达纤维寡糖磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase,CDP),构建Cc 01 菌株,并与之前构建的COS 01 菌株联合使用,建立了基于COS 01、Cc 01 的三酶级联反应催化底物葡萄糖和蔗糖合成纤维寡糖反应体系.经过优化后,最终可溶性纤维寡糖的产量达到97 g/L,纯度约为 97%,其中含有纤维二糖(16.8 wt%)、纤维三糖(49.8 wt%)、纤维四糖(16.4 wt%)、纤维五糖(11.5 wt%)和纤维六糖(5.5 wt%).在纤维寡糖对益生菌株生长促进作用的测试中,以菊粉、低聚木糖、低聚果糖为基准,干酪乳杆菌(WSH 004)、副干酪乳杆菌(WSH 005)以及嗜酸乳杆菌(WSH 006)利用纤维寡糖(聚合度2?6)为碳源进行生长后,益生菌的生物量(OD600)相比对照增加约 2 倍.该研究证明了三酶级联反应能够高效合成纤维寡糖,并表明聚合度 2?6 的纤维寡糖是一类具有促进肠道微生物增殖的功能性碳水化合物.

木质纤维素是地球上储藏量最为丰富的可再生生物资源.将木质纤维素酶解成寡糖或单糖是生物质利用的关键.然而,传统的糖苷水解酶很难对其进行有效降解.溶解性多糖单加氧酶是一种全新的生物质降解酶,丰富了生物质降解的模式.它以氧化方式作用于糖链,产生更多的还原端以便糖苷水解酶能进一步进行催化.本文综述了LPMO的发现历史、分类、作用机制与活性测定方法,并讨论了LPMO在饲料添加剂、功能性食品与生物能源等领域的应用前景.

目的 分析两种方法制备C群脑膜炎球菌多糖CRM197蛋白结合物的主要生物学特性,并对比其热稳定性和免疫原性,选择适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法.方法 采用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化C群多糖,经己二酸二酰肼(ADH)衍生后,在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDAC)的催化作用下与CRM197共价结合,获得结合物CPS_CDAPAH-CRM197;将C群多糖不经活化直接通过ADH衍生后,在EDAC的催化下与CRM197共价结合,获得结合物CPS_EDACAH-CRM197.对两种方法制备结合物的多糖含量、游离多糖含量、蛋白含量及多糖衍生度等生化指标进行测定,并计算多糖利用率;将结合物分别于37℃放置2周、3周,20～25℃放置4周和8周后取样,测定游离多糖含量;将两种方法制备的结合物免疫小鼠后,检测小鼠血清中C群多糖IgG抗体水平;体外杀菌试验评价结合物的功能性杀菌抗体水平.结果 结合物CPS_CDAPaH-CRM197的多糖衍生度较低,游离多糖含量较高,平均多糖利用率为12.2％,于37及22～25℃温度下保存稳定性较差;结合物CPS_EDACAH-CRM197的多糖利用率比前者高近2倍,游离多糖含量较低,在37和22 ～ 25℃温度下保存均表现出良好的热稳定性(游离多糖含量均未超过5％).CPS_EDACAH-CRM197组小鼠血清IgG抗体水平显著高于CPS_CDAPAH-CRM197组(P＜0.05),但两者诱导的杀菌抗体水平相当(P＞0.05).结论 C群多糖不经活化直接与蛋白结合的方法更适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备.

植物三萜是一大类结构多样、具有广泛工业及药用价值的天然产物.齐墩果烷型三萜因拥有良好的药理/生物活性而被广泛熟知,其生物合成历经了前体供应、骨架合成、萜类合成等3个阶段.在齐墩果烷型三萜骨架糖基化之前,细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase,P450s)会先行对该骨架进行许多结构修饰,而这些修饰对三萜骨架的结构多样性与功能性至关重要.本文综述了齐墩果烷型三萜皂苷生物合成中P450s对β-香树脂醇(β-amyrin)、齐墩果酸(oleanolic acid)的催化作用,探讨了远志皂苷的主要苷元母核——原远志皂苷元的可能生物合成途径,并简要概述了远志(Polygala tenuifolia)中CYP716A249的发现,为齐墩果烷型植物三萜的生物合成途径解析提供一些借鉴.

