目的:分析甲状腺癌的可变剪切（AS）事件，探讨AS事件与甲状腺癌预后的相关性，并建立AS事件与剪接因子（SF）的调控网络。方法:分别从癌症基因图谱（TCGA）和TCGA SpliceSeq数据库下载507例甲状腺癌患者临床资料和AS事件数据，合并得到AS事件生存数据的矩阵，评估7种AS事件的发生情况。采用单因素Cox回归分析筛选与预后相关的AS事件，最小绝对值收敛和选择算子（LASSO）回归分析筛选变量避免模型过度拟合，多因素Cox回归分析构建预后模型。Kaplan-Meier 曲线和受试者工作特征（ROC）曲线对预后模型的价值和效能进行评价。利用Pearson试验分析AS事件与SF的相关性，并对SF基因进行GO富集和KEGG通路分析。结果:本研究共纳入507例甲状腺癌患者，研究发现10 447个基因发生了45 150次可变剪切事件。其中ES为主要类型（38.84%），ME发生次数最少（0.51%）。单因素Cox回归筛选出1 842个与预后相关的AS事件，多因素Cox分析建立了基于USHBP1-48249-AA、CACNB1-40626-AT和BEX5-89679-AP的预后风险模型。以风险分数0.807为最佳临界值，能够很好地区分高风险和低风险组（ P<0.001，AUC=0.929）。构建的SF-AS调控网络中发现多个关键SF基因能够调控AS事件的表达，包括CDK12、RBM25、DDX39B、SRRM2和DDX46等。 结论:基于3-AS事件的模型对于评估患者预后具有较高的价值，构建的SF-AS调控网络为探讨甲状腺癌发生发展机制提供了新的思路。

目的 通过大数据分析6月龄PS19小鼠体内异常选择性剪切(AS)事件是否在tauP301S诱导的神经退行性表型之前出现.方法 采用axel从ENA数据库下载GSE182170数据集原始测序文件,通过STAR软件与ENSEMBL数据库参考基因组进行比对,rMATS和rmats2sashimiplot R包进行常见AS事件分析和结果可视化展示.RSEM软件进行基因转录本定量,Deseq2、edgeR、limma R包进行差异分析,采用clusterProfiler R包对差异基因进行GO富集分析.String和Cytoscape软件用来进行蛋白质间相互作用分析.采用ggcorrplt R包进行基因表达相关性分析.PCR结合琼脂糖电泳验证AS事件.结果 通过rMATS鉴定出了8 079个AS事件,并最终筛选出117个显著AS事件(ΔPSI>0.1,测序覆盖度>1).外显子跳跃(SE)是最常见的AS事件(50.43%),其次是外显子3'端可变剪切(A3SS)和外显子互斥(MXE).GO富集分析发现,突触组织基因发生异常SE事件,而剪切体基因主要发生异常A3SS事件.蛋白相互作用和相关性分析发现Snrpn剪切因子与最多数量的转录本表达显著相关.琼脂糖电泳证实PS19小鼠中Lrp8基因的异常AS事件.结论 异常的剪切因子可能参与了tauP301S引起的异常AS改变.本研究扩展了tau蛋白病中tau蛋白循环和剪切因子的知识.

目的 探索胰腺癌(PAAD)中存在的差异RNA剪接模式,分析可变剪切(AS)事件与胰腺癌临床预后的关系.方法 自癌症基因组图谱(TCGA)中下载RNA-seq数据、临床数据资料,提取剪接因子(SF)表达量;采用TCGA SpliceSeq工具下载提取AS事件数据,评估7种可变剪切类型在胰腺癌病例中的发生情况;采用Kaplan-Meier分析及Cox回归分析评估AS事件风险值和生存时间之间的相关性,并探索PAAD的独立危险因素;采用Cytoscape构建基于生存相关的AS事件与SF的调控关系网络.结果 PAAD中与生存相关的AS事件以外显子跳跃(ES)类型多见,外显子互斥(ME)类型较少;各亚型AS事件对生存影响不同,低风险组的预后较好,且风险值可作为PAAD独立预后因素(P<0.01,AUC=0.765).剪接网络提示PAAD患者中剪接因子的表达与AS事件之间具有相关性.结论 AS事件风险值可作为PAAD的独立预后因子,且SF对AS事件的调控呈多样性,SF可能会作为PAAD治疗的潜在靶点.

