目的:建立一种基于高效液相色谱串联质谱技术的测定大鼠血浆中伐地那非浓度的方法，并评估其可行性。方法:采集正常Sprague-Dawley大鼠血浆样本。采用Phenomenex Synergi Polar-RP 80 A色谱柱（2.0 mm×50 mm，4 μm），柱温30 ℃，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，流速为0.4 ml/min；质谱采用API 4000Qtrap三重四极杆质谱仪的正离子多反应监测模式监测，伐地那非和内标监测离子质荷比分别为489.3（Q1通道）/151.2（Q3通道）和466.4（Q1通道）/234.2（Q3通道）；西沙必利为内标，检测大鼠血浆中添加的伐地那非浓度。然后评估该方法检测伐地那非浓度的专属性、线性及定量范围、精密度和准确度、基质效应、稳定性。结果:在选定的色谱和质谱条件下，伐地那非和内标的保留时间分别为2.62和2.80 min，峰形良好。该方法在0.2~200 ng/ml浓度范围内线性良好。该方法检测伐地那非的批内精密度（%CV）和准确度（%DEV）分别在1.5%~9.7%和-6.8%~6.6%之间。批间精密度和准确度分别在3.1%~8.4%和-3.7%~4.6%之间。均在要求的范围内。本样品处理方法，伐地那非的提取回收率在88.2%~104.6%之间，符合提取回收率的考察要求。该样品处理方法，伐地那非各质控浓度经内标归一化的基质效应因子（MF）分别为1.04、0.85、1.04，变异系数（%CV）在1.7%~10.7%之间，符合基质效应的考察要求。伐地那非的短期稳定性、长期稳定性、4次冻融循环稳定性的偏差都在±15%以内，变异系数均在5%以内。结论:本研究建立的高效液相色谱串联质谱法特异性好、准确性高，可用于检测大鼠血浆伐地那非浓度。

目的:探讨水溶性壳聚糖水凝胶对糖尿病小鼠感染全层皮肤缺损创面的作用及其机制。方法:采用实验研究方法。采用循环冻融的方法制备由聚乙烯醇和明胶组成的对照水凝胶及由前述2种材料+水溶性壳聚糖组成的水溶性壳聚糖水凝胶。大体观察第1次冻融前后试管中2种敷料流动性，并比较12孔板中2种敷料最终形态的外观差异。取细胞株L929和HaCaT，均分别按照随机数字表法（分组方法下同）分为对照水凝胶组和水溶性壳聚糖水凝胶组，分别加入相应敷料培养24 h，采用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖活力。取兔血红细胞悬液，分为生理盐水组、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）组、对照水凝胶组和水溶性壳聚糖水凝胶组，分别作相应处理后孵育1 h，采用酶标仪检测红细胞的溶血程度。取24只11~14周龄雌性db/db小鼠，在其背部制作全层皮肤缺损创面并在创面处滴加耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）液，72 h后将小鼠分为空白对照组、磺胺嘧啶银水胶组、对照水凝胶组、水溶性壳聚糖水凝胶组，分别作相应处理。伤后0（即刻）、7、14、21 d，大体观察创面愈合情况并计算伤后14、21 d创面愈合率；伤后14 d，检测创面中MRSA浓度；伤后21 d，采用苏木精-伊红染色法对创面进行组织学分析，采用免疫荧光法检测创面中细胞CD31表达并计算其阳性百分率。取Raw264.7细胞，分为进行相应处理的白细胞介素4（IL-4）组、空白对照组、对照水凝胶组、水溶性壳聚糖水凝胶组，培养48 h，采用流式细胞仪检测细胞中CD206阳性细胞百分率。样本数均为3。对数据行独立样本 t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、LSD检验及 Dunnett T3检验。 结果:试管中2种敷料在进行冻融前都具有一定的流动性，冻融1次后均形成半固态凝胶。12孔板中2种敷料最终形态均基本呈稳定的半透明片状，透明度差异不大。培养24 h，水溶性壳聚糖水凝胶组L929和HaCaT的细胞增殖活力均明显高于对照水凝胶组（ t值分别为6.37、7.50， P<0.01）。孵育1 h，水溶性壳聚糖水凝胶组红细胞溶血程度明显低于Triton X-100组（ P<0.01），而与生理盐水组及对照水凝胶组均相近（ P>0.05）。伤后0 d，4组小鼠创面情况相似。伤后7 d，空白对照组与对照水凝胶组创面内部淡黄色渗出物较多，磺胺嘧啶银水胶组与水溶性壳聚糖水凝胶组创面观察到少量渗出。伤后14 d，空白对照组与对照水凝胶组创面干燥结痂，无明显上皮覆盖；磺胺嘧啶银水胶组创面痂皮脱落，可见脓性渗出物；水溶性壳聚糖水凝胶组创面基底呈淡红色，创面可观察到明显上皮覆盖。伤后14 d，水溶性壳聚糖水凝胶组创面愈合率显著高于其他3组（ P值均<0.01）。伤后21 d，水溶性壳聚糖水凝胶组创面已完全闭合，其他3组创面均未完全愈合；水溶性壳聚糖水凝胶组创面愈合率显著高于其他3组（ P值均<0.01）。伤后14 d，水溶性壳聚糖水凝胶组创面的MRSA浓度明显低于空白对照组（ P<0.01），但与对照水凝胶组和磺胺嘧啶银水胶组均相近（ P>0.05）。伤后21 d，空白对照组创面新生表皮缺损严重；对照水凝胶组创面的表皮亦有大面积缺损；磺胺嘧啶银水胶组创面尚未形成完整新生表皮；水溶性壳聚糖水凝胶组创面不仅被新生表皮完全覆盖，且新生表皮基底细胞排列规整。伤后21 d，水溶性壳聚糖水凝胶组创面中CD31阳性百分率为（2.19±0.35）%，明显高于空白对照组的（0.18±0.05）%、对照水凝胶组的（0.23±0.06）%以及磺胺嘧啶银水胶组的（0.62±0.25）%， P值均<0.01。培养48 h，水溶性壳聚糖水凝胶组Raw264.7中CD206阳性细胞百分率明显低于IL-4组（ P<0.01），但明显高于空白对照组与对照水凝胶组（ P<0.05或 P<0.01）。 结论:水溶性壳聚糖水凝胶生物安全性好，较不含水溶性壳聚糖的对照水凝胶能诱导更高水平的巨噬细胞M2型极化，因此可以提升糖尿病小鼠MRSA感染的全层皮肤缺损创面的修复效果，并促进创面快速愈合。

