目的:采用预定位技术在表皮生长因子受体(EGFR)阳性/阴性荷瘤鼠中探索西妥昔单克隆抗体(简称单抗；Cetuximab)靶向EGFR免疫PET显像的可行性。方法:以反式环辛烯(TCO)- N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰Cetuximab获得Cetuximab-TCO。以2，2′-((6-氨基-1-(4，7-双(羧甲基)-1，4，7-三氮烷-1-基)己烷-2-基)氮杂二酰基)二乙酸(L-NETA)为螯合剂，制备 68Ga-L-NETA-四嗪(Tz)分子探针，测定其标记率、稳定性。体外培养基底样乳腺癌细胞MDA-MB-468(EGFR+)和MDA-MB-231(EGFR-)，进行细胞摄取及阻断实验。用Balb/c-nu小鼠建立MDA-MB-468和MDA-MB-231皮下荷瘤鼠模型；将50 μg Cetuximab-TCO注入荷瘤鼠体内，经过不同时间(48、36、24和12 h)后再注射 68Ga-L-NETA-Tz，利用"TCO-Tz"反应(点击化学特异性结合)实现 68Ga-L-NETA-Tz与Cetuximab-TCO的体内连接；进行小动物PET显像及生物分布实验。数据比较采用单因素方差分析。 结果:成功制备 68Ga-L-NETA-Tz分子探针，标记率>95%，2 h放化纯>95%。体外细胞摄取实验证实了预定位技术的可行性：先后加入Cetuximab-TCO与 68Ga-L-NETA-Tz后，1 h时MDA-MB-468细胞摄取率可达(0.69±0.04)%。体内PET显像及生物分布实验结果示，提前36 h注射Cetuximab-TCO，MDA-MB-468荷瘤鼠有最高的肿瘤摄取值[(0.77±0.05)每克组织百分注射剂量率(%ID/g)，1 h]及最佳的靶/非靶比值(肿瘤/肌肉：4.67±0.46)；给予过量Cetuximab的阻断组、未提前注入Cetuximab-TCO组及MDA-MB-231组肿瘤未见明显摄取[(0.35±0.01)、(0.39±0.05)、(0.45±0.10) %ID/g； F＝15.50， P＝0.002]。 结论:采用预定位技术，通过先后注射Cetuximab-TCO和 68Ga-L-NETA-Tz，在荷瘤鼠模型中成功进行了靶向EGFR免疫PET显像，为单抗免疫PET显像提供了一种有效的方法。

目的:探讨Prader-Willi综合征（Prader-Willi Syndrome，PWS）的临床特征及遗传学特点。方法:回顾性分析2例于河北省人民医院确诊为PWS患儿的临床资料及基因学特点，并对相关文献进行讨论复习。结果:病例1，男，年龄6岁3个月，因身材矮小就诊，智力轻度低下，构音障碍，脊柱侧弯，隐睾，小阴茎，长颅、窄面、杏仁眼、小嘴，薄上唇、嘴角向下，皮肤白皙。婴儿期肌张力低下、喂养困难，后逐渐食欲亢进，1.5岁行双侧隐睾手术，但效果不佳。病例2，男，年龄4岁，主因肥胖就诊，食欲亢进，体质量增长过快，语言、认知功能落后，构音不清，脊柱侧弯。婴儿早期曾有喂养困难，2岁行双侧隐睾手术效果不佳。分别采用甲基化特异性聚合酶链反应及甲基化特异性多重链接探针扩增技术进行了基因检测：结果均检测到PWS关键区域（15q11-13）的父源片段丢失，确诊为 PWS。结论:PWS是一种较为罕见的遗传性疾病，临床表现复杂多样，各年龄段特点不同，对不明原因婴儿期肌张力低下、喂养困难；儿童期矮小、肥胖患儿，需警惕该病，可通过分子遗传学技术明确诊断。

目的:基于Au@Ag NPs的SERS侧流免疫层析(LFIA)建立一种快速、高灵敏定量检测人腺病毒(HAdV)的方法。方法:首先合成出双层拉曼分子5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)修饰的Au@Ag NPs，再结合HAdV特异性抗体得到SERS探针，基于抗原-抗体的特异性反应在免疫层析条检测线处形成"三明治"免疫复合结构，通过收集并分析检测线上的SERS信号，可以实现对HAdV抗原的快速检测。其次，分别对该检测方法的灵敏度、重复性和特异性进行评价。结果:基于双层DTNB修饰的Au@Ag NPs SERS-LFIA可在15 min内对HAdV实现定性/定量检测，其可视化检测结果为10 ng/ml，最低检出限达0.1 ng/ml，定量范围为0.1 ng/ml~1 000 ng/ml。此SERS免疫层析方法对HAdV的检测具有良好的重复性和特异性，与登革热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒和埃博拉病毒五种新突发传染性病毒均无交叉反应。结论:该研究提出的基于Au/DTNB@Ag/DTNB NPs的SERS-LFIA可以实现对HAdV的快速和高灵敏检测，在HAdV的现场即时检测领域具有巨大潜力。

