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一例火棉胶样婴儿 TGM1基因变异的致病性研究
编辑人员丨3天前
目的:探讨1个先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病家系的遗传学病因。方法:对1例火棉胶样婴儿进行全外显子组测序,Sanger测序验证基因变异位点。应用PolyPhen-2、PROVEAN和Mutation Taster软件以及蛋白同源建模方法预测基因变异的性质;实时荧光定量PCR和Western印迹法分析变异对等位基因mRNA与蛋白表达量的影响。结果:全外显子组测序与Sanger验证结果证实患儿 TGM1基因第6外显子存在c.919C>T(p.Arg307Trp)变异,第7外显子存在c.1019G>A(p.Gly340Glu)变异,且两变异等位基因分别遗传自其母亲与父亲。生物信息学预测提示两种变异均对蛋白结构有害,蛋白同源建模结果进一步证实上述结论。体外实验显示转染野生型质粒与转染c.919C>T或c.1019G>A突变型质粒的293T细胞 TGM1基因mRNA表达量差异无统计学意义( t值分别为1.97、1.28, P值分别为0.12、0.27),但转染突变型TGM1质粒的细胞TGase1蛋白含量显著下降。 结论:TGM1基因c.919C>T与c.1019G>A变异可能是该严重鱼鳞病患儿的分子遗传学病因,其编码的错义氨基酸可能通过破坏TGase1蛋白结构,从而影响蛋白功能。
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编辑人员丨3天前
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转化生长因子-β受体Ⅱ环状RNA通过调节核糖核酸结合蛋白2/胚胎致死性异常视觉样蛋白1促进前列腺癌发生发展
编辑人员丨3天前
目的:探讨前列腺癌细胞中转化生长因子-β受体Ⅱ环状RNA(circTGFBR2)调节核糖核酸结合蛋白2(PTBP2)/胚胎致死性异常视觉样蛋白1(ELAVL1)激活SMAD2信号途径促进前列腺癌发生发展。方法:利用生物信息学方法,寻找与circTGFBR2结合microRNA以及其他相关蛋白结合位点,以及与PTBP2存在相互作用的RNA结合蛋白。PC3转染pcDNA3.1-circTGFBR2后,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测circTGFBR2的表达。PC3细胞过表达circTGFBR2同时敲低微小RNA(microRNA,miR)-29b,蛋白质印迹法(Western blot)检测ALK5、SMAD2及p-SMAD2表达。PC3分别转染pcDNA3.1-circTGFBR2及对照质粒后,利用circTGFBR2特异性探针进行pulldown,检测PTBP2与circTGFBR2的相互作用。过表达circTGFBR2与ELAVL1,检测细胞上皮-间充质转化(EMT)的标志基因E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及ZMYM1表达,以及Transwell检测细胞迁移。组间比较应用单因素方差分析。结果:分析结果显示circTGFBR2存在多个miR-29b结合的位点,ALK5(又名TGFBR1)mRNA 3’端非编码区(3’UTR)同样存在miR-29b的结合位点,并证实PTBP2与另一个RNA结合蛋白ELAVL1存在相互作用。用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激PC3细胞发现,circTGFBR2的表达高于对照组(1.83±0.02比1.03±0.02, F=2 832.200, P<0.01)。PC3分别转染pcDNA3.1-circTGFBR2及对照质粒后,RT-qPCR检测circTGFBR2的表达,可见circTGFBR2组高于对照组(176.41±1.21比1.04±0.02, F=63 426.15, P<0.01)。应用miR-29b抑制剂或circTGFBR2处理细胞后ALK5的蛋白水平明显高于对照组,应用miR-29b抑制剂同时过表达circTGFBR2后进一步增加ALK5的表达(分别为0.15±0.01、0.48±0.02、0.55±0.01、0.74±0.01, F=1268.314, P<0.01),并且SMAD2(分别为1.14±0.02、1.28±0.02、1.42±0.01、1.5±0.25, F=4.852, P<0.01)和p-SMAD2(分别为0.18±0.02、0.36±0.01、0.65±0.01、0.94±0.02, F=1663.667, P<0.01)的磷酸化水平也呈相同趋势。