目的 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)方法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)精制抗原纯度,并进行验证.方法 对样品进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色后,使用凝胶成像系统拍照并用Image Lab软件进行分析,获得样品各蛋白条带的光密度值.对建立的方法进行系统适用性、线性、准确度、重复性、中间精密度、灵敏度和耐用性验证.结果 对应 2 套分子量标准蛋白,PT、FHA和PRN精制抗原分别在10.00～50.00 μg/mL的低质量浓度范围和 50.00～600.00 μg/mL的高质量浓度范围内,蛋白浓度和对应条带光密度值之间具有良好的线性关系,相关系数(coefficient of correlation,r)≥0.99.3 种精制抗原杂质水平准确度和重复性回收率均在 80%～120%,且重复性验证相对标准差(relative standard deviation,RSD)≤10%;抗原水平准确度和重复性回收率均在90%～110%,重复性验证RSD≤10%;灵敏度 12.50 μg/mL的回收率均在 80%～120%,RSD≤10%;中间精密度验证RSD≤10%.结论 建立的测定PT、FHA和PRN精制抗原纯度的SDS-PAGE法,其系统适用性、准确度、重复性、中间精密度和灵敏度均良好,可用于以上精制抗原的纯度检测.

目的:建立猪带绦虫（Ts）14-3-3.2原核表达系统，并观察Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。方法:在遵义医科大学寄生虫学教研室前期获得Ts14-3-3.2基因序列的基础上，采用基于PCR的精确合成（PAS）方法全基因合成Ts14-3-3.2基因，经限制性内切酶 NdeⅠ和 XbaⅠ双酶切后连接质粒pCzn1，构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2。将重组质粒转化至大肠埃希菌ArcticExpress感受态细胞中诱导表达，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析和鉴定表达产物，通过镍（Ni）柱亲和纯化获得纯化Ts14-3-3.2重组蛋白。采用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体，采用免疫印迹法（Western blot）检测Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。 结果:成功构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2，诱导表达后菌体上清液和沉淀均在相对分子质量约29.31 × 10 3处出现Ts14-3-3.2目的蛋白条带。纯化后带有His标签的Ts14-3-3.2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别，获得效价为1∶512 000的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Western blot结果显示，Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中均有表达。 结论:成功建立Ts14-3-3.2原核表达系统，获得了高纯度、高效价的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴阶段均有表达。

目的:通过体内外模型观察牙周炎局部组织内皮细胞在炎症环境下是否发生焦亡，为探究牙周炎发病机制提供实验依据。方法:根据牙周病2018年新分类标准收集无全身疾病、牙周健康者及Ⅲ~Ⅳ期C级牙周炎患者的牙龈组织，免疫组化染色检测牙龈组织中焦亡标志性蛋白消皮素D（GSDMD）的表达水平及分布情况；每组通过结扎3只小鼠上颌第二磨牙2周建立牙周炎模型（结扎组），使用显微CT（micro-CT）检测小鼠牙槽骨吸收情况（以不做结扎处理的小鼠作为对照组）；使用免疫荧光染色对健康及炎症小鼠牙龈组织中血管内皮细胞血小板内皮细胞黏附分子（CD31）与GSDMD共定位进行定量分析；体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs），分别以质量浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/L牙龈卟啉单胞菌（Pg）脂多糖（LPS）联合腺苷三磷酸（ATP）处理HUVECs，同期设置0 mg/L Pg-LPS组为对照组。使用扫描电镜观察 HUVECs形态，蛋白质印迹法检测GSDMD的N端结构域（GSDMD-N）蛋白表达，细胞免疫荧光染色检测GSDMD蛋白表达及分布，细胞计数试剂盒（CCK-8）检测HUVECs的增殖能力，碘化丙啶（PI）染色检测HUVECs细胞膜的完整性。结果:免疫组化结果显示，牙周炎患者牙龈组织中GSDMD主要分布于血管周围，且表达水平较健康组织显著升高；micro-CT结果显示，结扎组小鼠上颌第二磨牙周围牙槽骨吸收较对照组小鼠显著增多（ t=8.88， P<0.001）；免疫荧光染色结果显示，结扎组小鼠牙龈组织中血管内皮细胞GSDMD与CD31存在明显的共定位；扫描电镜结果显示，在不同浓度Pg-LPS联合ATP模拟的炎症环境中，HUVECs细胞膜上出现不同大小的孔洞，呈现典型的细胞焦亡形态，其中2.5 mg/L Pg-LPS+ATP组细胞膜上孔洞最多且扩张融合，细胞有裂解死亡的趋势。蛋白质印迹法结果显示，2.5和5.0 mg/L Pg-LPS+ATP组焦亡标志性蛋白GSDMD-N表达显著高于对照组（ F=3.86， P<0.01）；细胞免疫荧光结果显示，2.5 mg/L Pg-LPS+ATP组较对照组GSDMD平均荧光强度升高最显著（ F=35.25， P<0.001）。CCK-8结果显示，0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 mg/L Pg-LPS+ATP组细胞增殖相对值（分别为0.52±0.07、0.57±0.10、0.58±0.04、0.55±0.04和0.61±0.03）均显著低于对照组（1.00±0.02）（ F=39.95， P<0.001）。PI染色结果显示，PI阳性细胞数占比在2.5 mg/L Pg-LPS+ATP组最高［（56.07±3.22）%］（ F=88.24， P<0.001）。 结论:牙周炎症环境中内皮细胞发生明显的焦亡现象，提示内皮细胞焦亡可能是造成牙周炎发生的重要致病因素。

