目的 分析外泌体微小RNA-877-5p(miR-877-5p)通过调控转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)轴诱导铁死亡对肝癌细胞增殖、凋亡的影响.方法 检测正常肝细胞与肝癌细胞株中miR-877-5p表达量,并对MHCC97H细胞进行转染,分为空白组、miR-877-5p抑制剂组、miR-877-5p模拟物组,检测各组铁死亡相关因子Nrf2、HO-1表达量,观察并分析各组MHCC97H细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡情况.结果 与正常肝细胞L02相比,肝癌细胞株中HEP3B、HCCLM3、HepG2、MHCC97H mRNA表达量降低(P<0.05);与肝癌细胞HEP3B、HCCLM3、HepG2相比,肝癌细胞MHCC97H mRNA表达量降低(P<0.05);与空白组相比,miR-877-5p抑制剂组miR-877-5p mRNA表达量、细胞凋亡率降低(P<0.05),溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达量、增殖活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及Nrf2、HO-1表达量升高(P<0.05),miR-877-5p模拟物组miR-877-5p mRNA表达量、细胞凋亡率升高(P<0.05),SLC7A11、GPX4的表达量、增殖活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及Nrf2、HO-1表达量降低(P<0.05);与miR-877-5p抑制剂组相比,miR-877-5p模拟物组miR-877-5p mRNA表达量、细胞凋亡率升高(P<0.05),SLC7A11、GPX4的表达量、增殖活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及Nrf2、HO-1的表达量降低(P<0.05).结论 上调外泌体miR-877-5p可抑制Nrf2/HO-1轴的激活,促使铁死亡,抑制肝癌细胞增殖,加快癌细胞的凋亡速度.

目的 探究抑制miR-206对子痫前期滋养细胞HTR-8/Svneo增殖、凋亡及侵袭能力的影响.方法 体外培养人绒毛膜滋养细胞HTR-8/Svneo细胞系,将其分为对照组、缺氧组、缺氧+阴性对照(NC)组和缺氧+miR-206抑制剂(miR-206 inhibitor)组4组.miR-206相对表达量、增殖、凋亡和侵袭情况分别采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)、Hoechst 33258染色法和Transwell小室测定.E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)相对表达量使用蛋白质印迹技术法测定.结果 经过转染及氯化钴(CoCl2)处理后,缺氧组miR-206、E-cadherin和Caspase-3表达及凋亡细胞数均高于对照组,而细胞增殖率、相对侵袭率及Vimentin、N-cadherin和Cyclin D1表达水平均低于对照组(P<0.05).与缺氧+NC组相比,缺氧+miR-206 inhibitor组miR-206、E-cadherin和Caspase-3表达水平及凋亡细胞数明显降低(P<0.05),而细胞增殖率、相对侵袭率及Vimentin、N-cadherin和Cyclin D1表达水平明显增加(P<0.05).结论 抑制miR-206可能通过促进上皮间质转化(EMT),下调Caspase-3表达水平和上调Cyclin D1蛋白水平来促进缺氧条件下HTR-8/Svneo细胞的增殖和侵袭能力,抑制其凋亡能力.

目的 用生物信息学方法预测脂肪酸结合蛋白4(FABP4)的上游调控miRNA,体外培养子宫内膜癌细胞Ishikawa,了解微小核糖核酸-409-3p(miR-409-3p)是否通过抑制FABP4的表达水平,进而影响Ishikawa细胞的生物学行为.方法 实验分为control组、miR-409-3p mimics组、miR-409-3p inhibitor组、miR-409-3p NC组、FABP4-OE组及FABP4-shRNA组6组,采用实时定量聚合酶链式反应及蛋白质印迹法检测miR-409-3p及FABP4在Ishikawa中的表达情况;采用细胞增殖实验(CCK-8)、细胞侵袭及迁移实验(Transwell法)检测miR-409-3p与FABP4对Ishikawa细胞增殖、侵袭以及迁移能力的影响;用双荧光素酶报告基因实验在Ishikawa细胞中检测miR-409-3p对FABP4的调控作用.结果 1)在Ishikawa细胞中下调FABP4的表达后,Ishikawa细胞的增殖、侵袭和迁移能力均显著降低(P<0.05);在Ishikawa细胞中上调FABP4的表达后,Ishikawa细胞的增殖、侵袭和迁移能力均显著升高(P<0.05).2)在Ishikawa细胞中转染miR-409-3p mimics后,FABP4的表达水平以及Ishikawa细胞的增殖、侵袭和迁移能力均显著降低(P<0.05);而转染miR-409-3p inhibitor后,FABP4的表达水平以及Ishikawa细胞的增殖、侵袭和迁移能力均显著升高(P<0.05).3)双荧光素酶报告基因结果显示,在Ishikawa细胞中miR-409-3p可靶向调控FABP4.结论 高表达的FABP4促进Ishikawa细胞增殖、侵袭及迁移,miR-409-3p可通过下调FABP4的表达进而抑制Ishikawa细胞发生转移.