Pulldown-MS实验,多个蛋白质能与circTGFBR2结合,并证实PTBP2与circTGFBR2相互作用。与对照组比较,敲低前列腺癌细胞PTBP2或过表达circTGFBR2时,间质标志基因Vimentin表达高于对照组,而上皮样标志基因E-cadherin表达低于对照组,当同时过表达circTGFBR2并敲低PTBP2会逆转上述结果(Vimentin分别为0.22±0.02、0.87±0.02、0.85±0.02、0.6±0.01, F=1319.52, P<0.01;E-cadherin分别为0.80±0.01、0.45±0.03、0.36±0.02、0.9±0.02, F=614.919, P<0.01)。当过表达circTGFBR2或高表达ELAVL1时,PTBP2与ELAVL1的相互作用减弱,细胞EMT的标志基因E-cadherin表达低于对照组,Vimentin及ZMYM1表达高于对照组,Transwell检测细胞迁移高于对照组,而当同时高表达ELAVL1及circTGFBR2时,上述趋势会进一步增强(Vimentin分别为0.22±0.02、0.87±0.02、0.85±0.02、0.6±0.01, F=1 319.52, P<0.01;E-cadherin分别为0.93±0.02、0.76±0.02、0.43±0.02、0.27±0.01, F=1 108.46, P<0.01;ZMYM1分别为0.24±0.01、0.53±0.02、0.32±0.01、1.04±0.02, F=2 023.794, P<0.01)。 结论:circTGFBR2通过调节PTBP2/ELAVL1激活SMAD2信号途径促进前列腺癌发生发展。
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编辑人员丨3天前
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miRNA-205在慢性肾脏病患者血管钙化中的作用及诊断价值
编辑人员丨3天前
目的:探讨miRNA-205在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者血管钙化中的作用及诊断价值。方法:该研究分为体外细胞实验和回顾性队列研究。采用大鼠胸主动脉平滑肌细胞进行体外实验,茜素红染色法、钙含量检测血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的钙化情况,碱性磷酸酶检测试剂盒测定碱性磷酸酶活性,Western印迹检测VSMCs成骨转录因子Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22α,SM-22α)的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测VSMCs中miRNA-205和Runx2的表达含量。双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-205与Runx2的靶向关系。回顾性选择2020年6月至2021年1月河北医科大学第四医院肾内科的CKD 3~5期非透析患者,并按照冠状动脉钙化积分(coronary artery calcium score,CACs)将患者分为无钙化组(CACs=0)、轻中度钙化组(0
400)。采用Spearman相关分析法评价血清miRNA-205、Runx2与CKD患者血管钙化的相关性,Logistic回归模型及受试者工作特征曲线分析miRNA-205预测CKD患者血管钙化的价值。结果:(1)与对照组相比,高磷组VSMCs钙结节较多,钙含量、碱性磷酸酶活性、Runx2蛋白表达均显著较高,α-SMA、SM-22α蛋白及miRNA-205表达水平均较低(均 P<0.05)。过表达miRNA-205时,VSMCs钙化减轻,α-SMA和SM22α蛋白表达水平均升高,Runx2蛋白表达水平降低(均 P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miRNA-205-5p过表达后野生型Runx2 3’端非编码区质粒荧光素酶活性降低。(2)纳入CKD患者80例,年龄(57.50±14.93)岁,其中男性49例(61.3%)。