目的:比较靶向相对分子质量1.8×10 4转位蛋白(TSPO)的分子探针 N， N-二乙基-2-[2-(4- 18F-氟苯基)-5，7-二甲基吡唑[1，5-a]并嘧啶-3-基]乙酰胺( 18F-FDPA)和 18F-(R)-( N-仲丁基)-3-氟甲基- N-甲基-4-苯基喹啉-2-甲酰胺(LW223)用于探测兔腹主动脉粥样硬化易损斑块(VAP)的可行性和效能。 方法:选取9只健康新西兰大白兔，用完全随机法分为3组(每组3只)：正常对照组(A组)、VAP组(B组)和VAP治疗组(C组)，分别于造模后第12、16和24周末注射 18F-FDPA和 18F-LW223，并于注射后40～50 min行活体腹主动脉PET/CT和同机CT血管成像(CTA)。所有显像结束后，处死全部动物，行腹主动脉病理学及免疫荧光检测。采用重复测量方差分析(Bonferroni法)和配对 t检验分析数据。 结果:18F-FDPA在3组不同时间点(第12、16和24周末) PET/CTA同机显像中，靶本比(TBR；腹主动脉病灶/左心室血池)值间差异均有统计学意义( F值：68.09～144.88，均 P<0.001)。在第12周末显像中，3组腹主动脉区域均无明显显像剂摄取增高灶。在第16和24周末显像中，B组腹主动脉局部的摄取均高于同期时间点的C组(均 P<0.05)和A组(均 P<0.001)；C组腹主动脉局部的摄取高于同期时间点的A组(均 P<0.01)。3组不同时间点PET/CTA图像中，腹主动脉区域均无明显 18F-LW223摄取增高灶。在上述3个不同时间点，3组 18F-FDPA和 18F-LW223的TBR值间差异均有统计学意义( t值：2.88～36.79，均 P<0.05)。病理HE、免疫荧光CD68和TSPO染色显示，B组 18F-FDPA高摄取易损斑块处巨噬细胞浸润数量多于C组。 结论:与 18F-LW223相比， 18F-FDPA可用于早期探测兔腹主动脉易损斑块，并可评估降脂药物干预后易损斑块稳定性的变化。

目的:构建细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒，诱导表达EgG1Y162-2重组蛋白，为研制细粒棘球蚴疫苗提供研究基础。方法:以细粒棘球蚴cDNA为模板，利用PCR法合成EgG1Y162-2目的基因，经限制性内切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切后连接到原核表达载体pET30a中，构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒；将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达大量蛋白，采用亲和层析方法纯化重组蛋白；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白纯化水平，蛋白免疫印迹（Western blot）法鉴定表达产物。 结果:成功构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒，诱导表达后菌体上清液和洗脱液均在相对分子质量约15 × 10 3处出现EgG1Y162-2蛋白目的条带，且200 mmol/L咪唑洗脱的蛋白抗原成分较纯。Western blot结果显示，纯化后带有His标签的EgG1Y162-2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别。 结论:成功构建了细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒，诱导表达了EgG1Y162-2重组蛋白，为进一步开展抗细粒棘球蚴疫苗的研究奠定基础。