目的 为了对肉制品中牛肉源性成分进行准确定量,本文采用数字PCR(dPCR)技术对牛肉的线粒体Cytb基因进行定量检测,根据基因拷贝数建立了肉制品中牛肉源性成分PCR的定量检测方法.方法 参照标准设计的牛源性特异性引物、探针,猪源性特异性引物、探针,鸭源性特异性引物、探针以及动物源性成分通用引物、探针,建立了双重数字PCR体系.结果 在一定范围内生鲜牛肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,并以DNA含量为中间值计算出DNA拷贝数(C)与生鲜牛肉质量之间的换算公式:M 牛=0.020 9C+0.676.应用建立的dPCR方法对构建的肉样模型进行检测,结果显示牛肉定量检测值与实际质量基本一致,且受外源物种的干扰小.运用该方法对抽取的10份市售牛肉样品检测,同时通过特异/通用引物扩增的拷贝数之比(％)辅助判断肉制品中是否存在非牛源性的其他动物源性成分掺假,检测出部分样品不符合标签规定.结论 该方法可实现对牛源性成分的量化检测,能够作为区分故意添加和无意污染的依据,为执法监管部门提供有力的技术保障.

[目的]鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是对家禽危害最大的两种支原体,MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节.通过将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立一种操作便捷、反应快速、结果可视化、可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法.[方法]基于MG的mgc2 基因、MS的vlhA基因设计特异性引物和探针,优化反应时间、反应温度及引物配比建立双重LFD-RPA快速检测方法,评价其灵敏度、特异性、稳定性,同时对 120 份临床样品进行检测.[结果]双重LFD-RPA检测方法在 37℃下反应 5-10 min即可完成扩增,其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1 最佳引物配比为 0.6∶1.4.MG、MS的最低检出限分别为 3.75 copies/μL、3.46 copies/μL.用该方法与OIE推荐的PCR方法对 120 份样品进行检测,二者符合率为 93.3%.[结论]MG、MS双重LFD-RPA检测方法在恒温条件下即可完成扩增,其操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好,无需使用任何仪器即可观察到结果,适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的现场快速检测.

目的:对一例假肥大型肌营养不良(DMD)患儿进行基因变异分析,探究基因型和临床表型的相关性.方法:采集家系成员的临床数据和家族史,采用多重连接探针扩增技术(MLPA)检测目标基因拷贝数变异是否异常、全外显子组测序(WES)分析先证者致病基因、Sanger测序验证可疑位点.针对发现的剪切位点突变构建mini-gene表达载体,采用mRNA体外剪接mini-gene实验验证变异对mRNA剪切的影响.结果:该家系先证者男,双下肢无明显受累,外周血肌酸激酶(CK)水平升高(700～1600 U/L),肌电图示肌源性损害.MLPA检测未发现受检者DMD基因存在外显子拷贝数变异.测序结果显示先证者携带DMD基因(NM_004006.2)c.2622+2T＞C母源剪切变异.体外mini-gene实验发现该变异影响剪切且产生多种新转录本.结合患儿临床表现及基因检测结果,推测受检者为DMD基因剪切变异导致的假肥大型肌营养不良.结论:本研究明确了 DMD基因剪切变异为一例DMD患儿致病原因,进一步丰富了中国DMD突变谱,证实了 DMD基因c.2622+2T＞C变异可产生多种转录本导致不同的功能受损,对患者临床表现与基于时空表达相关联,有一定的基因型-表型对应关系的参考意义.

[目的]旨在建立一种基于重组聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)检测技术结合测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)快速鉴别检测羊痘病毒(capripox virus,CaPV)与羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的双重RPA-LFD检测方法.[方法]选取CaPV P32 基因及ORFV 011 基因的保守片段,进行目的片段扩增并构建重组质粒;设计CaPV及ORFV RPA引物各 3 对,CaPV-HP、ORFV-HP探针各 1 条;进行单重基础RPA引物筛选试验;对双重RPA-LFD的反应时间及反应温度进行优化;探索双重RPA-LFD最佳引物配比体系及最佳探针配比体系;进行双重RPA-LFD灵敏度、特异性及重复性试验;用所建立的方法对采集的 55 份临床样品进行检测.[结果]引物筛选试验结果显示,引物对CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1 的特异性最强、扩增效率最高;该方法在反应温度为 39℃、反应时间为 11 min的反应条件下扩增效率最佳;CaPV-RPA-F3/R3、ORFV-RPA-F1/R1的最佳引物配比为 0.8 μL∶1.6 μL,CaPV-HP、ORFV-HP的最佳探针配比为 0.1 μL∶0.9 μL;双重RPA-LFD灵敏性试验最低检出限为CaPV/ORFV 4.65/3.94×100 copies/μL;特异性试验结果显示与PPRV、IBRV、Sau、SPN均无交叉反应;临床样品检测结果显示RPA-LFD检测阳性率与PCR检测阳性率相符合.[结论]成功建立了CaPV与ORFV双重RPA-LFD快速检测方法,可用于临床中CaPV与ORFV混合感染的快速鉴别诊断.