无钙化组( n=26)、轻中度钙化组( n=30)和重度钙化组( n=24)患者miRNA-205和Runx2表达水平比较结果显示,钙化程度越高,miRNA-205表达水平越低,Runx2 mRNA表达水平越高(均 P<0.05)。血清miRNA-205与CACs呈负相关( r=-0.50, P<0.01),Runx2与CACs呈正相关( r=0.55, P<0.01)。多因素Logistic回归分析结果显示,miRNA-205( OR=0.451,95% CI 0.122~0.873)是CKD患者发生血管钙化的独立影响因素。miRNA-205和miRNA-205联合Runx2预测血管钙化的受试者工作特征曲线下面积分别为0.796(95% CI 0.697~0.859)和0.924(95% CI 0.866~0.982)。 结论:miRNA-205通过靶向Runx2负向调控VSMCs成骨样表型转化进而抑制血管钙化,有望成为早期诊断CKD患者血管钙化的生物标志物。 ...不再出现此类内容
编辑人员丨3天前
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衰老皮肤中ⅩⅦ型胶原蛋白α1对表皮干细胞的影响及微小RNA干预机制
编辑人员丨3天前
目的:探讨ⅩⅦ型胶原蛋白α1(COL17α1)在小鼠衰老皮肤中的表达与作用及其对人表皮干细胞(ESC)干性和增殖能力的影响,并且探讨相关微小RNA(miR)干预人ESC中COL17α1表达的机制。方法:采用实验研究方法。取2个月龄(青年)和24个月龄(老年)雄性C57BL/6J小鼠各12只,取其胸背部全层皮肤标本进行后续检测。对青年小鼠和老年小鼠全层皮肤标本,行苏木精-伊红染色后观察表皮层结构并测量表皮厚度,用透射电子显微镜观察表皮基底膜形态和半桥粒并行半桥粒计数,分别采用实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法与蛋白质印迹法检测COL17α1的mRNA与蛋白表达,采用免疫荧光法观测COL17α1的蛋白表达与分布。取于解放军总医院第四医学中心行包皮切除手术的3名20~30岁健康男性术后弃用的新鲜包皮组织,提取ESC,取生长良好的细胞进行后续实验。按随机数字表法(分组方法下同)将ESC分为进行相应处理的空白对照组、转染试剂对照组、空载体质粒组、敲低COL17α1质粒组,培养48 h后,采用实时荧光定量RT-PCR法检测COL17α1的mRNA表达,采用蛋白质印迹法检测COL17α1和细胞角蛋白14(CK14)的蛋白表达,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖水平。通过DIANA、miRTarBase、miRNAMap、TargetScan、microRNA数据库筛选可能作用于 COL17α1 mRNA 3'非编码区的miR。将ESC分为转染miR模拟物阴性对照物的阴性对照组和转染前述筛选出的各miR的模拟物的各miR模拟物组,转染后48 h,通过蛋白质印迹法检测COL17α1的蛋白表达。基于基因表达综合数据库(GEO)的miR测序数据集GSE114006,使用GEO2R工具统计分析前述筛选出的可造成COL17α1蛋白表达下降的miR在30名青年(18~25岁)人和30名老年(>70岁)人皮肤中的表达。取青年小鼠和老年小鼠全层皮肤标本,采用实时荧光定量RT-PCR法检测前述老年人皮肤中表达增多的miR的表达。取2批ESC,第1批分为COL17α1野生型+miR-203b-3p阴性对照组与COL17α1野生型+miR-203b-3p模拟物组,第2批分为COL17α1突变型+miR-203b-3p阴性对照组与COL17α1突变型+miR-203b-3p模拟物组,分别转染对应序列,48 h后,采用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测COL17α1的基因表达水平。组织实验中样本数均为6,细胞实验中样本数均为3。对数据行独立样本 t检验、单因素方差分析、LSD检验或Dunnett检验、Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验。 结果:与青年小鼠比较,老年小鼠皮肤表皮层与真皮层分界模糊且细胞层次较少,表皮层厚度明显变薄( Z=-2.88, P<0.01),基底膜形态不连续,表皮-真皮连接处半桥粒较少且分布不均,半桥粒数量明显减少( Z=-2.91, P<0.01),COL17α1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低( t值分别为10.61、6.85, P<0.01)。