目的 探讨环状人网状蛋白4(CircRTN4)调节miR-582-5p/神经纤毛蛋白1(NRP1)轴对结直肠癌(CRC)细胞恶性生物学行为的影响.方法 选取2019年1月至2023年1月河南科技大学第一附属医院收治的CRC患者50例,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹法分别检测患者的癌组织、癌旁组织、人正常结肠黏膜上皮细胞和CRC细胞中CircRTN4、miR-582-5p mRNA及NRP1的蛋白表达;将SW480细胞分别转染si-RTN4、miR-582-5p inhibitor及相应对照,qRT-PCR检测转染效率;通过平板克隆实验、Transwell小室和流式细胞仪等研究CircRTN4对CRC细胞的影响;蛋白质免疫印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及NRP1蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验检测miR-582-5p与RTN4和NRP1的作用;构建肺癌裸鼠模型,分析敲低RTN4对肿瘤质量、体积及移植瘤中miR-582-5p、NRP1、Ki-67蛋白表达的影响.结果 在CRC组织和细胞系中,RTN4、NRP1表达升高,miR-582-5p表达降低(P<0.05);敲低RTN4,降低SW480细胞迁移、增殖与侵袭,下调PCNA、Bcl-2、MMP-2、NRP1表达,促进miR-582-5p、Bax表达及细胞凋亡(P<0.05);miR-582-5p作为RTN4靶点,下调miR-582-5p可减弱RTN4敲低对SW480细胞恶性行为的抑制作用(P<0.05);体内实验显示,抑制RTN4可降低移植瘤质量和体积,降低Ki-67、NRP1表达水平,升高miR-582-5p表达(P<0.05).结论 在CRC组织和细胞系中,CircRTN4高表达,敲低CircRTN4可能通过调节miR-582-5p/NRP1轴抑制CRC细胞的恶性行为.

目的 探讨线粒体核糖体蛋白L3(MRPL3)与肺癌细胞增殖及迁移能力的关系.方法 从癌症基因组图谱(TCGA)数据库和在线网站UALCAN获得MRPL3在各肿瘤组织和癌旁组织中的表达水平.构建过表达MRPL3慢病毒转染H1299细胞株,构建敲低MRPL3慢病毒转染HCC827细胞株.采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证细胞株是否构建成功.采用CCK-8法检测肺癌细胞的增殖能力,Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力.结果 生物信息学分析显示,MRPL3在肺腺癌组织中的表达水平明显高于邻近正常组织,MRPL3在各肿瘤组织中的表达水平普遍高于癌旁组织.对体外培养肿瘤细胞进行检测,过表达MRPL3肺癌细胞的增殖及迁移能力高于对照组,敲低MRPL3肺癌细胞的增殖及迁移能力低于对照组.结论 MRPL3过表达对肺癌细胞的增殖及迁移起到促进作用.

目的 构建稳定表达Cas9蛋白的工具细胞,并利用短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)编辑技术改造1型单纯疱疹病毒(HSV-1),获得ICP34.5基因敲除的oHSV-1/Ecfp重组病毒.方法 利用慢病毒包装体系,将包装Cas9表达质粒的病毒感染HEK293T细胞,然后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞株,通过聚合酶链式反应(PCR)及蛋白质免疫印迹技术检测Cas9基因及蛋白表达情况;利用分子克隆技术构建HSV-1病毒ICP34.5基因敲除的基因编辑质粒(pU6-Ecfp);pU6-Ecfp转染293T-Cas9细胞后感染野生型HSV-1病毒,在胞内通过CRISPR/Cas9技术敲除HSV-1病毒中ICP34.5基因,再利用增强型青色荧光(Ecfp)示踪及极限稀释法进行病毒富集纯化,通过PCR法进行oHSV-1/Ecfp病毒鉴定.结果 PCR扩增、核酸电泳及蛋白质免疫印迹技术结果显示,细胞株293T-Cas9高转录Cas9基因及高表达Cas9蛋白;通过PCR鉴定及荧光示踪结果显示,基因编辑质粒pU6-Ecfp构建成功;Ecfp荧光示踪、PCR扩增及核酸电泳结果显示,Ecfp成功插入ICP34.5基因敲除位点,获得oHSV-1/Ecfp重组病毒.结论 稳定表达Cas9蛋白的293T-Cas9细胞可作为CRISPR/Cas9基因编辑的工具细胞,构建的HSV-1/Ecfp病毒实现了ICP34.5基因敲除及Ecfp示踪蛋白的敲入.

