目的 设计并合成具有抗突变型表皮生长因子(epidermal growth factor receptor,EGFR)驱动的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)活性的结构新颖的先导化合物.方法 一系列异羟肟酸类衍生物由起始原料4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶经 7 步化学反应合成而得,采用MTT法测定目标化合物在体外对野生型 EGFR(H460 和 A549)和突变型 EGFR(PC9、HCC827 和H1975)细胞系的抗增殖活性.结果 10 个异羟肟酸类目标化合物结构由NMR和MS谱鉴定确证.活性研究表明,以直链烷基取代的异羟肟酸衍生物(A1、A2 和A4-A6)能有效抑制突变型EGFR细胞系的增殖,而其他化合物如A3 和B1-B4 则无法有效抑制上述细胞的增殖.其中,化合物A4表现最优,不仅能高效抑制突变型EGFR细胞系PC9、HCC827 和H1975 细胞系的增殖,ID50 值小于7 μmol·L-1,与阳性对照N′-羟基-N-苯基辛二酰胺(SAHA)生物活性相似,而且选择性较好,其抑制野生型EGFR细胞系H460 和A549 增殖的ID50值大于32 μmol·L-1.结论 化合物A4 可作为突变型EGFR抑制剂的先导化合物进行深度开发.

目的:探究重组磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor，PLA2R）串联显性表位（PLA2RTD）在去除原发性膜性肾病（primary membranous nephropathy，PMN）抗PLA2R自身抗体（anti-PLA2R）中的作用。方法:在杆状病毒穿梭载体-昆虫细胞体系中表达重组蛋白分子PLA2RTD（富含半胱氨酸结构域、C型凝集素样结构域1和C型凝集素样结构域7），圆二色谱法测定PLA2RTD的二级结构，酶联免疫吸附测定法和免疫荧光法测定PLA2RTD的生物活性，环氧活化法耦联重组PLA2RTD与琼脂糖凝胶CL-6B微球以制备anti-PLA2R的特异性免疫吸附剂。结果:该研究实现了PLA2RTD在杆状病毒穿梭载体-昆虫细胞系统中的首次表达，证明了PLA2RTD具有良好的免疫原性和较高的结合特异性。PLA2RTD免疫吸附剂体外单次吸附可平均消除76.66%的anti-PLA2R［（6.66±0.30）RU/ml比（28.54±2.10）RU/ml］，吸附完成后血浆中IgG、IgA、白蛋白、β2微球蛋白、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的含量变化<4%，第2～3次重复使用时仍可保持65%左右的吸附效率。结论:基于PLA2RTD的特异性免疫吸附剂能够有效地清除血浆中anti-PLA2R，为特异性清除与PMN相关的自身抗体提供了一种新途径。

毛细管电泳技术具有高灵敏度和高分离效率，质谱技术能够提供样品的结构信息，将毛细管电泳与质谱技术联用，可具有强大的定性和定量分析能力。毛细管电泳-质谱技术的出现，使得人们能在纳升级样品水平，甚至单细胞层面，进行生物活性成分的结构分析和分子量的准确测定，是生物样本分析不可或缺的技术平台。随着该技术的发展，毛细管电泳-质谱分析方法在临床检验领域的应用开始崭露头角。

目的:观察体外高铁细胞培养环境以及小鼠铁蓄积状态下骨骼肌Sirtuin 3(SIRT3)表达的变化，探讨SIRT3下调在高铁负荷导致骨骼肌损伤中的作用。方法:以梯度浓度的枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate, FAC)干预小鼠成肌细胞C2C12，检测细胞增殖、凋亡，观察细胞形态，检测SIRT3 mRNA、蛋白以及活性水平；ICR小鼠随机分为对照组，FAC干预组以及FAC+去铁胺(deferoxamine, DFO)组。对照组予生理盐水干预；FAC组以FAC干预，再以生理盐水干预；FAC+DFO组在FAC后再以DFO干预，检测骨骼肌非血红素铁、SIRT3蛋白水平，测定肌细胞原位凋亡，观察骨骼肌形态。结果:C2C12细胞分化后在FAC的干预下，细胞的增殖活性下降( P<0.05)，细胞凋亡率升高( P<0.05)，SIRT3 mRNA、蛋白以及生物活性均下降( P<0.05)，细胞形态逐渐萎缩，肌管长度、数目逐渐减少。在在体研究中，FAC组小鼠骨骼肌非血红素铁含量与对照组相比增加( P<0.05)，FAC+DFO组与FAC组相比减少( P<0.05)；FAC组小鼠骨骼肌SIRT3蛋白含量与对照组相比减少( P<0.05)，FAC+DFO组与FAC组相比增加( P<0.05)；FAC组小鼠骨骼肌细胞凋亡指数与对照组相比上升，FAC+DFO组与FAC组相比下降( P<0.05)；FAC组骨骼肌组织较对照组相比，细胞排列紊乱，伴有脂肪沉积和炎细胞浸润，该病理改变在FAC+DFO组降铁干预后减轻。 结论:高铁负荷可导致骨骼肌损伤，其机制可能与SIRT3水平下调有关。