目的：:观察经上皮准分子激光角膜切削术（TPRK）后眼罩冷敷缓解患者术后不适的临床疗效。方法：:前瞻性随机对照研究。选取2018年10月至2019年4月在温州医科大学附属眼视光医院之江院区行TPRK的患者87例（174眼），根据随机数字表随机分成冷敷组和对照组，2组均选取右眼进行观察。冷敷组在术后留观期间给予4 ℃冷藏硅胶眼罩冰敷袋，冷敷20 min，其余处理同对照组。对照组常规用药不冷敷。分别于术后2 h、1 d、2 d、3 d、5 d每天相对固定时间填写眼部不适感评分量表，包括视物模糊、畏光、异物感、流泪、眼痛、眼痒、眼部分泌物等术后不适情况。并于术后5 d、12 d、1个月、3个月分别评估角膜上皮愈合情况、裸眼视力（UCVA）、等效球镜度（SE）、角膜上皮下雾状混浊（haze）、调制传递函数截止频率（MTF cutoff）、客观散射指数（OSI）等指标。采用重复测量方差分析、独立样本 t检验对数据进行分析。 结果：:术后2 h时，畏光、异物感、眼痛评分等指标在2组间差异均有统计学意义（ F=15.93， P<0.001； F=9.52， P=0.003； F=13.57， P<0.001）。2组间视物模糊、流泪、眼痒、眼部分泌物差异均无统计学意义。术后1 d视物模糊指标在2组间差异有统计学意义（ F=9.69， P=0.003），畏光、异物感、流泪、眼痛、眼痒、眼部分泌物等指标差异无统计学意义。术后2、3、5 d所有不适症状组间差异均无统计学意义。术后5 d、12 d、1个月、3个月，2组间角膜上皮愈合情况、UCVA、SE、Haze等差异均无统计学意义。术后3个月2组间客观光学质量评估差异均无统计学意义。 结论：:TPRK术后冷敷疗法能够改善术后早期疼痛、畏光、异物感等刺激症状，但对术后远期视力恢复没有明显作用，且对术后角膜上皮修复、视觉质量恢复等无负面影响。

目的:探讨间歇低氧对大鼠认知功能的影响及其分子机制。方法:选用雄性Wistar大鼠64只，体质量(180±10)g，按随机数字表法分为正常对照组(UC组)和5%间歇低氧组(5%IH组)，每组32只；每组按取材时间不同随机分为7、14、21、28 d四个亚组，每个亚组8只。UC组大鼠置于实验箱内持续注入空气，氧浓度为21%；5%IH组大鼠置于实验箱内，循环注入氮气及空气，使氧浓度在5%～21%之间变化，每120 s为1个周期。2组大鼠每日实验8 h，其余16 h常规饲养，分别持续进行7、14、21、28 d。各亚组实验后应用Morris水迷宫检测两组大鼠学习记忆功能。完成Morris水迷宫实验后处死并取出大鼠海马组织，制备切片标本：采用透射电镜观察大鼠海马CA1区神经细胞超微结构的改变；采用免疫组织化学法检测海马CA1区神经细胞凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)、第二个线粒体衍生的caspase激活因子(Smac)蛋白的表达情况；采用Tunel法检测海马CA1区神经细胞凋亡情况，并计算神经细胞凋亡指数。采用Pearson检验，分析UC组不同时间点Apaf-1及Smac蛋白的表达与神经细胞凋亡指数的相关性。结果:(1)Morris水迷宫实验：UC组大鼠间歇性低氧7、14、21、28 d逃避潜伏期分别为(20.83±3.25)、(22.17±2.79)、(20.50±4.51)、(21.17±4.17)s，跨越目标象限时间分别为(52.17±4.17)、(52.50±2.74)、(51.50±2.43)、(52.00±4.78)s，各时间点差异均无统计学意义( P值均>0.05)；5%IH组间歇性低氧7、14、21、28 d逃避潜伏期分别为(33.17±2.14)、(44.33±3.45)、(52.17±3.87)、(64.33±2.73)s，跨越目标象限时间分别为(44.00±3.03)、(34.50±3.94)、(27.83±3.01)、(20.83±1.94)s，随间歇低氧时间的增加，逃避潜伏期延长，跨越目标象限时间明显缩短，差异均有统计学意义( F＝106.335、61.772, P值均<0.01)。两组间比较：5%IH组不同时间点逃避潜伏期时间均大于UC组，跨越目标象限时间均小于UC组，差异均有统计学意义( P值均<0.01)。(2)透射电镜观察神经细胞超微结构：UC组大鼠海马CA1区神经元核较大，核膜结构完整，呈椭圆形或圆形，染色质分布均匀呈细颗粒状，细胞器丰富，形态结构正常；5%IH组从7 d开始出现神经元水肿，细胞核变形，核膜模糊，核仁逐渐消失，细胞器肿胀溶解等，随着时间的延长，改变程度越重。(3)Apaf-1、Smac蛋白的相对表达量：UC组各个时间点海马CAl区神经细胞Apaf-1、Smac蛋白的相对表达量差异均无统计学意义( P值均>0.05)；而5%IH组各个时间点Apaf-1、Smac蛋白的相对表达量均随间歇低氧时间的延长而升高，差异均有统计学意义( F＝25.328、42.923, P值均<0.01)。两组间比较：5%IH组各个时间点Apaf-1、Smac蛋白的相对表达量均明显高于UC组，差异均有统计学意义( P值均<0.01)。(4)神经细胞凋亡情况：UC组各个时间点海马CAl区神经细胞神经细胞凋亡少，AI差异无统计学意义( P>0.05)；5%IH组随间歇低氧时间的延长而升高，AI差异有统计学意义( F＝25.799, P<0.01)。两组间比较：各个时间点海马CAl区神经细胞凋亡明显高于UC组，AI差异均有统计学意义( P值均<0.05)。(5)Pearson检验显示：5%IH组各个时间点大鼠海马CA1区Apaf-1、Smac蛋白的表达与凋亡指数均呈正相关( rApaf-1＝0.735、0.736、0.685、0.747， rSmac＝0.735、0.734、0.679、0.751， P值均<0.05)。 结论:间歇低氧可导致大鼠认知功能障碍，这可能与其引起大鼠海马CA1区神经细胞超微结构的改变，诱导凋亡相关蛋白Apaf-1、Smac的表达，进而造成神经元凋亡有关。

