目的 构建人源自噬微管相关蛋白轻链3A(microtubule-autophagy-related protein 1 light chain 3 A,mRFP-C1-LC3A)过表达质粒,并观察其在氯化钴(CoCl2)诱导的大鼠心肌细胞(H9C2细胞)缺氧模型中表达及抗凋亡机制.方法 利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术以cDNA文库为模板克隆人源轻链3A(light chain 3A,LC3A)基因,构建mRFP-C1-LC3A过表达质粒.通过0.8 mmol/L CoCl2 处理H9C2细胞,构建大鼠心肌细胞缺氧模型.应用Western-blot以及荧光成像技术检测细胞缺氧模型中的线粒体自噬水平的变化.通过Western-blot检测H9C2细胞缺氧模型中线粒体自噬水平不同对凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl2)、胱天蛋白酶3(caspase-3)表达的影响.结果 质粒酶切、测序结果及Western-blot实验证明mRFP-C1-LC3A真核表达载体构建成功.Western-blot结果表明经 0.8 mmol/L CoCl2 处理H9C2 细胞后,细胞内低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF1α)蛋白表达上调、Hoechst/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色证实心肌细胞凋亡比例增加,缺氧模型构建成功(P<0.05).结合Western-blot以及荧光成像结果显示在H9C2细胞缺氧模型中线粒体自噬水平明显升高(P<0.05).通过巴佛洛霉素A1(BafA1)抑制线粒体自噬后,凋亡相关蛋白Bcl2表达下降、活化caspase-3表达升高,表明抑制线粒体自噬后,细胞凋亡水平进一步升高(P<0.05),Hoechst染色进一步明确结论.结论 成功构建人源LC3相关表达载体,并证实线粒体自噬可以抑制心肌细胞缺氧模型中的细胞凋亡.

目的:利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)特异性结合的核酸适配子(apt)，探讨apt与BMSCs的结合方式及能力。方法:利用SELEX技术，以大鼠BMSCs为靶点，从构建的核酸文库中反复筛选、克隆、测序及分析，获得候选apt。流式细胞术测定和软件分析获得不同浓度(0、4、8、16、32、64、128、256 nmol/L)候选apt与BMSCs的结合曲线及平衡解离常数。胰酶消化实验探究apt与BMSCs结合的靶点，并观察apt体外捕获BMSCs的能力。结果:流式细胞术与荧光共聚焦实验表明SELEX筛选第9轮文库与BMSCs结合能力最高。经序列分析适配子apt7与BMSCs的亲和力最高，平衡解离常数为(11.79±0.72) nmol/L。胰酶消化实验表明当胰酶消化细胞时间超过10 min后，apt7与BMSCs的亲和力下降甚至消失。体外捕获实验表明固定于培养皿上面的apt7能体外捕获骨髓细胞液中的大鼠BMSCs。结论:本研究通过SELEX技术成功分离出能高亲和力、高特异性结合大鼠BMSCs的特异性适配子apt7，为进一步将适配子应用于组织工程支架表面招募循环干细胞研究提供了实验依据。

目的:制备人乳头瘤病毒6型L1(HPV6 L1)蛋白特异性单克隆抗体，探索抗体的结合特点、交叉活性以及中和效果。方法:从免疫HPV6 L1蛋白小鼠脾细胞中提取抗体基因，构建ScFv噬菌体抗体文库。用HPV6 L1蛋白对文库进行富集筛选，将获得的抗体基因表达成鼠IgG后，验证抗体与L1蛋白的结合性质以及对假病毒的中和效果。结果:成功构建了针对HPV6 L1的ScFv抗体文库，库容量为6.54×10 7。抗体文库经HPV6 L1筛选后获得了两株抗体，命名为Q9和Q11。经ELISA检测，Q9-IgG与HPV6 L1反应的滴度约为10 6，与HPV18和45 L1的滴度为10 2。Q11-IgG与HPV6 L1结合的滴度约为4×10 4，而与其他型别L1均不结合。经过假病毒中和试验测定，Q9-IgG没有中和活性，而Q11-IgG针对HVP6假病毒的中和滴度约为10 4.5。 结论:Q9和Q11均为HPV6 L1特异性单克隆抗体，但二者交叉反应性、抗原识别位点及中和活性均具有明显差异。该抗体可为HPV6病毒的基础研究、免疫学诊断以及治疗制剂研发提供工具抗体。

