2023年6月,在贵州省黔东南苗族侗族自治州榕江县采集到两头蛇属(Calamaria)物种1号雄性个体,标本具有以下形态学特征:背鳞13-13-13行,光滑;尾末端背鳞数为5行;上唇鳞4枚,下唇鳞5枚;眶前鳞1枚,眶后鳞1枚;颔片2对,后颔片间接触广泛;腹鳞158枚,尾下鳞20对.生活时头、体背面褐色,具5条细的黑褐色纵线纹,最外侧两行背鳞橙红色,体、尾腹面均匀橙红色.榕江县采集的标本与井冈两头蛇(C jinggangensis)原始描述中提供的形态学鉴定依据相符.线粒体Cyt b基因序列分析显示,本次采集的标本与已知井冈两头蛇样本的遗传距离约为0.85％.综合形态特征比较和系统发育分析,鉴定此次采集的两头蛇属标本为井冈两头蛇,为贵州省爬行动物分布新记录种.

运用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)技术及超高效液相色谱串联三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)对小柴胡颗粒化学成分及大鼠口服后的入血成分进行鉴定.采用CORTECS UPLC C18+色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.6 μm),乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,在电喷雾离子源正、负离子模式下采集数据后与对照品比较保留时间、精确相对分子质量、二级离子碎片以及参照相关文献进行化学成分鉴别;通过皮下注射干酵母建立大鼠发热模型后,灌胃给予正常组及模型组大鼠小柴胡颗粒,给药后于不同时间点眼眶静脉取血,分离血浆,在多反应监测模式(MRM)下进行扫描鉴定入血成分.从小柴胡颗粒中共初步鉴定出112种化学成分,包括63种黄酮类、31种皂苷类、6种有机酸类、4种苯丙素类、3种氨基酸类以及5种其他类化合物;从血浆中鉴定得到18个入血原型成分.该研究鉴定了小柴胡颗粒化学成分及入血成分,为进一步的药效物质基础及质量控制研究奠定了基础.

异绿原酸A(ICA)为茵陈等多种中药的主要药效成分.该研究旨在鉴定口服给药ICA的大鼠血浆、尿液和粪便中的代谢产物,并推测其潜在的代谢途径.ICA灌胃大鼠后,收集不同时间点(段)的血浆、尿液和粪便样品,利用高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱(HPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS)技术,结合对照品比对保留时间、裂解规律总结和文献数据,对生物样品中代谢产物进行结构鉴定.从大鼠样品中初步鉴定了 ICA的39个代谢产物(M1～M39),其中31个来自于血浆(M1～M10、M12～M24、M26～M28、M30、M34～M35、M38～M39)、34 个来自于尿液(M1～M11、M13～M15、M19～M25、M27～M39)、11个来自于粪便(M2～M3、M6、M15、M21～M23、M32、M34、M36～M37),主要代谢途径包括水解、葡萄糖醛酸化、甲基化和磺酸化反应等.该研究揭示了 ICA在大鼠血浆、尿液和粪便中的代谢情况,对深入阐明其药理活性成分提供参考.

目的 通过非靶向代谢组学研究急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)大鼠尿液代谢产物的变化,筛选出可用于AMI法医学鉴定的生物标志物.方法 建立假手术组、AMI组和高脂血症+AMI组(hyperlipidemia+acute myocardial infarction,HAMI)大鼠模型.运用超高效液相色谱-质谱法(ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UPLC-MS)分析AMI大鼠尿液代谢谱的变化.通过主成分分析、偏最小二乘判别分析、正交偏最小二乘判别分析等筛选差异代谢物.使用MetaboAnalyst数据库进行代谢通路富集分析并评估差异代谢物的预测能力.结果 分别筛选出40种和61种与AMI相关和HAMI相关的差异代谢物.其中22种为共同代谢物,这些小分子代谢物主要集中在烟酸和烟酰胺代谢途径中.在95%可信区间内N8-乙酰亚精胺、3-甲基组胺和胸腺嘧啶的受试者操作特征曲线的曲线下面积(area under the curve,AUC)值大于0.95.结论 N8-乙酰亚精胺、3-甲基组胺和胸腺嘧啶可作为诊断AMI的潜在生物标志物,烟酸和烟酰胺代谢的异常可能是AMI的主要原因.本研究可为AMI的作用机制和死因鉴定提供参考.