旨在获得具有氯化功能的过水解酶,拓展过水解酶资源,为其工业应用奠定基础.以唐河某造纸厂污泥为材料构建宏基因组文库,通过活性筛选获得一个细菌过水解酶Per822.使用大肠杆菌异源表达Per822,研究纯化后的重组蛋白酶学性质并检测了生成过乙酸的能力.测序结果显示per822编码一个含273个氨基酸的蛋白.Per822是典型的多功能酶代表,分别具有过氧化物酶、卤代酶和酯酶的活性.Per822过水解氯化单氯二甲酮的最适反应pH为4.5,在pH 3.5-8.0范围内酶活性稳定.最适反应温度是55℃,在70℃以下酶活性稳定且氯化活性能够被Fe2+激活.以乙酸乙酯为共底物Per822显示出较强的产过乙酸能力.重组Per822的高可溶性表达、催化多功能性、较强的产过乙酸能力使得Per822在有机合成、废水处理、杀菌、生物质预处理等方面有着潜在的应用价值.

目的 研究染色质重构复合物核心催化亚基(Brahma-related gene 1,Brg1)对C57BL/6小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞数量和功能的影响及其可能的机制.方法 取6 ～ 8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(Wild type,WT)及Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cellⅡ,AECⅡs)上特异性敲除Brgl的C57BL/6小鼠(Brg1fl/fl)作为实验对象,每组选取8只小鼠,收取标本,利用免疫组化及免疫荧光分析肺组织中表面活性物质相关蛋白C(surfactant-associated protein C,SFTPC)阳性的细胞率,流式细胞术分析小鼠肺组织中表面活性物质蛋白C前体蛋白(prosurfactant protein C,pro SP-C)阳性的细胞(即AECⅡs)数量.Western blot检测各组小鼠肺组织中pro SP-C、SFTPC、表面活性物质相关蛋白A(surfactant-associated protein A,SFTPA)、表面活性物质相关蛋白D(surfactant-associated protein D,SFTPD)的表达水平.Western blot检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达及增殖相关信号转导途径中关键蛋白EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT及NF-κB p65的活化水平.结果 抗SFTPC免疫组化、免疫荧光显示其在肺泡上皮表达较WT小鼠增多(P＜0.05);流式细胞术显示Brg1 dl/dl组小鼠肺组织中pro SP-C+的细胞百分比较WT小鼠明显增高(P＜0.05),Western blot检测结果显示AECⅡs的功能性蛋白pro SP-C、SFTPC、SFTPA及SFTPD在Brg1 fl/fl小鼠中明显增多;Brg1fl/fl组小鼠肺组织中NF-κB p65及周期蛋白CyclinD1的表达增加,且p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT百分比显著提高,且差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 特异性敲除C57BL/6小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中的Brg1可促使AECⅡs数量和分泌功能的增加,其可能机制与敲除Brg1促进EGFR/PI3K/AKT/NF-κB信号通路的激活,且与增殖周期蛋白CyclinD1表达的增加有关.

旨在获得具有抗原性和免疫原性的融合蛋白CbXyn10C-SS,并对其进行高效表达和酶学性质分析.生长抑素(Somatostatin,SS)从多途径阻碍饲料转化效率和动物生长,使用SS免疫动物可避免其抑制作用.然而SS免疫的研究多以DNA疫苗为载体,少见重组功能性SS蛋白的高效制备方法.木聚糖酶提高饲料转化率并在饲料中广泛应用,且微生物法发酵制备重组木聚糖酶技术已经非常成熟.将SS基因连接在细菌Caldicellulosiruptor bescii来源的耐热木聚糖酶基因CbXyn10C的3'端进行融合表达.融合蛋白CbXyn10C-SS具有抗原性和免疫原性,且该蛋白的理化性质和催化常数与CbXyn10C非常相似,具高度的热稳定性和较强的催化性能,适合饲料制粒.成功高效表达了能同时作为饲用木聚糖酶和生长抑素抗原的融合蛋白CbXyn10C-SS.

铁死亡是一种铁依赖性活性氧异常堆积而导致氧化还原平稳失调的细胞死亡方式.作为一种新的癌症治疗途径,铁死亡引起了研究者的广泛关注.随着纳米科学的迅速发展,多样化的功能性纳米材料能够发挥生成过氧化氢,清除谷胱甘肽,以及提供芬顿反应催化剂等作用,因此能够协同所负载的铁死亡诱导药物而发挥出更加强大的肿瘤抑制作用.本文首先介绍了铁死亡的发生机制及铁死亡诱导策略在肿瘤治疗中的可行性.其次,概述了铁死亡诱导型纳米药物的构建思路,主要包括:加速细胞内芬顿反应、抑制谷胱甘肽过氧化物酶4的活性及增加脂质过氧化物的外源递送.此外,本文还总结了基于铁死亡的联合疗法,包括与传统疗法的联合治疗(联合凋亡诱导药物、免疫治疗与基因治疗)以及体外能量协同诱导铁死亡治疗(包括超声治疗及光动力治疗).最后,本文讨论了未来诱导铁死亡纳米药物在癌症治疗中的期望和挑战.