基因表达调控是现代分子生物学研究的热点话题,随着研究手段的不断成熟,其RNA转录后调控已成为备受关注的领域.RNA结合蛋白(RBPs)是转录后调控的关键因子,参与RNA可变剪切、RNA稳定、翻译等多个过程的调控.ErbB3绑定蛋白(EBP1)是结构功能高度保守的RNA结合蛋白,可与rRNA、tRNA、mRNA等多种RNA结合,参与调控核糖体生物生成、蛋白质翻译多个过程,但目前已报道的靶RNA甚少,对靶RNA的作用机制目前仍不清楚.通过生物信息学分析发现拟南芥EBP1结合RNA的保守结构域,并在体外可直接结合"GUCUCUCACUGCGACGGCUU"序列;通过RNA免疫共沉淀实验找到了3个靶mRNA(AT1G24792、AT3G25211、AT3G24320);结合核糖体提取及虫草素处理实验发现EBP1可显著调控特定靶mRNA的稳定性及其翻译速率.研究结果不仅证实拟南芥EBP1具有结合RNA的功能,还显示其参与调控靶RNA的转录后事件,为进一步研究EBP1在转录后调控的生物学机制奠定基础.

可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制,是导致真核生物基因和蛋白质数量较大差异的重要原因.可变剪切在真核生物中普遍存在,由多种转录和转录后调控机制协调控制,并在组织和物种特异性分化模式中起关键作用.基因表达过程中发生的可变剪切事件直接影响顺式作用元件的作用和定位,并对生物的生长发育、信号转导、生物和非生物胁迫等过程都具有重要的调控作用.在进化过程中,一些剪接体是有益的,可以作为功能性可变剪切(alternative splicing,AS)事件被保留.但如何区分剪接错误与生物功能性的可变剪切事件仍然是一个悬而未决的问题.可变剪切的功能与机制的研究,不但为培育营养元素高效利用的作物品种提供了理论依据,而且为作物驯化过程中高效育种改良提供新思路.本研究介绍了可变剪切的特点、功能与机制,总结了可变剪切在生物信息学领域的研究方法以及在动植物中的研究进展.

目的 对犏牛囊胚玻璃化冷冻前后的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)和可变剪切(alternative splicing,AS)进行比较分析.方法 采用普通娟珊牛精子和牦牛卵母细胞,以体外授精(in vitro fertilization,IVF)的方式获得犏牛囊胚.提取犏牛新鲜囊胚和经玻璃化冷冻复苏后的犏牛冻融囊胚总RNA,构建文库并进行高通量测序.采用SAMtools-0.1.19和ASprofile软件分别进行SNP和AS分析.结果 犏牛新鲜囊胚和冻融囊胚样本通过去低质量序列、去接头污染等过程后,分别得到51 099 116和54 192 358条待分析数据(Clean Reads).新鲜囊胚和冻融囊胚分别检测到116 681和224 750个SNP位点.在新鲜囊胚转换型SNP中,C/T类型数量略多于A/G类型;但在冻融囊胚中,A/G类型数量略多于C/T类型;两样本颠换型SNP中,A/T所占比例最少.新鲜囊胚和冻融囊胚转换和颠换型SNP的比例分别为2.57和2.45.新鲜囊胚和冻融囊胚分别检测出49 388和65 241个AS事件,主要有5种AS类型,其中转录起始区域和转录结束区域AS所占比例最大.结论 利用RNA-Seq技术对玻璃化冷冻前后犏牛囊胚SNP和AS进行比较分析,可为后续人类胚胎冷冻前后相关基因功能分析和挖掘提供有效数据和理论基础.

[目的]探讨可变剪切事件与黑色素瘤预后的相关性.[方法] 471例黑色素瘤患者的临床信息下载自TCGA数据库,与患者对应的可变剪切事件下载自TCGA SpliceSep数据库.采用单因素Cox回归分析筛选预后相关的可变剪切事件;采用Lasso回归分析构建预后模型,并计算黑色素瘤患者的风险值,对高低风险组绘制生存曲线,ROC曲线和风险曲线;随后采用单因素和多因素Cox回归分析进行独立预后分析.采用Metascape在线工具对预后相关的可变剪切基因进行富集分析.[结果]设置阈值为P＜0.05,筛选得到的预后相关的可变剪切事件共有1238例.Lasso回归表明,采用MTMR14 | 63114| ES和BATF2| 16723 | AP的可变剪切事件PSI值作为预后模型,高风险组患者的生存时间减少,死亡人数增加.此外,预后模型作为独立预后因子可准确预测黑色素瘤患者的预后状况.与预后相关的可变剪切基因富集的生物学功能主要包括细胞死亡的调节,蛋白复合体组装的调节,GTP酶活性的调节,核质运输和DNA修复.[结论]预后相关的可变剪切事件可作为预后模型,较准确地预测黑色素瘤的预后状况.