与青年小鼠比较,老年小鼠皮肤表皮基底层和毛囊球部的COL17α1蛋白表达均明显减少( Z=-2.24, P<0.05)。培养48 h后,空白对照组、转染试剂对照组、空载体质粒组、敲低COL17α1质粒组ESC中COL17α1的蛋白表达水平分别为1.00±0.27、1.12±0.21、1.13±0.23、0.42±0.18。相较于空白对照组,转染试剂对照组和空载体质粒组ESC中COL17α1的mRNA和蛋白表达水平、CK14的蛋白表达水平及ESC增殖水平均未发生明显变化( P>0.05),敲低COL17α1质粒组ESC中这些指标均明显降低( P<0.05或 P<0.01)。miR-203a-3p、miR-203b-3p、miR-512-5p、miR-124-3p、miR-28-5p、miR-590-3p、miR-329-5p可能结合 COL17α1 mRNA的3'非编码区。转染48 h后,与阴性对照组的1.000±0.224比较,miR-329-5p模拟物组、miR-203b-3p模拟物组和miR-203a-3p模拟物组ESC中COL17α1的蛋白表达水平明显降低(0.516±0.188、0.170±0.025、0.235±0.025, t值分别为3.17、5.43、5.07, P<0.05或 P<0.01)。老年人皮肤中仅miR-203b-3p表达水平明显高于青年人( t=3.27, P<0.01)。老年小鼠皮肤中miR-203b-3p表达水平明显高于青年小鼠( Z=-2.88, P<0.01)。转染后48 h,COL17α1野生型+miR-203b-3p模拟物组ESC中COL17α1的基因表达水平明显低于COL17α1野生型+miR-203b-3p阴性对照组( t=7.66, P<0.01),COL17α1突变型+miR-203b-3p模拟物组ESC中COL17α1的基因表达水平与COL17α1突变型+miR-203b-3p阴性对照组相近( P>0.05)。 结论:COL17α1的mRNA和蛋白表达水平随小鼠年龄增长而减少,可能导致小鼠ESC脱离表皮基底膜。COL17α1的表达减少可抑制CK14的表达与ESC增殖,这可能是老年人皮肤中表皮层变薄和创面愈合减慢的原因。小鼠衰老皮肤中表达增多的miR-203b-3p可以靶向结合 COL17α1 mRNA的3'非编码区,阻碍转录后翻译过程,造成COL17α1蛋白表达减少。
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编辑人员丨3天前
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长基因间非蛋白质编码RNA525在结直肠癌组织的表达及其对结直肠癌细胞增殖、侵袭的影响
编辑人员丨3天前
目的:观察长基因间非蛋白质编码RNA525(LIN00525)在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞体外增殖、侵袭的影响。方法:收集2018年8月至2018年12月于复旦大学附属肿瘤医院大肠外科诊治患者的50对结肠癌及癌旁组织,通过实时定量聚合酶链式反应(Real time-PCR)检测50对样本中LINC00525的表达并分析其表达水平与临床病理参数的相关性;将LINC00525的过表达质粒转染SW480细胞,敲减质粒转染HCT-8细胞,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)增殖实验、Transwell侵袭实验观察LINC00525对SW480及HCT-8细胞体外增殖、侵袭力的影响;通过蛋白质印迹法(Western blot)实验检测增殖相关分子增殖细胞核抗原(PCNA)及侵袭相关分子基质金属蛋白酶(MMP)-2的表达探索LINC00525调控结直肠癌细胞增殖、侵袭的分子机制;应用SPSS 20.0统计软件分析,临床资料分析使用 χ2检验,两样本均数间的比较采用Student’ t检验。 