目的:研究羔羊胃维生素B12胶囊原料药的药效物质基础。方法:用0.9%氯化钠溶液提取，通过饱和硫酸铵沉淀，采用二乙基氨乙基纤维素52和高压液相色谱(HPLC)方法分离、纯化凝乳酶和胃蛋白酶。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和液相色谱-串联质谱测定相对分子质量。用HPLC分析原料药的氨基酸组成和抗氧化活性。依次用水、磷酸盐缓冲液和碳酸氢钠完全提取原料药，并进行体外1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐自由基消除活性测定。利用热水提法提取原料药中的糖蛋白，测定其对青春双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、粪肠球菌的促生长活性，分别用HPLC和气相色谱-质谱方法分析其氨基酸和单糖组成。结果:纯化得到2种不同离子强度的凝乳酶F6-2、F7-2和胃蛋白酶F7-1的酶活力分别为27 557.10、17 532.60和17 728.15 U/g；SDS-PAGE分析显示3种酶的相对分子质量相似，为35 000~40 000。原料中含有16种氨基酸，其中疏水性氨基酸占总氨基酸含量的33.03%。当样品浓度为5 g/L时，3种提取物的ABTS自由基清除活力分别为(37.80±0.45)%、(23.20±0.78)%、(62.80±0.74)%; DPPH自由基清除活力分别为(57.87±0.55)%、(5.03±0.25)%和(26.67±3.10)%。糖蛋白提取物对青春双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、粪肠球菌均有促生长作用，其中对德氏乳杆菌保加利亚亚种和粪肠球菌的促进作用差异均有统计学意义( P均<0.05)。糖蛋白的蛋白质链由15种氨基酸组成，多糖链由葡萄糖和乳糖2种单糖组成。 结论:利用多种色谱方法从羔羊胃原料药中分离、分析到至少2种凝乳酶和1种胃蛋白酶成分；原料药富含抗氧化活性成分；羔羊胃中糖蛋白成分具有体外促益生菌生长活性。

外泌体是细胞间进行信息通信交流的一种纳米级细胞外囊泡结构，其携带的多种生物活性分子的成分和含量根据起源细胞和受体细胞而变化，因此，外泌体可作为生物标志物进行测定。神经退行性疾病是一种起病隐匿的疾病，早期筛查和准确诊断无疑是降低其死亡率和提高治愈率的可靠保证。外泌体作为近几年的研究热点，依靠自身所具有的运输能力和内容物对于疾病的诊断治疗存在着巨大潜能，并且在丰度、稳定性、多样性和获取性方面具有显著优势。该文旨在讨论外泌体作为神经退行性疾病早期诊断的潜在候选者，从而阐述其应用的全新领域，以期为临床预测、治疗提供更加丰富的视角。

目的:原核表达GII.P16型诺如病毒RNA依赖RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）蛋白，并对其进行生物活性测定和晶体制备。方法:首先通过RT-PCR方法获得GII.P16 RdRp完整基因并将其克隆至携带His-Tag PET28a载体，构建重组表达质粒，然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，并用IPTG诱导RdRp的表达，最后利用SDS-PAGE和Western blot的方法鉴定蛋白的表达情况；采用His-Tag亲和层析和分子筛的方法纯化目的蛋白；分别使用体外酶催化实验和Hampton结晶试剂盒进行蛋白活性测定和晶体筛选。结果:构建了原核表达重组体PET28a-RdRp，并大量表达了相对分子质量约60 kDa的可溶性蛋白；经两次纯化后，获得了高纯度的目的蛋白，纯度达到90%以上；体外酶催化实验显示RdRp重组蛋白具有良好的生物活性；通过多种生长条件的筛选，获得了优质的RdRp晶体。结论:本研究成功获得的GII.P16 RdRp蛋白及其晶体，为理解其生物学功能和解析其晶体结构奠定了基础。

