目的 建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)衣壳蛋白电荷异质性的成像毛细管等电聚焦电泳(imaged capillary isoelectric focusing,iCIEF)检测方法,并进行方法验证,以期为rAAV产品的表征研究、质量控制及生产工艺稳定性的监控提供可靠的检测方法.方法 将待测样品经变性处理后,采用紫外荧光检测模式进行iCIEF分析,进样时间设为55 s,电压为1 500 V,聚焦时间为1 min;随后将电压调整至3 000 V,并继续聚焦10 min.激发波长设为280 nm,发射荧光检测曝光时间设为80 s.以rAAV 5型空心颗粒(rAAV-E)为待测样品,验证方法的专属性、精密性、线性范围、准确性及定量限.采用建立的方法检测rAAV 5型实心颗粒(rAAV-F)样品的电荷异质性.结果 rAAV-E样品在pH 6.9～7.1之间呈现2个明显主峰(Peak1和Peak2),空白对照未检测到病毒衣壳蛋白峰;6次重复检测rAAV-E样品2个主峰Peak1和Peak2的pI均值分别为6.91和7.04,RSD均为0.14％,峰面积百分比均值分别为35.6％和55.8％,RSD分别为1.1％和0.4％;3个时间点检测rAAV-E样品2个主峰Peak1和Peak2峰面积百分比的RSD 分别为 3.45％和 3.38％,pI 的RSD分别为0.10％和0.11％;rAAV-E浓度在(4.08～6.12)× 1012vp/mL范围内,与Peak1和Peak2的总峰面积均值呈良好的线性关系,线性回归方程为y=54 888 x-76 556,R2=0.976;80％、100％和120％预期浓度rAAV-E样品2个主峰总峰面积的回收率均在80％～120％范围内;Peak1的定量限为1.02× 1012 vp/mL,Peak2定量限为0.76 × 1012 vp/mL.rAAV-F样品呈现Peak1 和 Peak2外,在酸性区域(pI＜5.85)还观察到明显的额外峰,这是rAAV-F区别于rAAV-E的主要特征,也表明其具有复杂的电荷异质性分布.结论 建立的iCIEF法具有良好的专属性、精密性及准确性,可用于rAAV衣壳蛋白电荷异质性的分析.

目的 建立针对聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)化重组人源化抗肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)抗体(PEG-抗TNFα单抗)的关键质量属性质控方法.方法 采用肽图谱鉴别PEG-抗TNFα单抗,分子排阻高效液相色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法检测分子大小异质性,阳离子交换高效液相色谱(cation exchange-high performance liquid chromatography,CEX-HPLC)法检测电荷异质性,反相超高效液相色谱(reversed-phase-ultra performance liquid chromatography,RP-UPLC)法检测 PEG残留量及错配异构体含量;利用稳定转染TNFα相关受体下游反应元件驱动的报告基因的HEK293细胞测定生物学活性.结果 PEG-抗TNFα单抗具有相应的特征图谱,可用于鉴别;SEC-HPLC单体峰相对百分含量为(99.66±0.01)％,高分子量物质峰相对百分含量为(0.31±0.01)％,低分子量物质均低于定量限;CEX-HPLC主峰区峰相对百分含量为(98.31±0.10)％,酸性峰区峰相对百分含量为(1.31±0.04)％,碱性峰区峰相对百分含量为(0.38±0.07)％;PEG含量低于定量限,错配异构体含量为(0.76±0.007)％;生物学活性的半数最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)值为(2.22±0.11)ng/mL.结论 针对PEG-抗TNFα单抗的关键质量属性建立了相应的质量控制方法,可确保其安全、有效及质量可控,为该类单抗产品的质量控制方法和策略提供了参考.