结果:50对结直肠癌组织中LINC00525的表达显著高于癌旁组织(0.721±0.028比0.204±0.016, t=15.860, P<0.01),差异有统计学意义;LINC00525的表达水平与结直肠癌淋巴转移呈正相关( χ2=10.092, P<0.01),差异有统计学意义;CCK-8实验结果显示LINC00525高表达组的吸光度( A)值显著高于对照组(2.163±0.101比1.250±0.035, t=8.525, P<0.01),差异有统计学意义;敲减LINC00525组的 A值显著低于对照组(0.717±0.102比1.483±0.103, t=5.305, P<0.01),差异有统计学意义;Transwell侵袭实验结果提示过表达LINC00525组的侵袭细胞数量显著高于对照组(45.670±6.936比87.670±4.910, t=4.942, P<0.01),差异有统计学意义;敲减LINC00525组的细胞侵袭数量显著低于对照组(81.670±8.570比43.330±5.364, t=3.791, P<0.05),差异有统计学意义;Western blot显示过表达LINC00525组PCNA及MMP-2的的表达量分别高于对照组(1.72比1.00, t=5.971, P<0.01;1.58比1.00, t=7.197, P<0.01),差异有统计学意义;敲减LINC00525组PCNA及MMP-2的表达量分别低于对照组(0.39比1.00, t=7.739, P<0.01;0.33比1.00, t=12.170, P<0.01),差异有统计学意义。 结论:LINC00525在结直肠癌组织中高表达,LINC00525通过调控PCNA及MMP-2的表达影响结直肠癌细胞增殖和侵袭。
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编辑人员丨3天前
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CircSAFB2通过微小RNA-1301-3p/zeste基因增强子同源物2对骨肉瘤细胞凋亡和侵袭的作用
编辑人员丨3天前
目的:观察circSAFB2通过微小RNA(miR)-1301-3p/zeste基因增强子同源物2(EZH2)对骨肉瘤细胞凋亡和侵袭的影响。方法:选用骨肉瘤细胞株MG63,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测MG63细胞和正常成骨细胞中circSAFB2、miR-1301-3p和EZH2 mRNA的表达。将circSAFB2小干扰RNA(siRNA)慢病毒感染骨肉瘤细胞,用流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell检测细胞侵袭能力。培养HEK293细胞,将miR-1301-3p mimic和miR-NC分别与野生型circSAFB2 (Wt)或突变型circSAFB2 (Mut)重组报告基因质粒共转染,将miR-1301-3p mimic和miR-NC分别与野生型EZH2 3’端非编码区(3’UTR)(Wt)或突变型EZH2 3’UTR(Mut)重组报告基因质粒共转染,使用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性。蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中上调miR-1301-3p表达后EZH2表达水平的变化。最后分别转染circSAFB2 siRNA、miR-1301-3p mimic、共转染circSAFB2 siRNA和pcDNA3.1-EZH2、共转染miR-1301-3p mimic和pcDNA3.1-EZH2,通过流式细胞术、Transwel1分别检测各组细胞凋亡和侵袭能力。组间比较采用 t检验。 结果:RT-qPCR结果显示,骨肉瘤细胞MG63中circSAFB2、EZH2 mRNA表达量高于正常成骨细胞(2.263±0.154比1.000±0.093、4.155±0.406比1.000±0.092, t=15.686、16.955, P<0. 05);miR-1301-3p表达量低于正常成骨细胞(0.333±0.031比1.000±0.120, t=12.095, P<0. 05)。感染circSAFB2 siRNA骨肉瘤细胞的凋亡率高于感染circSAFB-NC组和Blank组[(22.48±2.27)%比%(5.92±0.57)%、(5.61±0.62)%, F=142.710, P<0. 05],侵袭数量低于感染circSAFB-NC组和Blank组[(49.333±7.024)比(112.667±14.978)、(110.667±14.048), F=24.767, P<0. 05]。生物信息学分析及双荧光素酶报告基因检测进一步证实了CircSAFB2靶向miR-1301-3p,同时EZH2是miR-1301-3p的靶基因。circSAFB2 siRNA和pcDNA3.1-EZH2共转染的凋亡率低于单独转染circSAFB2 siRNA组[(12.07±0.92)%比(19.58±2.13)%, F=51.211, P<0. 