目的 探讨siRNA沉默DJ-1基因体内外对人胃癌MGC803细胞的影响机制.方法 构建沉默DJ-1基因MGC803细胞;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、平板克隆、细胞划痕和侵袭实验检测沉默DJ-1基因对MGC803细胞增殖、克隆形成、迁移与侵袭的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法检测DJ-1、PTEN、Akt、p-Akt、Snail、Vimentin、E-cadherin、基质金属蛋白酶9(MMP-9)与基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)的表达;相差显微镜观察DJ-1沉默对MGC803细胞形态学的影响;裸鼠实验检测DJ-1沉默对MGC803细胞移植瘤的影响.结果 分别用4组si-DJ-1及si-NC质粒转染MGC803细胞,其中si-DJ-1A组DJ-1 mRNA与蛋白表达下调较为显著(P＜0.001),则后续选用si-DJ-1A作为稳定沉默DJ-1基因MGC803细胞.MTT法检测结果显示,24、48和72 h后,si-DJ-1组增殖活性分别较MGC803对照组和si-NC组降低,均P＜0.001.克隆形成实验显示,si-DJ-1组克隆形成数较对照组与si-NC组减少,P＜0.001.划痕实验结果显示,si-DJ-1组迁移距离[(199.21±14.74)μm]较对照组[(302.62±17.70)μm]和si-NC组[(304.49+13.55)μm]缩短,P＜0.001.侵袭实验显示,si-DJ-1组侵袭细胞数[(44.80±5.10)个]较对照组[(83.80±5.80)个]和 si-NC 组[(82.80±5.80)个]减少,P＜0.001.与对照组和 si-NC 组相比,si-DJ-1 组 DJ-1 mRNA(F=18.350,P=0.003)、Snail mRNA(F=26.320,P＜0.001)、Vimentin mRNA(F=44.379,P＜0.001)与 MMP-9 mRNA(F=57.450,P＜0.001)下调,而 E-cadherin mRNA(F=94.529,P＜0.001)与 TIMP3 mRNA(F=16.480,P=0.004)上调;si-DJ-1 组 DJ-1(F=6.393,P=0.004)、p-Akt(F=12.980,P=0.007)、Snail(F=381.000,P＜0.001)、Vimentin(F=99.750,P＜0.001)与 MMP-9(F=126.800,P＜0.001)蛋白下调,而 PTEN(F=36.880,P＜0.001)、E-cadherin(F=181.000,P＜0.001)与TIMP3(F=217.800,P＜0.001)上调.相差显微镜显示,si-DJ-1组纤维母细胞样长梭形细胞肿瘤干细胞减少,圆形与椭圆形细胞增多,异型性下降.体内实验表明,si-DJ-1组移植瘤生长速度较对照组减慢,si-DJ-1 组移植瘤质量[(0.51±0.05)g]较对照组[(0.90±0.16)g]减小,t=5.273,P＜0.001.si-DJ-1 组较对照组 DJ-1、Ki-67、Vimentin和CD-34阳性表达降低,而PTEN和E-cadherin表达增强.结论 DJ-1沉默可通过PTEN/Akt通路体内外抑制MGC803细胞增殖、迁移、侵袭与上皮细胞-间充质转化.

目的 观察心康冲剂含药血清对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞(CFs)增殖的影响,基于GAS5-miR-21探讨其抑制CFs增殖的作用机制.方法 取SD乳鼠心肌,差速贴壁法分离CFs,采用血管紧张素Ⅱ诱导CFs增殖,在转染微小RNA-21(miR-21)过表达慢病毒、生长阻滞特异性转录本5(GAS5)沉默慢病毒后,分别用心康冲剂含药血清干预24 h.CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,免疫荧光染色检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,RT-qPCR检测GAS5、miR-2l、磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)mRNA表达,Western blot检测PTEN、Akt、周期蛋白D1(Cyclin D1)和周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)蛋白表达.结果 与空白组比较,模型组CFs细胞活力增强,G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,α-SMA阳性表达升高,GAS5、PTEN mRNA及PTEN蛋白表达降低,miR-21 mRNA及Akt、Cyclin D1、CDK4蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05).与模型组比较,心康冲剂组CFs细胞活力减弱,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,α-SMA阳性表达降低,GAS5、PTEN mRNA及PTEN蛋白表达升高,miR-21 mRNA及Akt、Cyclin D1、CDK4蛋白表达降低;miR-21过表达组和GAS5沉默组CFs细胞活力增强,G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,α-SMA阳性表达升高,GAS5、PTEN mRNA及PTEN蛋白表达降低,miR-21 mRNA及Akt、Cyclin D1、CDK4蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05).与miR-21过表达组、GAS5沉默组比较,miR-21过表达+心康冲剂组、GAS5沉默+心康冲剂组CFs细胞活力减弱,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,α-SMA阳性表达降低,GAS5、PTEN mRNA及PTEN蛋白表达升高,miR-21 mRNA及Akt、Cyclin D1、CDK4蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 心康冲剂含药血清可抑制沉默GAS5所致miR-21、Akt表达升高,对抗过表达miR-21所致GAS5和PTEN表达降低,抑制CFs增殖周期,促进GAS5发挥"分子海绵"作用,改善血管紧张素Ⅱ诱导的CFs过度增殖.