目的:探讨circ-PTPN22的翻译能力及其与系统性红斑狼疮（SLE）的关系。方法:2019年5月10日至2019年9月30日分别于西南医院中西医结合风湿免疫科和体检中心收集6例SLE女性患者和9例健康女性对照全血样本，分离外周血单个核细胞（PBMC），其中3例SLE和3例健康对照PBMC采用磁珠分选为T、B、NK细胞。通过circRNADb网站预测出circ-PTPN22内部核糖体进入位点（IRES）序列及蛋白序列，制备针对circ-PTPN22剪接位点处特异氨基酸序列的兔抗circ-PTPN22pro多克隆抗体，Western印迹法检测健康对照和SLE患者PBMC以及T、B、NK细胞亚群中circ-PTPN22pro的表达。将circ-PTPN22-FLAG、circ-PTPN22-NC-FLAG、circ-PTPN22-shRNA-FLAG、circ-PTPN22-shRNA-NC-FLAG重组慢病毒分别转染培养的Jurkat细胞，以正常培养的细胞作为细胞对照组，Western印迹法检测Jurkat细胞中circ-PTPN22pro蛋白表达，流式细胞仪检测circ-PTPN22对细胞活化和凋亡的影响。采用两因素重复测量方差分析和两独立样本 t检验进行统计分析。 结果:circRNAD数据库预测显示，circ-PTPN22具有翻译能力，且Western印迹显示circ-PTPN22pro蛋白相对分子质量为20 000。转染48 h后，circ-PTPN22-FLAG组circ-PTPN22pro表达明显高于circ-PTPN22-NC-FLAG组和细胞对照组。转染24、48、72 h，circ-PTPN22组白细胞介素2（IL-2）表达（22.20% ± 8.92%、31.10% ± 5.88%、53.20% ± 10.25%）均低于circ-PTPN22-NC组（30.90% ± 11.00%、51.23% ± 10.70%、69.67% ± 9.00%； F = 284.881， P = 0.003）；circ-PTPN22-shRNA组IL-2表达（35.57% ± 8.79%、78.10% ± 10.08%、88.63% ± 3.89%）均高于circ-PTPN22-shRNA-NC组（26.73% ± 4.92%、41.03% ± 10.45%、41.33% ± 4.96%； F = 293.818， P = 0.003）。转染48、72、96 h后，circ-PTPN22组、circ-PTPN22-shRNA组细胞凋亡率均分别高于circ-PTPN22-NC组（ F = 81.287， P = 0.012）、circ-PTPN22-shRNA-NC组（ F = 111.813， P = 0.009）。SLE组PBMC中circ-PTPN22pro表达低于健康对照组，几乎不表达。SLE组T、B细胞中circ-PTPN22pro表达均显著低于健康对照组（ t = 3.047、4.806， P < 0.05），两组NK细胞中circ-PTPN22pro表达差异无统计学意义（ t = 0.582， P > 0.05）。 结论:circ-PTPN22可翻译circ-PTPN22pro蛋白，具有抑制Jurkat细胞活化功能，SLE患者PBMC中circ-PTPN22pro表达低于健康对照，提示其与SLE发生发展可能存在一定关系。