05],侵袭数量高于单独转染circSAFB2 siRNA组[(77.333±12.741)比(47.667±7.506), F=13.595, P<0. 05]。miR-1301-3p mimic和pcDNA3.1-EZH2共转染的凋亡率低于单独转染miR-1301-3p mimic组[(14.07±1.42)%比(20.73±1.99)%, F=51.211, P<0. 05],侵袭数量高于单独转染miR-1301-3p mimic组[(83.667±12.741)比(50.667±8.622), F=13.595, P<0. 05]。 结论:circSAFB2通过miR-1301-3p/EZH2调控骨肉瘤细胞的凋亡和侵袭的作用。
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编辑人员丨3天前
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古尔图病毒核蛋白的原核表达纯化及ELISA检测方法的建立
编辑人员丨3天前
目的:获得纯化的GTV-rNP蛋白抗原,并建立快速准确检测GTV抗体的ELISA法。方法:人工合成密码子优化的 GTV-NP 编码基因,克隆至 pET32a(+)载体,构建重组表达质粒,转化至 BL21(DE3)。将优化表达获得的蛋白经Ni柱纯化后用SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化蛋白为抗原,建立并优化GTV IgG抗体间接ELISA检测方法,并对其进行评价和初步应用。结果:成功构建原核表达质粒pET32a-NP,重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,大小约为44 kD,Western blot结果表明重组蛋白与GTV阳性血清具有良好的抗原性。建立的ELISA法特异性强、敏感性高、批内和批间的变异系数均小于10%具有较好的重复性;检测结果与IFA检测结果符合率达到92.77%。结论:建立的GTV NP 抗体检测ELISA方法的敏感性、重复性和特异性均较好。
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编辑人员丨3天前
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衣原体质粒编码蛋白对衣原体在消化道定植及其耐受胃酸杀伤的作用
编辑人员丨3天前
目的:初步探索鼠衣原体质粒编码蛋白(pGP)维持鼠衣原体定植在消化道的作用,并分析具体参与鼠衣原体在消化道抵制胃酸杀伤作用的pGP种类。方法:选取6周龄雌性健康C57BL/6J小鼠进行灌胃感染不同剂量的鼠衣原体,包括质粒完整衣原体、质粒缺乏衣原体、质粒缺陷衣原体(pGP3S-CM、pGP4S-CM、pGP5S-CM、pGP6S-CM、pGP7S-CM、pGP8d-CM)。于感染后第3、7、14、21、28、35、42、49、56、63天采集直肠拭子,感染后第3、7、14、21、28天取小鼠消化道不同部位组织(胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠),离心取上清液,将上清液接种于海拉细胞进行间接免疫荧光染色,荧光显微镜下计数衣原体包涵体,计算组织中鼠衣原体的感染数量。将pH值为1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的模拟胃酸分别与质粒完整衣原体、pGP3S-CM和pGP4S-CM共同孵育10 min,计算经过不同pH值模拟胃酸杀伤后存活鼠衣原体的数量。统计学比较采用两独立样本 t检验。 结果:采用剂量分别为1×10 3衣原体包涵体形成单位(IFUs)、1×10 4 IFUs、1×10 5 IFUs、1×10 6 IFUs质粒完整衣原体灌胃小鼠后,感染第7至56天小鼠直肠拭子均可检测到质粒完整衣原体,而质粒缺乏衣原体仅在高剂量1×10 5 IFUs和1×10 6 IFUs灌胃小鼠感染后第14天、第7天的直肠拭子中分别被检测到,较质粒完整衣原体在消化道被检出时间明显延迟。采用1×10 5 IFUs质粒完整衣原体灌胃小鼠感染后第3至21天的胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠组织中均可检测出衣原体,第28天后局限在盲肠、结肠、直肠,而质粒缺乏衣原体以相同剂量灌胃感染后仅在第14、21、28天的盲肠、结肠、直肠中被检出。