融雪期的侵蚀外营力主要以冻融和融雪径流为主,该营力可能会影响土壤结构和团聚体稳定性,从而对融雪侵蚀过程产生影响.在融雪期,融雪径流过程会导致团聚体输移破碎,但是关于冻融对团聚体输移破碎的影响研究鲜有报道.本研究以东北典型黑土区5～7和3～5 mm团聚体为对象,分析了不同冻融次数(0、1、5、10、15和20次)下水稳性团聚体组成、平均重量直径(MWD)、标准化平均重量直径(NMWD)和不同冻融次数、不同输移距离(5、10、15、20、25和30 m)下团聚体输移破碎率(BR)及冻融和输移共同作用对BR的贡献度(CT),研究融雪期典型黑土团聚体输移破碎特征.结果表明:5～7和3～5 mm团聚体冻融循环后主要以0.5-1 mm粒径为主,随着冻融次数增加其MWD值总体呈下降趋势,并且在相同冻融次数下3～5 mm团聚体NMWD大于5～7 mm.5～7和3～5mm团聚体随着输移距离的增加BR逐渐增加,尤其是在1次冻融条件下,与未冻融组相比输移距离为5、10、15、20、25和30 m时BR分别显著增加59.7％、32.2％、13.7％、6.2％、13.4％、7.5％和 60.0％、39.0％、18.4％、13.0％、6.3％、6.1％;但随着冻融次数的增加,BR 增加相对缓慢.团聚体输移破碎主要受输移距离(CT=54.6％)和冻融循环(CT=26.2％)的影响,并且冻融循环主要改变团聚体稳定性,进而影响团聚体输移破碎率.可见,在融雪期,冻融循环降低了土壤团聚体稳定性,致使融雪径流过程中团聚体输移破碎严重,土壤更易随水流迁移引发水土流失,因此,应重视该时期的土壤侵蚀及其防治.