目的:制备能与VirB12抗原高亲和力结合的新疆双峰驼纳米抗体，为后续研究奠定基础。方法:采用VirB12重组蛋白6次免疫新疆双峰驼，从外周血中分离得到淋巴细胞后提取总RNA，通过巢式PCR扩增VHH基因片段构建噬菌体VHH展示文库。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）固相亲和富集方法进行筛选。进行3轮亲和筛选后随机挑取出第2、3轮富集的克隆，ELISA分析可溶性表达的纳米抗体与VirB12蛋白的结合情况。经过序列测定和多重比对去除重复序列，最后得到个5非冗余序列，分别命名为D1、E6、H8、H9和H10。将筛选鉴定的5个纳米抗体基因转化WK6菌株，在16 ℃下进行胞间质可溶性表达，经Ni亲和柱纯化表达后，Western Blot和ELISA法检测纳米抗体与VirB12抗原的结合能力与热稳定性。结果:经VirB12蛋白免疫后的血清抗体效价最少为1∶24 000。从VirB12抗原免疫的新疆双峰驼淋巴细胞中获得了滴度为2.8×10 8 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库。5株纳米抗体在WK6菌中以可溶形式表达。结果表明，5株抗VirB12纳米抗体质量分数接近90%，且具有较高的抗原结合活性与明显的抗原-抗体浓度相关性；4株纳米抗体均表现出较高的热稳定性，在90 ℃处理后，仍能保留60%以上的结合活性。 结论:通过固相筛选富集和可溶性单克隆检测鉴定获得了5株具有较高亲和力和热稳定性的抗VirB12纳米抗体，为VirB12纳米抗体的进一步开发奠定了基础。

目的:运用克隆文库法分析原发性尿道炎和非特发性尿道炎男性患者第一尿中的细菌菌群分布情况。方法:收集2019年1月至2020年6月于本院就诊的64份尿道炎男性患者(原发性尿道炎和非特发性尿道炎)第一尿的尿液标本，根据基于16S核糖体RNA基因的克隆文库方法分析细菌菌群分布情况。此外，通过常规PCR方法检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、生殖支原体、人支原体、解脲支原体或细小脲原体的菌群情况。结果:64份尿液标本中，42份通过克隆文库方法成功分析出结果；评估了2 781个克隆，并检测到95种细菌系统发育型。微生物系统发育型的克隆文库法检测结果：从6个标本中检测到淋病奈瑟菌，并且是5个标本中的主要细菌种类；从5个标本中检测到生殖器分枝杆菌，并且是3个标本中的优势菌种；从2个标本中检测到解脲支原体；分别在8个和1个标本中分别检测到流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌；在10个样本中检测到阴道加德纳菌。常规PCR中TMA方法从15个标本中检测到沙眼衣原体；在8个样本中检测到淋病奈瑟菌，且是5个标本中的优势菌种，在2个样本中占据100%的菌群。常规PCR中TaqMan法在12个样本中检测到生殖器分枝杆菌，且在2个样本中占据50%以上菌群；在1个样本中检测到淋病奈瑟菌，占比100%。结论:克隆文库法可检测菌群中各菌种的占有率，可成为男性尿道炎细菌分析的新方法。

目的:构建自发性早产产妇胎盘与足月产妇胎盘差异表达基因cDNA文库，初步分析自发性早产可能的分子机制。方法:选取50例足月健康产妇胎盘和50例自发性早产产妇胎盘组织，提取胎盘组织总RNA，采用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)技术构建相应的cDNA差减文库，进行克隆测序，所得结果通过Blast软件与Genbank中的已知核苷酸序列进行查询和同源性比对，分析可能和早产发生相关的分子机制。结果:从正向及反向文库中随机挑选出200个克隆，进一步筛选出80个差异表达基因片段。生物信息学方法分析显示，两组差异表达基因功能涉及先天免疫、炎症、激素调节、营养代谢、应激及凋亡等方面。结论:早产产妇胎盘组织中存在与先天免疫、炎症、激素调节、营养代谢、应激及凋亡等相关的基因表达变化，其中 GGT2基因很可能是1个新的导致自发性早产发生的基因，其具体调控机制有待进一步深入研究。

目的:探讨大动脉炎患者T细胞受体库的多样性，并分析T细胞受体β链基因表达及V、J基因重排的分布特点。方法:采取8例大动脉炎患者和4名健康对照者的外周血，构建文库后，用Illumina Hiseq X10测序仪进行高通量测序。生物信息学分析所得序列，并与参考序列进行比对，统计V/D/J基因的频率信息，提取互补决定区（CDR）区域序列。评估免疫组库的多样性，进行样本间及样本内对比分析和聚类分析。应用R语言统计学软件分析数据。采用Mann-Whitney U检验。 结果:大动脉炎组和健康对照组β链第三互补决定区（CDR3）的D50指数和香农熵差异均无统计学意义。大动脉炎组和健康对照组的高频率克隆差异均无统计学意义。2组共有21个基因重排片段存在差异。其中TRBV15-TRBJ2-3[0.31（0.27，0.70）]、TRBV26-TRBJ2-6[0.30（0.23，0.57）]、TRBV28-TRBJ1-4[179（139，412）]，TRBV28-TRBJ1-6[362（253，419）]等14个V/J基因重排片段在患者组中表达显著高于对照组（ Z值分别为2.65，2.08，2.27，2.27，2.27，2.08，2.65，2.08，2.27，2.27，2.08，2.08，2.46，2.22， P值均<0.05）；而TRBV10-1-TRBJ1-2[7.49（4.9，12.1）]、TRBV29-1-TRBJ2-2[10.5（4.0，12.8）]，TRBV-4-2-TRBJ2-6[3.31（1.8，5.8）]等7个V/J基因重排片段在患者组中表达显著低于对照组（ Z值分别为-2.08，-2.27，-2.08，-2.08，-2.27，-2.08，-2.29， P值均<0.05）。 结论:虽然大动脉炎患者外周血T细胞受体库无显著降低的多样性，但大动脉炎患者T细胞受体β链V、J基因表达存在差异，并且有独特的V/J重排亚家族。