目的:通过蛋白重组技术低成本、快速制备高浓度人视黄醇结合蛋白4（hRBP4）参考物质，解决临床hRBP4高值参考物质难以获取的需求。方法:在美国国立生物技术信息中心NCB查找hRBP4的互补DNA序列，经大肠埃希菌密码子优化后人工合成，然后将DNA片段克隆至原核表达质粒pET-28a（+）中，以构建重组hRBP4表达载体。将重组质粒转化至 E. coli BL21感受肽中，优化诱导表达条件（如温度、转速和异丙基硫代半乳糖苷IPTG浓度等）、诱导质粒表达并对重组蛋白进行His融合标签纯化，获取纯化后的hRBP4重组蛋白。 结果:DNAMAN软件对比显示编码hRBP4蛋白的碱基序列完全正确，成功构建重组hRBP4原核表达质粒；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示亲和纯化产物中可清晰可见约相对分子质量26 000电泳条带；临床尿液和血清hRBP4常规检测系统均可检测到纯化的hRBP4蛋白，且稀释倍数与检测浓度间呈现良好线性关系。结论:成功构建重组hRBP4高水平表达系统，重组hRBP4蛋白纯度大、浓度高、生产周期短，有望在室间质量评价质控品和有证参考物质研制中发挥重要作用。

目的:探讨阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)合并高血压前期(pre-HT)患者血清E选择素、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)与左室几何构型和功能的相关性。方法:回顾性研究2019年7月至2022年7月就诊于山西医科大学第一医院呼吸与危重症医学科睡眠监测室经多导睡眠监测(PSG)确诊为OSAS，同时为pre-HT的患者462例，选取同期单纯pre-HT患者52例(pre-HT组)，单纯OSAS患者73例(OSAS组)作为对照组。将OSAS合并pre-HT患者按左室几何构型分为4组：正常构型(NG)组、向心性重构(CR)组、离心性肥厚(EH)组和向心性肥厚(CH)组。比较6组间一般临床资料、PSG参数、血生化参数、左室结构和功能参数等，应用Pearson相关分析和多因素Logistic回归分析法分析E选择素、ICAM-1、VCAM-1、一般临床资料、PSG参数、血生化参数与左室功能和左室几何构型的相关性。结果:①血清E选择素、ICAM-1和VCAM-1浓度从NG、CR、EH到CH组依次增高，以CH增高最为明显(均 P<0.05)。此外，各组间年龄、体质指数(BMI)、OSAS严重程度、颈围、腰围、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、空腹血糖(Glu)、最低血氧饱和度(Lowest-SaO 2)、平均血氧饱和度(Mean-SaO 2)、血氧饱和度低于90%的时间占总睡眠时间的百分比(T90)、左室舒张末期内径(LVEDd)、室间隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室质量指数(LVMI)、相对室壁厚度(RWT)、左室射血分数(LVEF)、二尖瓣口舒张早期血流峰值速度/二尖瓣口舒张晚期血流峰值速度(E/A)、E峰减速时间(DT)、A峰持续时间(AD)、等容舒张时间(IVRT)、整体长轴纵向应变(GLS)等参数差异有统计学意义(均 P<0.05)。②Pearson相关分析显示，E选择素与LVEF、E/A、e′、E/e′、IVRT、GLS呈负相关( r＝－0.236、－0.131、－0.224、－0.215、－0.285、－0.336，均 P<0.05)；ICAM-1与LVEF、E、E/A、e′、IVRT、GLS呈负相关( r＝－0.130、－0.129、－0.104、－0.351、－0.252、－0.259，均 P<0.05)；VCAM-1与E、e′、IVRT呈负相关( r＝－0.132、－0.312、－0.387，均 P<0.001)。③多因素Logistic回归分析显示，E选择素和VCAM-1与EH(β＝1.139， OR＝3.124， P＝0.030；β＝1.288， OR＝3.626， P<0.001)和CH(β＝1.178， OR＝3.248， P＝0.013；β＝1.108， OR＝3.028， P<0.001)均存在独立相关性。 结论:E选择素和VCAM-1与肥厚型左室构型存在独立相关性，提示E选择素和VCAM-1可能参与OSAS合并pre-HT患者左室结构和功能异常的过程。