pGP3S-CM与pH值为3.0、3.5、4.0、4.5模拟胃酸共同孵育后存活的鼠衣原体数量均低于质粒完整衣原体组,差异均有统计学意义( t=-0.79、-6.44、-6.99、-6.96,均 P<0.05),而pGP3S-CM与pH值为5.0~7.0的模拟胃酸共同孵育后存活鼠衣原体数量与质粒完整衣原体组差异无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:鼠衣原体质粒可以促进鼠衣原体在消化道内不同部位组织相互作用,使衣原体存活并长期定植,质粒缺乏使鼠衣原体无法在胃和小肠中定植。其中pGP3、pGP4对于鼠衣原体在消化道定植起主要影响,pGP3参与鼠衣原体耐受胃酸杀伤保证鼠衣原体定植于消化道起关键作用。
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编辑人员丨3天前
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甲型流感病毒血凝素头部蛋白结构域的原核表达及血清学分析
编辑人员丨3天前
目的:在原核系统中表达流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)头部蛋白并进行血清学分析。方法:将H1N1和H3N2型流感病毒的HA头部蛋白编码基因克隆到pET-22b(+)原核表达质粒中,通过IPTG诱导,在大肠埃希菌BL21中获得含有HA头部与His-Tag的融合蛋白rH1N1-HA和rH3N2-HA。SDS-PAGE分析IPTG诱导前后的融合蛋白,验证表达的准确性,Western blot验证重组蛋白的表达。纯化重组蛋白,多剂次免疫家兔,获得针对H1N1-HA和H3N2-HA头部的多克隆抗体。同时,重组蛋白免疫BALB/c小鼠,评价其免疫原性。结果:rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白在小鼠体内诱导了滴度高于40的血凝抑制抗体,可作为一种保护性抗原。rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白制备的多克隆抗体,可作为Western blot、ELISA等免疫学应用的重要材料。结论:本研究制备的HA头部蛋白可作为一种保护性抗原,在小鼠体内诱导保护性抗体。HA头部制备的多克隆抗体,可用于甲型流感病毒的免疫学和血清学研究。
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编辑人员丨3天前
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乙型肝炎病毒X蛋白促进甲胎蛋白表达的分子机制
编辑人员丨3天前
目的:探讨乙肝病毒编码X蛋白促进甲胎蛋白表达的分子机制。方法:非参数检验-秩和检验评估肝癌患者HBV感染与否与AFP表达水平间的相关性;在PLC/PRF/5肝癌细胞系中转染HBV、HBx及P53真核表达质粒,36 h Western blot和qRT-PCR分别在蛋白质和mRNA水平检测HBV和HBx对P53和AFP表达的影响,以及P53对AFP表达的影响;在PLC/PRF/5细胞中转染包含AFP基因启动子和沉默子的荧光素酶报告质粒,通过检测荧光素酶活性改变明确沉默子区域,再将包含沉默子的报告载体与HBV/HBx质粒共转染PLC/PRF/5细胞,通过检测荧光素酶活性的改变验证HBV/HBx对AFP基因沉默子区域的作用;用ChIP实验验证P53在AFP基因沉默子区域的结合,并证实HBx对P53与作用序列结合能力的影响。结果:统计分析发现HBV感染与AFP表达之间存在明显相关性,HBV阳性肝癌患者的血清AFP值总体中位数为296.8 ng/ml,而HBV阴性患者的AFP总体中位数为71.5 ng/ml( P=0.02),HBV阳性肝癌患者的AFP表达水平明显高于HBV阴性肝癌患者;P53可以抑制AFP表达( P<0.001),而HBV和HBx均能抑制P53表达( P=0.0011、 P=0.0027),并促进AFP表达( P=0.0014、 P<0.001);HBV和HBx可以作用于AFP基因沉默子区域,促进基因转录( P<0.001、 P=0.0019; P=0.0046、 P=0.0015);P53与AFP基因沉默子的结合作用能够被HBx所够削弱。 结论:HBx可通过抑制P53表达,并且抑制P53在AFP基因沉默子区域的结合,以此促进AFP基因转录,并进一步促进AFP蛋白表达。
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编辑人员丨3天前