背景 肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)的靶向治疗可显著改善晚期ccRCC患者的预后,寻找新的治疗靶标可为开发新型治疗药物提供依据.目的 构建真核表达载体pcDNA3.0-Flag-CHMP4A.在体外细胞实验中检测CHMP4A对ccRCC 786-O细胞增殖和迁移的影响,分析CHMP4A在ccRCC中的表达及对ccRCC患者预后的影响.方法 利用PCR技术从乳腺文库中扩增目的基因CHMP4A,通过同源重组将CHMP4A与载体pcDNA3.0连接.786-O细胞转染 pcDNA3.0-Flag-CHMP4A后,Western blot方法检测 CHMP4A的蛋白表达,CCK-8、克隆形成及划痕实验检测CHMP4A对 786-O细胞增殖和侵袭的影响.检索TCGA数据库中ccRCC转录组数据,分析CHMP4A在肿瘤不同分期、分级和淋巴细胞转移组中的表达,应用Kaplan-Meier法分析CHMP4A表达与ccRCC预后的关系.结果 成功构建了pcDNA3.0-Flag-CHMP4A真核表达载体,并在 786-O细胞中成功表达,体外实验发现Flag-CHMP4A可抑制ccRCC 786-O细胞的增殖和迁移(P＜0.05);TCGA数据库显示,CHMP4A是mRNA表达水平与ccRCC患者的分期、分级及淋巴结转移强相关(P＜0.01).CHMP4A高表达组有较长的无病生存期和总生存期(P＜0.01).结论 CHMP4A在抑制肿瘤细胞增殖和迁移中发挥了重要作用,其表达与ccRCC患者的预后呈正相关.本研究为ccRCC的治疗提供了潜在靶标.

新麦草(Psathyrostachys juncea)被认为是赖草属植物的一个重要祖先物种.对新麦草中高度重复序列Cot-1 DNA文库克隆测序分析鉴定,结果表明新麦草Cot-1 DNA文库中的序列可以分为6种类型:反转座子、转座子、卫星DNA、抗病相关LZ-NBS-LRR、未能鉴定类型、反转座子LTR和LTR/Copia类型序列组合型,占比分别为49.5％、1.0％、28.7％、5.9％、13.9％和1.0％.进一步利用2种卫星DNA序列和5个反转座子序列为探针,对新麦草、赖草(Leymus secalinus)和 2个大赖草(L.racemosus)材料进行染色体荧光原位杂交,结果表明卫星DNA序列TaiI-family和pSc250-family杂交信号主要分布在染色体的端部,TaiI-family杂交信号数量分别为20、16、7和18,而卫星DNA序列pSc250-family在新麦草、赖草中的杂交信号数量分别为17和24,在2个大赖草材料均没有信号检出.反转座子序列在3个物种染色体上基本呈散布分布方式,而且在赖草属物种染色体分布呈现同质化倾向,其中克隆序列pPj-44和pPj-28在新麦草和赖草属物种间信号分布差异显著,分别提示在异源多倍化过程中存在序列扩张和收缩,克隆序列pPj-77仅在1个大赖草材料10个染色体杂交信号强度区别于其余染色体.研究结果表明,新麦草重复序列在赖草多倍体形成过程发生了快速进化并可能存在同质化扩散,同时赖草属不同物种基因组间重复序列组成可能存在显著差异.

为探究胰岛素样促雄性腺激素(Insulin-like androgenic hormone,IAG)在甲壳动物性别分化过程作用的分子调控途径,挖掘与IAG蛋白存在互作关系的候选蛋白信息,研究使用红螯螯虾促雄性腺及输精管组织构建核体系酵母文库,利用酵母双杂交技术筛选与IAG互作的候选蛋白,并对关键候选蛋白的编码基因进行克隆与表达分析.获得初级文库容量为1.12×107,次级文库容量为1.28×107;成功筛选到25个阳性克隆,共注释到12个蛋白编码基因;克隆获得关键候选蛋白的编码基因muc5acl(Mucin-5AC-like)的CDS全长474 bp;半定量与荧光定量表达结果表明,muc5acl在红螯螯虾的促雄性腺、精巢及输精管中特异表达,且在雄性个体促雄性腺中的表达水平显著高于间性,在输精管中的表达则相反,推测该基因可能参与雄性激素的分泌及精子运输过程,并与间性红螯螯虾的性腺发育有关.研究结果将为进一步解析IAG调控红螯螯虾间性性别形成的分子机制提供重要信息.