目的:比较超速离心法和尺寸排阻色谱法提取干细胞外泌体的产率、纯度、生物活性和促骨修复能力的差异.方法:采用超速离心法和尺寸排阻色谱法提取骨髓间充质干细胞外泌体,对外泌体的粒径、外观形貌和标志蛋白进行鉴定表征.采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定外泌体中蛋白含量,并采用血管生成因子芯片对外泌体中成血管相关蛋白进行分析.采用划痕实验和小管形成实验评价外泌体体外促血管生成能力,进一步在大鼠骨缺损模型中评价外泌体对骨修复再生的效果.结果:单位体积上清液中,超速离心法所得外泌体(Exo-UC)质量低于尺寸排阻色谱法所得外泌体(Exo-SEC)质量.电镜下见Exo-SEC中杂质蛋白少于Exo-UC中的杂质蛋白.Exo-UC中检测到16种成血管蛋白,Exo-SEC中检测到的成血管蛋白种类和含量均少于Exo-UC.与Exo-SEC比较,Exo-UC能够显著促进血管内皮细胞迁移和小管形成,并显著提升大鼠骨缺损部位的骨体积百分比和骨矿物质密度.结论:超速离心法提取的干细胞外泌体促新生血管形成能力更强,骨修复效果更佳.

目的 建立基于报告基因的抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法.方法 以WIL2-S细胞系作为靶细胞,以Jurkat-NF-KB-Luc转基因细胞系作为效应细胞,对抗体的量效范围、孵育时间、诱导时间、效靶比及细胞接种密度进行优化,构建可用于测定抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性的报告基因法.依据ICHQ2的指导原则对方法进行全面验证,包括专属性、准确性、精密度、线性、稳定性.结果 成功建立了具有量效关系的抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法,该方法的抗体起始浓度为500 ng/mL,稀释倍数为1∶4,共计8个浓度点(500,125,31.25,7.81,1.95,0.49,0.12,0.031 ng/mL),效靶比为4∶1,诱导时间为4 h.本方法具有良好的专属性;5个不同稀释组回收率样品经测定,相对效价分别为59.63％±4.57％,75.54％±4.05％,99.98％±9.63％,123.90％±5.54％和 142.51％±12.82％;对应的回收率分别为 93.17％±7.15％,94.42％±5.06％,99.98％±9.63％,99.12％±4.43％以及 91.21％±8.21％,CV 分别为 7.67％,5.35％,9.63％,4.47％和 9.00％,上述结果的变异系数CV值均＜10％;实测效价与理论效价线性回归分析相关系数R2=0.982 3,线性良好;本研究建立的方法可以敏感检测出抗体结构变化对生物活性的影响,对双特异性抗体的稳定性检测有一定的指导意义.结论 利用转基因细胞法成功建立了抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD3/CD20双特异性抗体生物学活性.

目的 阐明桑叶中具有降血糖活性的多糖结构基础,为桑叶的开发和利用提供理论基础.方法 采用水提醇沉法获得桑叶粗多糖,经离子交换色谱和凝胶渗透色谱分离纯化获得SY02、SY02-3、SY02-3A及SY02-3B等多糖组分,并测定均一多糖的理化性质;联合单糖组成分析、糖残基连接方式分析和核磁分析对桑叶多糖进行结构鉴定;采用棕榈酸(Palimitate,PA)诱导INS-1细胞凋亡模型、Caspase3/7活性试剂盒测定桑叶多糖对INS-1E细胞凋亡的保护作用,并运用Western blot法检测桑叶多糖对INS-1E细胞凋亡关键蛋白Cleaved Caspase 3表达的影响.结果 采用水提醇沉法获得桑叶粗多糖SY,经离子交换树脂柱分离再由凝胶柱纯化得到SY02-3,再次纯化后得到均一酸性多糖SY02-3A与蛋白多糖SY02-3B,两者分子量分别为3.7×104 Da和1.03×104 Da.单糖组成分析结果表明SY02-3A含有鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖,摩尔比分别为23.97∶33.85∶11.73∶5.04∶25.41,得率为0.32%;SY02-3B由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖与阿拉伯糖组成,其摩尔比19.83∶10.34∶45.42∶9.01∶2.23∶13.17,得率为2.00%;SY02-3B含有14种氨基酸,其中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸含量相对较高.生物活性研究表明SY02-3可以保护PA诱导的INS-1E细胞凋亡,这种作用可能与降低 Caspase 3 活性和下调 cleaved Caspase 3 蛋白表达有关.结论 桑叶中含有酸性肽聚糖(SY02-3A)和蛋白聚糖(SY02-3B)的桑叶多糖SY02-3具有抑制PA诱导的INS-1E细胞凋亡的作用.