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是禽类最重要的疫病病原之一,其中基因Ⅵ型NDV在鸽群广泛流行,给养鸽业造成了严重的经济损失.为深入了解基因Ⅵ型NDV在世界不同地理区域和宿主间的传播动态,本研究通过病毒分离鉴定、高通量测序、完整F基因系统发育树构建和贝叶斯系统动力学等方法进行综合分析,结果获得4株广西NDV分离株,均为基因Ⅵ型.进一步的时空分析显示,基因Ⅵ型NDV最近的共同祖先时间为1972年(95％置信区间:1965～1978),估计进化速率为1.43×10-3 substitution/site/year(95％置信区间:1.27×10-3～1.59×10-3);意大利是欧洲基因Ⅵ型NDV早期的外溢传播中心,该病毒从欧洲传播至我国,随后华东和华南成为我国的主要传播中心;病毒存在从鸽(Columba livia)到野鸟和鸡(Gallus gallus)、从野鸟到鹌鹑(Coturnix coturnix)等的跨物种传播,但病毒传播最重要的宿主是鸽.分析结果表明基因Ⅵ型NDV正快速进化,有作为突变库的潜在威胁.基于"One Health"理念,应在全球范围内加强主动监测,改善家禽管理策略,避免不同家禽之间及不同家禽与野鸟之间的直接和间接接触.这些信息有助于了解基因Ⅵ型NDV的起源、传播与进化,为制定相应防控策略提供科学依据.

该研究旨在通过观察苓桂术甘汤(Linggui Zhugan Decoction,LGZGD)含药血清对心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)纤维化及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白分子表达的调控机制.制备空白血清和LGZGD含药血清,胰酶-胶原酶依次消化并结合差速贴壁法分离培养原代CFs,采用免疫荧光标记鉴定原代CFs.设正常对照组,模型组,20％空白血清组,5％、10％、20％LGZGD含药血清组.分别用20％空白血清,5％、10％、20％LGZGD含药血清预处理12 h,除正常对照组,其余5组均加入过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)刺激细胞,建立原代CFs纤维化模型.采用划痕愈合实验观察细胞迁移能力,ELISA法检测Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)含量,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Wnt1、糖原合酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶 3β(phospho synthase kinase 3 beta,p-GSK-3β)、β-catenin 及细胞核β-catenin 的蛋白表达,RT-qPCR 检测 β-catenin、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)的基因表达,免疫荧光技术检测关键蛋白α-SMA、β-catenin的表达及定位.制备Wnt1过表达CFs,采用H2O2处理CFs.设正常对照组、模型组、20％LGZGD含药血清组、空载质粒+20％LGZGD含药血清组、Wnt1过表达+20％LGZGD含药血清组.采用ELISA法检测Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量与其比值,Western blot法检测α-SMA和Wnt1、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及细胞核β-catenin的蛋白表达,RT-qPCR检测β-catenin、MMP9的基因表达.免疫荧光染色显示,心肌成纤维细胞Vimentin表达阳性,呈绿色,胞核为蓝色,纯度大于90％,鉴定是原代CFs.结果显示,与正常对照组相比,模型组CFs 愈合率增强,Col Ⅰ、Col Ⅲ 含量升高,Col Ⅰ/Col Ⅲ 比值增大,α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核β-catenin 蛋白表达上调,GSK-3β蛋白表达降低,β-catenin、MMP9 mRNA表达显著升高,β-catenin、α-SMA荧光强度明显增强,表达量明显增多;与模型组相比,5％、10％、20％LGZGD含药血清能显著抑制细胞迁移能力,减少Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量,降低Col Ⅰ/Col Ⅲ比值,下调α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核 β-catenin 蛋白表达,提高 GSK-3β 表达,减少 β-catenin、MMP9 的 mRNA 表达,降低β-cate-nin、α-SMA荧光强度和表达量;与空载质粒+20％LGZGD含药血清组比,过表达Wnt1后,LGZGD作用被显著逆转.LGZGD能够减少胶原纤维过度沉积,抑制成纤维细胞过度增生,改善心肌纤维化进程.LGZGD改善心肌纤维化的作用与调控Wnt/β-catenin通路,减少胶原沉积,保护心肌细胞有关.

目的 设计并合成具有抗突变型表皮生长因子(epidermal growth factor receptor,EGFR)驱动的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)活性的结构新颖的先导化合物.方法 一系列异羟肟酸类衍生物由起始原料4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶经 7 步化学反应合成而得,采用MTT法测定目标化合物在体外对野生型 EGFR(H460 和 A549)和突变型 EGFR(PC9、HCC827 和H1975)细胞系的抗增殖活性.结果 10 个异羟肟酸类目标化合物结构由NMR和MS谱鉴定确证.活性研究表明,以直链烷基取代的异羟肟酸衍生物(A1、A2 和A4-A6)能有效抑制突变型EGFR细胞系的增殖,而其他化合物如A3 和B1-B4 则无法有效抑制上述细胞的增殖.其中,化合物A4表现最优,不仅能高效抑制突变型EGFR细胞系PC9、HCC827 和H1975 细胞系的增殖,ID50 值小于7 μmol·L-1,与阳性对照N′-羟基-N-苯基辛二酰胺(SAHA)生物活性相似,而且选择性较好,其抑制野生型EGFR细胞系H460 和A549 增殖的ID50值大于32 μmol·L-1.结论 化合物A4 可作为突变型EGFR抑制剂的先导化合物进行深度开发.