糖基化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一,能够调控蛋白质的电荷态、结构及分子间相互作用等,进而影响其功能.糖基化的高度异质性导致传统的结构解析方法很难对糖蛋白进行全面表征.随着分析技术的发展,质谱在糖蛋白结构解析中发挥了重要作用.蛋白质组学质谱技术可在多肽水平上对复杂、低丰度蛋白质糖基化修饰的化学组成与位点信息进行鉴定.非变性质谱技术(native mass spectrometry,nMS)则直接在完整蛋白水平上揭示聚糖异质性及其对蛋白高级结构和相互作用的调控效应.作为结构质谱的代表性技术,基于离子淌度的nMS受益于离子淌度仪的构象分辨能力和构象去折叠功能,能够在非变性质谱的基础上提供离子的三维动态结构信息,为异构体结构快速鉴定提供不可替代的解决方案.本文重点介绍了两种新兴离子淌度质谱技术,即非变性动态构象分辨质谱技术和糖型分辨结构质谱技术,并以3种常见蛋白体系为例,介绍其在糖蛋白构象研究领域的最新进展.

目的 建立百日咳黏附素(pertactin,PRN)等电点(isoelectric point,pI)全柱成像毛细管等电聚焦电泳(whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing,WCID-CIEF)检测方法,并进行验证.方法 通过优化检测 PRN抗原WCID-CIEF过程中的聚焦时间、样品终浓度等参数,建立测定PRN抗原的WCID-CIEF方法,并对方法进行专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性验证.结果 PRN抗原pI WCID-CIEF测定方法的最佳聚焦时间为1 500 V预聚焦1 min,3 000 V聚焦3 min;体系中PRN抗原最佳终浓度为300 μg/mL.PRN抗原pI约为6.035,样品缓冲液在抗原各峰位置无干扰峰,方法的专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性均良好.结论 建立的WCID-CIEF方法适用于PRN抗原的pI检测及电荷异质性分析,可为PRN抗原的表征提供依据以及相关疫苗研发和生产过程中的质量控制提供参考.

纳米药物广泛应用于生物医学领域,尤其在肿瘤治疗方面表现出巨大的应用潜力.然而肿瘤处于极其复杂的微环境中,在其发展过程中胶原等物质不断沉积和重塑,导致肿瘤发展过程中细胞外基质力学特性发生明显改变.以往研究主要关注纳米药物特定的理化性质,例如粒径、电荷、形状、表面化学性质等对细胞摄取、细胞毒性以及体内药物动力学的影响.鲜有研究关注基质力学特性对纳米药物递送的影响.本综述从肿瘤基质力学的特征、检测方法对该领域的相关研究进行系统的总结,同时也对纳米药物递送过程中可能参与的力学生物学机制进行深入探讨,并提出几个值得重视的研究方向:策略上,重视基质力学-纳米力学的联合靶向递送,实现对药物的精确递送;空间上,重视实体肿瘤内部非线性的空间力学异质性,构建力学微环境适应性纳米载体,以提高递送效率;时间上,重视实体瘤发展、治疗过程中力学微环境动态发展与变化,根据患者个体肿瘤组织的基质力学特性,制定个体化的治疗策略,可以提高治疗的针对性和疗效;此外,可探索动态基质力学环境条件下力学靶向纳米药物递送、降解和代谢等问题.

重组蛋白分子表征的稳定性是保证疫苗发挥免疫原性及抗原性的关键.重组蛋白疫苗与治疗性蛋白制品一样,因体外合成和纯化过程的复杂性而表现出异质性.其中,电荷异质性是重组蛋白质的关键质量属性之一.电荷异质性监测有助于推动生产工艺的优化,反映产品生产的一致性和稳定性等,对保证重组蛋白产品的安全和质量至关重要.开发可靠快速、灵敏稳健的电荷异质性分析方法一直是生物制药行业所追求的目标.经典的电荷异质性分析方法主要有离子交换色谱(IEC)、毛细管区带电泳(CZE)以及全柱成像毛细管等电聚焦电泳(WCID-CIEF)等,其中WCID-CIEF提供的等电点(pI)和峰形的生化指纹有助于对疫苗多蛋白成分的分析.基于以上该文将对WCID-CIEF的原理和特点及其在重组蛋白疫苗质量控制中的应用进行概述.

