目的:建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法:针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针，优化反应温度，建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术，评价其特异性和敏感性，并与Real time PCR方法进行比较。结果:该方法检测H7亚型禽流感病毒的最低检出限为20拷贝/μL，与其他流感/禽流感病毒无交叉反应，反应可在20~50℃温度范围内进行，临床样本检测结果与Real time PCR法一致性为100.0％。结论:该检测方法具有快速、特异及灵敏的特点，为在基层和现场快速检测H7亚型禽流感病毒提供了新的方法。

重组聚合酶等温扩增（RPA）技术是新开发的具有高灵敏度、高特异性的等温扩增技术，将RPA与侧流层析试纸条检测（LFS）技术相结合，可快速鉴别目的基因。迄今为止，RPA-LFS技术已广泛运用于医药、食品、植物学等领域。本文将对RPA-LFS技术在病原微生物中的诊断进行综述，为实现病原微生物的即时诊断提供参考。

目的:建立基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）-规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR-Cas13a）准确检测肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）型碳青霉烯酶基因的方法。方法:收集2020—2021年北京市垂杨柳医院保存的25株产耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）临床分离株和5株碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌（CSKP），提取菌株总DNA。设计检测KPC DNA特异性RAA引物和检测CRISPR RNA（crRNA），建立基于RAA-CRISPR-Cas13a技术快速准确检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法。通过KPC质粒和临床样本菌株对方法进行评价，同时使用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）方法进行检测，比较2种方法的检出率和一致性。结果:本研究建立的RAA-CRISPR-Cas13a方法检测KPC质粒和样本的检测灵敏度均可达到1拷贝/μl，高于qPCR（10 1 拷贝/μl）。RAA-CRISPR-Cas13a检测方法和qPCR方法均从30株临床菌株（包含25株CRKP菌株和5株CSKP菌株）中检出23株携带KPC基因，7株未检出KPC基因，25株CRKP菌株中KPC基因检出率为92%（23/25），2种检测方法阳性符合率为100%（23/23）。 结论:将RAA扩增技术结合CRISPR-Cas13a技术，建立了一种准确检测KPC型碳青霉烯酶基因的方法。该方法有助于精准的筛选产KPC型碳青霉烯酶的菌株。

多重核酸检测技术具有可同时检测多个靶标、高通量、低成本等优势，满足大规模筛查、定量等检测需求。多重聚合酶链反应广泛应用于病原体、甲基化DNA和突变基因检测以及单核苷酸多态性分型；重组聚合酶扩增、环介导等温扩增等等温扩增技术在即时检测领域有很好的前景；基于规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统的多重核酸检测技术因其高灵敏度、高特异性成为新的研究热点；而宏基因测序在新发病原体突变监测和肿瘤学研究等领域发挥主导作用。本文对各种多核酸检测技术的临床应用现状及未来发展方向进行论述。

目的 为实现快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2),干预和防止病毒的传播,研制一种基于双重CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2核酸胶体金快速检测试纸条.方法 通过设计基于ORF1ab和N基因靶序列内的正反两个依赖原间隔邻近基序(PAM)位点crRNAs,将恒温扩增技术与CRISPR-Cas12a检测相结合,并结合侧向层析试纸条技术,实现对SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因同时扩增与双重CRISPR的可视化检测.结果 检测试纸条可在37 ℃条件下20 min内取得结果,具有较好的灵敏度、特异度及热稳定性.对SARS-CoV-2假病毒的检测灵敏度为250 copy/mL,检测16种其他呼吸道病原体均无交叉反应,在37 ℃条件下存放8 d仍然具有较好检测效果.临床研究显示,检测SARS-CoV-2总符合率为95.00％(57/60).结论 基于双重CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2核酸胶体金快速检测试纸条提高检测效率和准确度的同时降低了成本,可用于SARS-CoV-2的现场快速检测.

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)是一种由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性、高度传染性疾病,主要感染山羊和绵羊,发病率和死亡率极高.由于其严重的病理损害及广泛的传播性,给各国养殖业及国际贸易造成巨大经济损失,因此,建立快速、准确的检测方法对该病的防控尤为重要.本文就用于 PPRV检测的普通 RT-PCR、普通多重 PCR、实时荧光定量PCR(real-time fluorence quantitative PCR,RT-qPCR)、焦磷酸光化测序、巢式PCR(nested PCR,nPCR)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)等生物检测技术的研究进展作一综述,以期为科学检测、鉴定PPRV提供依据和思路.

目前,我国正处于H7N9禽流感病毒疫情高发季节.2017年春季以来,我国福建、云南、湖南和湖北等16个省份均出现了感染H7N9的病例,并且感染数量和范围与去年同期相比有明显上升和扩大.H7N9禽流感病毒因其对人类的高致死率和快速的传播速度引起了全球的广泛关注.快速、准确和高效的检测对H7N9禽流感的疫情监测和防控至关重要.为此,该文就目前应用于H7N9禽流感病毒研究中的分子生物学诊断技术(包括聚合酶链反应、基因芯片、依赖核酸序列的的扩增、高分辨率熔解曲线、液相芯片、重组酶介导的等温扩增法、高通量测序、环介导等温扩增及多重PCR-酶联免疫吸附法等)进行了综述.

目的 利用重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术检测结核分支杆菌.方法 采用Axxin T8-ISO扩增仪(TwistDX公司),反应温度设置为39℃,反应时间20 min.检测分为实验组、阳性对照组和空白对照组.实验组模板DNA从痰液中提取.阳性对照模板DNA为H37Rv标准菌株样本DNA及卡介苗提取的DNA.空白对照为蒸馏水.结果 RPA技术可在20 min内明显区分103～106 copies/mL的阳性质粒与阴性对照.对分离培养的结核杆菌(H37Rv) DNA及卡介苗提取的DNA,阳性克隆质粒进行等温扩增,结果结核杆菌分离株DNA、卡介苗DNA、阳性克隆质粒均有阳性扩增反应,而非结核分枝杆菌分离株和阴性对照无阳性扩增反应.灵敏度为100％,特异性为82％.结论 RPA技术利用了重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶代替了传统PCR变性、退火、延伸的热循环过程,在常温25℃～42℃、15～30 min内即可实现痕量核酸的快速扩增,可应用于快速检测人结核分枝杆菌,是一种全新的检测方法.

作为一项快速、高效、便捷的等温核酸扩增技术,重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术运用在病原体检测研究中,表现出灵敏度高、特异度好、用时短、应用广泛、操作简单等优势,有望应用于口岸病原体现场快速检测.本文在对比几种等温核酸扩增技术的基础上,重点介绍RPA技术原理和方法,以几种国境口岸重点关注病原体为例,探讨RPA在病原体检测、生物反恐、移动实验室方面的研究进展,为口岸卫生检疫工作提供新的技术参考和方向.

依赖核酸序列扩增和重组酶聚合酶扩增技术是在PCR基础上发展起来的等温扩增技术.本文介绍了这两个技术的反应原理、引物探针设计原则以及优势,根据其简便、准确性好、灵敏度高、周期短的特点进一步对该技术在病原菌检测中的应用予以综述及展望.