目的 通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶 2(fucosyl-transferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系.方法 构建FUT2 慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000 将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2 包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒.慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2 细胞系.PCR鉴定FUT2 基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2 细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2 细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2 细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性.结果 成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒.慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2 细胞系,PCR验证显示,FUT2 基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中.HEK-293T/FUT2 细胞FUT2 mRNA水平提高了 330 倍.99.9%的HEK-293T/FUT2 细胞表达H2 型人类组织血型抗原.GI.1 重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2 细胞产生很好的结合反应,EC50为 2.007 μg/mL.结论 建立了H2 型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1 型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法.

目的 制备抗猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)A35R蛋白单克隆抗体并建立其双抗体夹心ELISA检测方法,同时对方法进行验证.方法 原核表达MPXV A35R蛋白并免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术制备抗A35R蛋白单克隆抗体,对单克隆抗体的特异性、结合活性进行鉴定;建立双抗体夹心ELISA检测方法,对该方法的线性范围、检测限、专属性、准确性、精密度进行验证.结果 制备了 7 株抗MPXV A35R单克隆抗体.Western blot鉴定结果显示,7株单克隆抗体均与MPXV A35R蛋白及灭活MPXV发生特异性反应;7株单克隆抗体结合活性为11.35～27.73 ng/mL;抗体经配对筛选后,确定以7G5和2F5为最佳配对抗体,用于建立双抗体夹心ELISA方法.该方法对灭活MPXV抗原最低检测限为1.250×104 TCID50/mL,对MPXV A35R蛋白最低检测限为 1.95 ng/mL,线性范围为 3.91～125.00 ng/mL,线性回归方程为y=1.732 0x-0.920 8,R2=0.984 3;该方法专属性较强且不与其他病毒及蛋白发生交叉反应;准确性验证结果显示,病毒抗原回收率为 96.94%～110.04%;批间CV为 0.26%～8.13%,批内CV为 2.10%～5.48%.结论 成功制备了抗MPXV A35R蛋白单克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测方法.验证结果显示,该方法具有较高的灵敏度、准确度、重复性及专属性,可用于以A35R蛋白为基础的猴痘亚单位疫苗的生产质量控制.

[目的]为明确几丁质和鞭毛蛋白衍生肽flg22诱导的辣椒幼苗先天免疫生理响应特征,探讨辣椒先天免疫生理响应与辣椒抗多种病害的关系.[方法]以5个四川本地辣椒品种幼苗为试材,鉴定它们对青枯病和疫病病情指数和抗性水平,采用水培法培育幼苗并进行外源几丁质和flg22处理,检测各品种不同诱导时间下幼苗根系生长、气孔孔径、胼胝质沉积、活性氧(ROS)积累和SOD、CAT活性,以及先天免疫相关基因表达量的变化,综合评价其生理响应及其与抗病性关系.[结果](1)各品种幼苗青枯病和疫病病情指数以'川腾10号'最低,抗病性最强,以'本地条椒'最高,抗病性最弱.(2)外源几丁质和flg22抑制了各品种幼苗根系生长速率,诱导离体叶片气孔闭合,促进叶片细胞壁胼胝质沉积加厚,ROS含量持续增加,SOD和CAT活性不断提高.各品种幼苗先天免疫生理响应指标的平均隶属函数值以'川腾10号'最高,'本地条椒'最低,并且平均隶属函数值与疫病、青枯病病情指数均具有显著负相关性.(3)外源flg22和几丁质诱导'川腾10号'幼苗先天免疫相关基因CaWRKY22、CaMAPK7和ChiIV3显著上调表达.[结论]外源flg22和几丁质可诱导辣椒幼苗先天免疫生理响应,且响应程度强弱在品种间存在差异,依据生理响应指标通过隶属函数可综合评价辣椒品种的抗病水平;'川腾10号'的平均隶属函数值最高,多抗性水平最好,这与其先天免疫相关基因CaWRKY22、CaMAPK7和ChiIV3的显著上调表达有关.