目的:探讨同源盒家族中的人类同源盒C6(HOXC6)基因在前列腺癌中的表达情况及其对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及机制.方法:应用基于基因表达水平值的交互式分析平台(GEPIA)数据库中关于HOXC6 研究的数据,对其在前列腺癌中的表达水平变化进行分析.采用GEPIA数据库分析HOXC6 表达水平与前列腺癌患者生存预后之间的关系.通过Western印迹检测HOXC6 蛋白在前列腺癌组织、正常前列腺组织及不同前列腺癌细胞株 DU-145、PC-3 以及正常人前列腺上皮细胞 RWPE-1 中的表达情况.在人前列腺癌细胞DU145、PC-3 和正常人前列腺上皮细胞RWPE-1 中,利用siRNA质粒稳定干扰HOXC6 基因表达,采用CCK8、平板克隆、划痕、Transwell侵袭实验检测HOXC6 基因对前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响.通过GEPIA数据库分析Wnt抑癌因子分泌型卷曲相关蛋白 1(SFRP1)基因与 HOXC6 的相关性,采用 Western 印迹检测 HOXC6-siRNA转染后PC-3 细胞中HOXC6、SFRP1、Wnt及β-catenin蛋白表达.结果:HOXC6 在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织(P<0.01),在前列腺癌细胞中的表达高于正常前列腺上皮细胞(P<0.01).结合生物信息学分析,HOXC6 高表达的PCa患者比低表达的生存率低(P=0.011).siRNA组HOXC6 蛋白相对表达量、吸光度值、克隆形成数、侵袭细胞数低于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05).通过GEPIA数据库发现SFRP1 高表达的前列腺癌患者预后较好,在体外实验中,前列腺癌PC-3 细胞系中,Western印迹分析Wnt及β-catenin蛋白的表达均上升,SFRP1 蛋白表达明显下降(P<0.05);与siRNA-NC、前列腺癌PC-3 相比,siRNA-HOXC6 转染组中的Wnt及β-catenin蛋白的表达均明显下降,SFRP1 蛋白表达上升(P<0.05).结论:HOXC6 在前列腺癌组织中高表达,并与前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭有关;HOXC6 通过抑制 SFRP1/Wnt/β-catenin信号通路从而促进前列腺癌DU145、PC-3 细胞的生长,HOXC6 有可能是临床治疗前列腺癌的潜在靶标.

目的 探讨卷曲跨膜受体蛋白2(FZD2)在小鼠舌鳞癌中的功能,及其对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)单抗治疗的影响.方法 细胞实验:SCCVII小鼠舌鳞癌细胞分为空白对照组(转染LV-kdCon)和实验组(转染LV-kdFZD2).用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞增殖能力,用Transwell小室实验检测迁移能力,用人脐静脉内皮细胞验证血管生成能力.动物实验:雌性C3H/He小鼠构建荷瘤小鼠模型,分为对照组[给予磷酸盐缓冲液注射(PBS)]、kdFZD组(接种实验组细胞并给予等量PBS注射)、αCTLA4组(小鼠皮下接种空白对照组细胞并给予CTLA4单抗注射)和kdFZD+αCTLA组(小鼠皮下接种实验组细胞并给予CTLA4单抗注射).用定量聚合酶链反应检测肿瘤组织mRNA相对表达水平,测量肿瘤体积和质量.结果 空白对照组和实验组细胞中FZD2 mRNA相对表达水平分别为1.01±0.18和0.52±0.18,细胞迁移数为(466.70±44.10)和(160.00±26.46)个,人脐静脉内皮上皮细胞形成的小管分支节点数分别为(108.70±6.35)和(84.33±10.02)个,总毛细血管长度分别为(20 235±2 229)和(16 549±338)pm,组间比较,在统计学上差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).对照组、kdFZD 组、αCTLA4 组和 kdFZD+αCTLA 组肿瘤体积分别为(449.50±114.80)、(131.10±13.49)、(83.62±26.47)和(2.45±0.91)mm3,肿瘤质量分别为(0.78±0.11)、(0.22±0.06)、(0.13±0.02)和(0.03±0.01)g,组间比较,在统计学上差异均有统计学意义(P＜0.001,P＜0.000 1).结论 FZD2可作为潜在的舌鳞癌治疗靶点,有望成为舌鳞癌辅助免疫治疗优化的关键分子.