目的 建立针对抗程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)/细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA-4)双特异性抗体的关键质量属性质控方法.方法 采用报告基因法测定PD-1靶点的细胞生物学活性,流式细胞荧光分选法测定CTLA-4靶点的竞争结合活性;还原/非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)和分子排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法进行抗体分子大小变异体的控制;成像毛细管等电聚焦电泳(imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis,iCIEF)法测定电荷异质性;运用肽图对抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体进行鉴别;超高效液相色谱法分析糖型.结果 PD-1靶点的细胞生物学活性半数最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)为(6.91±0.78)nmol/L,相对参比品的生物学效价为(103.50±13.08)％,RSD为12.64％;CTLA-4靶点活性的EC50为(0.35±0.28)nmol/L,相对参比品的生物学效价为(99.30±9.15)％,RSD为8.32％;还原CE-SDS的轻链与重链峰面积之和百分比为(98.86±0.02)％.非还原CE-SDS主峰峰面积百分比为(93.07±0.13)％,片段百分比为(4.44±0.13)％,聚体百分比为(2.49±0.15)％.SEC-HPLC单体的峰面积百分比为(97.20±0.01)％,聚体峰面积百分比为(2.68±0.01)％.iCIEF分析的A组峰面积百分比为(38.43±0.54)％,B组峰面积百分比为(43.26±0.32)％,C组峰面积百分比为(11.31±0.14)％,D组峰面积百分比为(7.00±0.17)％.肽图检测抗PD-1/CTLA-4抗体具有相应的特征图谱,能够用于鉴别.占比最高的糖型为GOF,含量为(41.06±0.11)％;含唾液酸的糖型共3种,分别为G2F+G1F-NANA、G2F-NANA和G2F-2NANA,含量分别为(12.44±0.12)％、(12.00±0.05)％和(5.37±0.05)％,含唾液酸糖型的总体含量为(29.80±0.20)％.结论 针对抗PD-1/CTLA-4双特异性抗体的关键质量属性建立了相应的质量控制方法,可确保其安全、有效和质量可控,为该类单抗产品的质量控制方法和策略提供了参考.

目的 揭示成骨不全Ⅰ型的分子遗传学发生机制.方法 分别选取致病基因COL1A1和COL1A2的一个EST片段作为种子,以NCBI中的EST数据库作为目标参考序列,用电子克隆的方法分别克隆两个基因,并对其编码的两种蛋白亚基的理化性质、氨基酸组成、二级和三级结构进行分析.结果 两种亚基虽然共同构成人Ⅰ型胶原蛋白,但两者之间相对分子量大小、等电点差别及氨基酸组成等差别较大;两者的相同点均包含信号肽序列,都带正电荷,都属于亲水性蛋白.结论 通过电子克隆得到的序列与实际序列之间存在误差,只能作为先期分析预测的参考,但是这种技术手段为具有高度遗传异质性的COL1A1和COL1A2基因致病机理的探索研究及疾病防患奠定了基础.

抗体药物常呈现微观不均一性,即“异质性”,包括糖基化、电荷、相对分子质量大小等相关的异构体.这些异构体绝大部分来自于“细胞工厂”对重组蛋白的翻译后修饰作用,如聚体、降解、糖基化修饰、氧化、脱酰基化、二硫键错配等.这些修饰不仅对抗体的质量、安全性和有效性均可能造成影响,而且也是整个抗体生产工艺的重要指征.本文对抗体糖基化、电荷及相对分子质量大小等异质性与药物有效性、安全性、药代动力学及免疫原性等的联系进行综述,有助于进一步认识抗体结构与功能关系,并希望为抗体药物尤其是生物类似药物的开发提供一定的依据和指导.

目的 通过基因重组表达的生物类似药GLP-1-Fc融合蛋白(YD057)与上市产品杜拉鲁肽进行关键质量属性比对研究,分析其有无显著差异.方法 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、分子排阻色谱法(SEC)、毛细管电泳法(CE-SDS)、毛细管等电聚焦(CIEF)分析其理化性质在相对分子质量、纯度、电荷异质性是否存在差异,通过肽图分析其在氨基酸一级序列是否一致,通过寡糖分布测定N糖修饰比例是否一致,在体外生物学活性测定以及GLP-1受体结合力分析来评价细胞学功能与分子结合力方面是否一致.结果 生物类似药(YD057)与杜拉鲁肽在理化性质、氨基酸一级序列、N糖修饰比例、细胞生物学功能与受体结合力都无显著差异.结论 两者关键质量属性(CQA)基本一致.