冻土微生物对预测冻土和气候之间潜在反馈机制至关重要.为明确不同冻融阶段对冻土细菌群落的影响,揭示冻土性质变化与细菌群落之间的响应关系,选择黑龙江典型季节冻土表层土为研究对象并进行理化性质测定,采用16S rRNA高通量测序技术分析细菌群落结构和功能组成,通过冗余分析等方法探究土壤理化性质与细菌群落结构和功能之间的相关关系.结果表明:(1)不同冻融阶段对土壤pH和总磷含量影响不显著,完全冻结期土壤中机质和总氮含量显著高于冻融循环期(P＜0.05).(2)共获得OTU序列985111条,属于42个菌门,优势菌门中,放线菌门(Actinobacteria)相对丰度在完全解冻期显著高于冻融循环期和完全冻结期(P＜0.05),变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)相对丰度在不同冻融阶段未表现出显著性差异.不同冻融阶段对细菌Alpha多样性和Beta多样性影响显著,其中冻融循环期显著增加了细菌群落的多样性,完全冻结期则使Beta多样性发生显著变化.此外,完全冻结期对细菌丰度之间的正相关性以及群落的稳定性影响较大.(3)细菌群落功能共5418种,分属于6大类,其中新陈代谢功能占比最大,不同冻融阶段平均值占比75％以上.一级功能在完全冻结期和完全解冻期之间均具有显著性差异(P＜0.05).具有显著性差异的二级功能中,几乎均在完全冻结期和完全解冻期之间存在显著差异(P＜0.05).(4)土壤有机碳(SOC)、总氮(STN)、总磷(STP)是影响细菌群落结构组成和功能的主要环境因子,pH影响不显著.综上所述,不同冻融阶段(特别是完全冻结期)对细菌群落结构组成和功能具有显著影响,这种影响的变化与土壤性质SOC、STN、STP呈现显著正相关或负相关关系,研究结果为进一步研究气候变暖背景下黑龙江省季节冻土微生物的响应机制提供科学依据.

目的 考察奥扎格雷氨丁三醇注射用浓溶液使用中及低温、冻融稳定性,为其临床使用、贮藏和运输提供参考.方法 奥扎格雷氨丁三醇注射用浓溶液分别采用0.9％氯化钠注射液和5％葡萄糖注射液稀释,于0,2,4,6,8和24 h检测配伍后溶液的性状、pH、有关物质、不溶性微粒、可见异物及含量;奥扎格雷氨丁三醇注射用浓溶液分别经低温(2～8 ℃)和冻融(-10～-20 ℃)各3个循环,考察性状、pH、有关物质、不溶性微粒、可见异物及含量的变化.结果 奥扎格雷氨丁三醇注射用浓溶液分别用0.9％氯化钠注射液与5％葡萄糖注射液稀释后,24 h内各项检测指标均符合规定,且与0时相比无明显变化;奥扎格雷氨丁三醇注射用浓溶液经历低温、冻融各3个循环,各检测指标也均符合规定,且与0时相比无明显变化.结论 奥扎格雷氨丁三醇注射用浓溶液与0.9％氯化钠注射液、5％葡萄糖注射液在24h内配伍稳定性良好;短期内经历低温或冷冻条件,不影响奥扎格雷氨丁三醇注射用浓溶液的质量.

冷冻消融术是一种肿瘤微创治疗手段.该技术借助冷媒(例如氮气和氦气)进行反复冻融循环,通过冰晶损伤、微循环损伤、细胞凋亡和免疫效应等机理,对肿瘤细胞和组织造成损害.近年来,冷冻消融技术以其侵入性小、靶向性高、能实现术中可视化监测等优点,被广泛应用于许多类型肿瘤的治疗中,然而冷冻消融技术还面临着会引起多种并发症、冷冻边界难以控制等诸多难题.综述冷冻消融的作用机理、技术特点、应用现状、主要优缺点及发展趋势,讨论如何通过优化冻融方案、联合免疫疗法等来改善冷冻消融并发症,并对实现大尺寸肿瘤的完全消融所面临的挑战进行展望和总结.

目的:验证循环微小核糖核酸(microRNA,miRNA)-124的稳定性、组织特异性及其检测铅神经毒性的灵敏性,为循环miR-124用于铅神经毒性评价提供依据.方法:采用Zea-Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型,采集血液样本离心、分装后立即检测或在室温、2～8℃和-70～-90℃条件下储存不同时间后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测miR-124的表达;分别使用对乙酰氨基酚(1250 mg/kg)、异丙肾上腺素(2.5 mg/kg)和庆大霉素(80 mg/kg)建立大鼠肝毒性、心脏毒性和肾毒性模型,采集血液样本检测并比较造模前后循环miR-124的变化;使用醋酸铅(300、600 mg/kg)建立大鼠神经毒性模型,采用酶联免疫吸附测定方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测白细胞介素(interleukin,IL)-10、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)的变化,比较检测到细胞因子和循环miR-124含量变化的时间评估其灵敏性.结果:以新鲜血液样本作为对照,血液样本室温保存6 h,2～8℃保存24 h,-70～-90℃保存36d以及3次冻融后循环miR-124仍保持稳定,稳定性可以支持实验室需求;循环miR-124在大鼠肝毒性、心脏毒性和肾毒性模型中均无明显改变,具有良好的组织特异性;与细胞因子相比,循环miR-124可以更灵敏地检测铅暴露引起的神经炎症.结论:循环miR-124具有良好的稳定性、组织特异性和灵敏性,可作为评价铅神经毒性的潜在的生物标志物.