目的 探究二氢青蒿素对衰老细胞的作用及其机制.方法 利用双氧水诱导小鼠成纤维细胞(NIH3T3)构建应激早衰模型(SIPS),通过衰老特异性标记物SA-β-半乳糖苷酶染色、蛋白质印迹技术进行SIPS鉴定;细胞实验分为对照组(磷酸盐缓冲液+二甲基亚砜)、模型组(双氧水+二甲基亚砜)、药物组(双氧水+二氢青蒿素),采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法、乳酸脱氢酶法、SA-β-半乳糖苷酶染色、细胞内铁含量测定、蛋白质印迹技术、荧光探针染色及流式细胞术检测二氢青蒿素对衰老细胞的影响.结果 CCK-8结果显示,二氢青蒿素作用模型组24 h的半数抑制浓度(IC50)为(8.26±0.66)μmol/L;与对照组相比,模型组存活率降低,且呈剂量依耐性;蛋白质印迹结果显示,与模型组相比,药物组铁蛋白重链(FTH)及谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)蛋白表达水平降低(P＜0.05),细胞内铁、活性氧(ROS)含量增加(P＜0.05).结论 二氢青蒿素可特异性诱导衰老细胞死亡,其机制与铁死亡有关.

[背景]传统引物延伸法常与放射性标记结合使用,但由于放射性元素半衰期短、危害人体健康及严格的操作要求等限制了其在一般实验室的广泛使用.因此,开发新型非放射性引物延伸法成为当前研究的热点.[目的]建立非放射性的引物延伸法,并利用该方法实现对细菌 RNA剪切加工位点的鉴定.[方法]将包含 RNA 剪切位点的序列克隆至双荧光报告系统,然后利用荧光染料 Cy5.5 标记的特异性靶向 mcherry 寡核苷酸引物进行延伸,并辅以 Northern blotting、RT-qPCR等技术,确定RNA剪切加工的精确位点.[结果]鉴定了来自解纤维梭菌cip-cel mRNA中的 2 个剪切加工位点均位于颈环结构下游的单链区域,且在剪切位点附近未发现保守序列.[结论]基于Cy5.5 标记的引物延伸法能够精确鉴定RNA剪切加工位点,且与传统的放射性引物延伸法相比,该方法具有更高的安全性和更快的检测速度,能够满足一般实验室的实验要求.

目的:针对结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)IS6110和IS1081基因,开发双靶标实时荧光PCR检测技术并评价其在剖检奶牛病料中进行MTBC快速检测的可行性,为分子检测技术在牛结核病早期诊断领域的推广应用提供基础数据支持.方法:以IS6110和IS1081为特异靶基因建立MTBC实时荧光PCR检测体系;通过制备并检测含有不同浓度牛分枝杆菌菌悬液的牛肺组织,确定双靶标实时荧光PCR检测体系的检出限;使用21株常见非结核分枝杆菌标准株的DNA作为扩增模板,确定双靶标实时荧光PCR检测MTBC的特异度;对剖检奶牛组织病料进行MGIT 960液体培养、Xpert MTB/RIF(简称"Xpert")、Xpert MTB/RIF Ultra(简称"Xpert Ultra")和双靶标实时荧光PCR检测,以液体培养结果为参照标准,分析双靶标实时荧光PCR检测在剖检奶牛病料中检测MTBC的效能.结果:双靶标实时荧光PCR检测21株非结核分枝杆菌菌株的DNA,均未检测到扩增曲线,MTBC检测特异度为100.0％(21/21).组织病料液体培养、Xpert、Xpert Ultra和双靶标荧光 PCR检测阳性率分别为 64.0％(32/50)、56.0％(28/50)、78.0％(39/50)和 76.0％(38/50).双靶标荧光 PCR检测阳性率明显高于Xpert检测阳性率,差异有统计学意义(x2=4.456,P=0.035),双靶标荧光PCR检测阳性率与Xpert Ultra检测阳性率差异无统计学意义(x2=0.056,P=0.812).以液体培养结果为参照标准,双靶标荧光PCR检测MTBC的敏感度和特异度分别为90.3％(28/31)和40.0％(6/15);Xpert Ultra检测MTBC的敏感度和特异度分别为96.8％(30/31)和40.0％(6/15).结论:双靶标荧光PCR检测技术可用于牛结核病的早期快速诊断,有助于控制人畜共患结核病的流行和传播.