目的:探究三代测序技术在研究小鼠早期胚胎发育过程中等位基因特异的转录组和可变剪切中的优势.方法:收集已发表文献中小鼠早期胚胎的测序数据,用这些数据识别等位基因特异的转录本和可变剪切事件以及差异可变剪切事件,比较二代测序数据和三代测序数据识别的结果.结果:小鼠早期胚胎7个阶段的三代测序数据中分别识别出1288、759、734、955、976、953和834个等位基因特异的转录本,值得注意的是50％～94％的等位基因特异的转录本无法被二代测序数据所识别.与二代测序技术相比,三代测序在鉴别可变剪切事件方面具有更高的潜力,并且三代数据可以鉴别出大量准确且特异的剪切结.另外,在每个阶段平均鉴定出650个等位基因特异的可变剪切事件和26个差异可变剪切事件.结论:三代测序技术有助于发现新的等位基因特异的转录本和可变剪切事件以及差异可变剪切事件,从而为早期胚胎发育研究领域提供宝贵的注释资源.

[目的]蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis,简称球囊菌)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的真菌病原,导致的白垩病是严重影响养蜂生产的顽疾,每年给养蜂业造成较大损失.本研究旨在基于已获得的第三代长读段测序数据对球囊菌菌丝(Aam)和孢子(Aas)中基因的可变剪切(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)进行深入分析.[方法]利用Astalavista软件鉴定Aam和Aas中基因的AS事件类型.利用IGV浏览器对部分剪切异构体(isoform)的结构进行可视化.通过TAPIS pipeline对Aam和Aas中基因的APA位点进行鉴定.通过MEME软件对Aam和Aas中全长转录本的APA位点上游50 bp的序列特征进行分析并对motif进行鉴定.[结果]在Aam中共鉴定到286次AS事件,包括1 62次RI (Retained intron),87次A3 (Alternative 3'splice-site)、32次A5 (Alternative 5'splice-site)和5次SE (Skipping exon);在Aas中共鉴定到559次AS事件,包括305次RI、155次A3、85次A5、13次SE和1次MEE (Mutually exclusive exon).进一步分析发现,现有参考基因组上的多数注释基因结构并不完整;部分注释基因在菌丝和孢子中转录形成的isoform在数量和结构方面均存在差异;部分isoform在参考基因组中没有对应的注释基因.Aam中共鉴定到2748个基因含有1个及以上的APA位点,其中含有1个APA位点的基因数量最多(726,26.42％);Aas中共鉴定到2768个基因含有1个及以上的APA位点,其中含有5个以上APA位点的基因数量最多(1180,42.63％).部分基因在菌丝和孢子中含有不同的APA位点数.序列特征分析结果显示,球囊菌全长转录本的3'UTR的上下游表现出明显的碱基倾向性,U和A分别富集在3'UTR的上游和下游.此外,在球囊菌全长转录本的APA位点上游鉴定到4个motif,分别是UCUCCU、UCUUCU、CCCACC和CCCCCU.[结论]本研究通过对球囊菌菌丝和孢子中基因的AS和APA进行深入分析,揭示了球囊菌转录组的复杂性,为完善现有的基因组和转录组注释提供了宝贵信息,也为探究AS和APA在球囊菌的基因表达调控中的作用提供了关键基础.

目的 利用生物信息学方法研究可变剪接对肾透明细胞癌(RCCC)患者预后的预测价值.方法 从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载RCCC患者可变剪接事件相关RNA-seq数据及其临床信息,通过单因素Cox回归分析筛选与生存显著相关的可变剪接事件.将选择的可变剪接事件进行LASSO回归分析,并构建Cox预测模型.结果 497例RCCC患者癌组织的21615个基因中共有46415个可变剪接事件发生,单因素Cox回归分析结果显示,在5483个基因中发现12156个与RCCC患者生存显著相关的可变剪接事件(均P＜0.05).LASSO回归分析结果显示,可变受体位点(AA)事件中与RCCC患者生存预后相关性最高的基因为6个,可变供体位点(AD)、可变启动子(AP)、可变终止子(AT)、外显子跳跃(ES)事件中均为5个,外显子互斥(ME)事件中为10个,内含子保留(RI)事件中为4个,整体可变剪接事件中为6个.将7种可变剪接事件及整体可变剪接事件分别构建Cox预测模型,Kaplan-Meier生存曲线分析显示各预测模型中高风险组生存率均低于低风险组(均P ＜0.001).受试者工作特征曲线结果显示,AA、AD、AP、AT、ES、ME、RI和整体可变剪接预测模型的曲线下面积分别为0.759、0.753、0.743、0.763、0.789、0.762、0.674和0.796.结论 可变剪接事件构建的预测模型能有效地预测RCCC患者的生存情况,为临床治疗决策提供帮助.