[目的]探讨针刺对卵巢储备功能减退(DOR)不孕症激素替代周期-冻融胚胎移植(HRT-FET)中妊娠结局的影响.[方法]将 100例行HRT-FET治疗的DOR患者随机分为对照组和针刺组各 50 例.两照组均常规HRT准备内膜;针刺组在对照组基础上,在内膜准备阶段加用针刺治疗,每周3次,治疗 2周.比较两组内膜转化日血清雌激素(E2)、孕激素(P)水平,移植前日子宫内膜厚度、子宫动脉血流动力学参数[收缩期峰值与舒张末期流速比值(S/D),阻力指数(RI)与搏动指数(PI)]、移植胚胎数、移植周期临床妊娠率以及活产率.[结果]针刺组子宫内膜厚度大于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).针刺组S/D指数低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).两组间比较RI与PI指数,差异无统计学意义(均P＞0.05).针刺组移植周期临床妊娠率为 56%(28/50),对照组临床妊娠率为 36%(18/50),差异有统计学意义(P＜0.05).针刺组移植周期活产率为 44%(22/50),对照组活产率为 32%(16/50),差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]针刺在DOR不孕症激素替代周期冻融胚胎移植中,能降低子宫血运阻力,增加血液循环,有利于子宫内膜的生长,增加内膜厚度,改善容受性,提高妊娠率.

目的 探究肌腱多次冻融后是否会影响其自身的特性.方法 肌腱在收获后直接在-20℃冷冻,各组肌腱在3个月内进行多次冻融循环,进行生物力学试验及形态学、组织学和透射电镜的比较.结果 在-20℃的条件下,随着冻融次数的逐渐增加最大载荷、抗拉刚度、最大断裂应力会下降,同样在组织结构的观察中,也得到了同样的验证.结论 随着冻融次数的增加,肌腱的生物力学特征会逐步下降,组织结构也会受到不同的创伤.

西南亚高山森林是典型的季节性冻土区,为深入研究气候变暖背景下冻融循环变化对森林土壤环境的影响,该研究以西南亚高山森林乔木层与灌木层优势种云杉(Picea asperata)和华西箭竹(Fargesia nitida)根区土壤为研究对象,利用红外辐射加热器模拟气候变暖,研究增温对非生长季土壤冻融循环、土壤理化性质和酶活性的影响.在此基础上,开展室内培养实验,进一步验证冻融循环变化对土壤性质的影响.结果表明:(1)与对照小区比较,增温小区5 cm和15 cm土层温度分别升高2.85和2.13 ℃,冻结天数分别减少了60和32天,冻融循环次数分别由3次和1次降为0次.(2)增温增加了两物种根区土壤总氮(TN)、可溶性有机氮(DON)和微生物生物量氮(MBN)含量,但降低了土壤铵态氮(NH4+-N)含量.土壤冻结天数、冻融循环次数与TN、DON含量显著负相关,与NH4+-N含量显著正相关.(3)增温显著促进了两树种根区土壤N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)活性,但显著抑制了脲酶(Ure)活性.土壤冻结天数、冻融次数与NAG和Ure活性显著相关.(4)与野外研究相似,室内冻融循环处理可显著增加云杉根区土壤NH4+-N含量与β-葡萄糖苷酶(BG)活性,降低了NAG活性;增加了华西箭竹根区NH4+-N含量,降低了BG与NAG酶活性;但冻融循环对土壤硝态氮(NO3-N)、DON含量、Ure及蛋白酶(Pro)活性的影响与野外研究结果不同.冗余分析表明,华西箭竹根区土壤酶活性主要受土壤DON含量的影响,而云杉根区土壤酶活性与pH、NH4+-N含量、DON含量显著相关.以上结果说明,气候变暖背景下季节性冻土冻融循环消失,会显著影响西南亚高山森林非生长季土壤理化性质(尤其是土壤氮库组分)和酶活性,但其影响机制需要进一步研究.