目的:构建一种太赫兹（THz）超材料传感方法用于microRNA-21（miRNA-21）的信号放大检测。方法:首先构建THz超材料传感方法，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳及zeta电位验证方法的可行性；对传感器检测条件进行优化之后，对不同浓度的miRNA-21以及其他不同的miRNAs进行检测，并与其他microRNA检测方法进行比较；最后，对该传感器的回收率进行了评价。结果:在最优实验条件下，通过双链特异性核酸酶（DSN）循环识别与滚环扩增（RCA）的双重信号放大策略，该THz超材料传感器对靶标miRNA-21的响应范围为10 fmol/L至10 nmol/L，检测限为8.49 fmol/L。并且该传感器具有较好的特异性，具备了从多种miRNAs中识别靶标miRNA-21的能力，并且在商业化人血清样本中的回收率可达94.33%到115.33%。结论:该THz传感器可以实现靶标miRNA-21的高灵敏、高特异性检测，具备了在miRNA相关疾病无标记诊断与早期预警的潜力。

目的 通过GEO数据库分析骨质疏松患者血清及髋骨组织中差异miRNA的表达变化,并对差异miRNA的靶基因进行GO、KEGG功能富集分析、转录因子预测和蛋白网络调控图绘制,探讨这些差异基因在疾病发生、发展过程中的作用,为研究骨质疏松的发病机制、治疗及预防骨质疏松性骨折提供依据.方法 下载GEO数据库中的骨质疏松差异miRNA数据集作为研究对象,第一组为GSE91033 数据集,包括1 例正常对照组和2 例骨质疏松患者的血清miRNA表达谱;第二组为GSE74209 数据集,包括6 例正常对照组和6 例骨质疏松患者髋骨组织miRNA表达谱.使用GEO数据库中GEO2R分析工具,筛选两组数据中调整后P<0.05,logFC>1 或logFC<-1 的差异miRNA作为研究对象.通过SangerBox工具绘制差异miR-NA火山图,TargetScan数据库预测差异miRNA的靶基因,FunRich软件、DAVID在线数据库对靶基因进行GO、KEGG功能富集分析、转录因子预测,最后使用Cytoscape软件进行蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)蛋白网络调控图绘制并确定核心蛋白.结果 在GSE91033 数据集中,筛选出骨质疏松患者外周血中有 204 个差异miRNA(164 个上调miRNA,40 个下调miR-NA);在GSE74209 数据集中,筛选出骨质疏松患者髋骨组织中有 138 个差异miRNA(39 个上调miRNA,99 个下调miRNA).通过GO、KEGG功能富集分析,得到GO生物过程包括三酰甘油合成过程、细胞分裂、细胞对DNA损伤刺激的反应、成纤维细胞迁徙的正向调控、骨重建等.KEGG富集分析得到缺氧诱导因子(HIF)-1 信号通路、细胞外基质(ECM)受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架的调节、E-钙黏蛋白(cadherin)信号通路等.通过cytohubba插件分析得到20 个关键基因(Hub),其中处于枢纽地位的有丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1、着丝粒相关蛋白(DSN)1、UBE203 三个基因.结论 骨质疏松患者外周血和骨组织有多个上调的差异miRNA,这些上调的差异miRNA可能通过靶向枢纽基因MAPK1、DSN1、UBE203 经多种途径参与骨质疏松的进程.

为构建高质量的丹参cDNA文库以及通过酵母双杂交获得丹参SrnJAZ8互作蛋白基因.研究以丹参的根、茎、叶、花、毛状根为材料,利用SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)方式合成全长cDNA,并结合基于双链的特异性核酸酶(duplex-specific nuclease,DSN)均一化技术,构建丹参的均一化全长cDNA文库.通过文库鉴定,检测到cDNA文库库容为1.45 × 106,重组率为100％,插入片段平均大小为500 ～2 000 bp.构建pDEST-pGADT7-SmJAZ8重组载体,将该载体转化Y2HGold菌种,通过酵母双杂交进行互作蛋白的筛选,最终筛选到了丹参DnaJ蛋白和UBQ蛋白.该研究既成功构建了丹参均一化全长cDNA文库,又为后续丹参功能基因筛选和基因功能的研究奠定了基础.

目的 分析早发型重症肌无力(EOMG)和迟发型重症肌无力(LOMG)患者的临床特点. 方法 回顾性研究,纳入157例重症肌无力(MG)患者,根据发病年龄分为年龄小于等于50岁为EOMG组85例,大于等于50岁为LOMG组72例.对两组患者的临床症状、肌无力分型、重复电刺激(RNS)、单纤维肌电图(SFEMG)、乙酰胆碱受体抗体(Ach R Ab)、肌肉特异性激酶抗体(MuSK Ab)、抗连接蛋白抗体(Titin Ab)和抗兰尼碱受体抗体(RyR Ab)及甲状腺功能、外科手术情况、胸腺病理、治疗方案进行分析. 结果 EOMG组和LO MG组患者平均起病年龄为(40.9±9.7)岁、(62.0±12.2)岁.LOMG组和EOMG组患者眼肌型[36例(50.0％)比28例(32.9％)]、全身型[36例(50.0％)比57例(67.1％)]、球部症状[30例(41.7％)比20例(23.5％)]差异有统计学意义(P＜0.05).两组患者RNS、SFEMG阳性率和Ach-R Ab(+)、MuSK Ab(+)和双抗体均阴性表达,差异无统计学意义(P＞0.05).EOMG组患者甲状腺功能异常率和外科胸腺手术比例均高于LOMG组患者(P＜0.05).激素、他克莫司和血浆置换EOMG组患者使用频率高于LOMG组患者(P＜0.05). 结论 EOMG和LOMG组患者在临床分型、甲状腺功能、纹状抗体表达情况、外科手术比例及免疫用药方面存在差异.

双链特异性核酸酶(DSN酶)是一种能高效识别并酶切完全互补配对的DNA双链或者DNA/RNA杂交双链中的DNA链,而对单链DNA和单/双链RNA几乎没有作用的核酸酶,所以DSN酶在生物和医学等领域有着广泛的应用.目前,基于DSN酶对单双链核酸不同的切割特点,搭载不同的信号输出及扩增方式,已经建立了一系列生物传感技术,如比色法、荧光法及电化学法等.实现了miRNAs、mRNA及重金属离子等一系列生物标志物及食品安全风险因子的检测.另外,DSN酶与新兴纳米材料搭载的纳米传感器也在RNA等物质传感中显示出了极大的分析优势.首先从结构、性质和切割方式3个方面介绍了DSN酶,并对近年来基于DSN酶介导的、具有代表性的生物传感器的组建及应用情况进行了综述,主要是根据不同的信号输出方法对DSN酶介导的核酸传感器进行归类综述,包括光学传感器、电化学传感器和光磁传感器等.具体综述内容包括,详细地阐述了各种传感器的传感原理,综合比较了各传感器的检测范围及检测灵敏度等,同时还归纳了目前DSN酶介导的生物传感器能够检测的靶物质类型,有助于人们以后对DSN酶更深层次的使用.最后,对DSN酶介导的生物传感器目前存在的不足及今后的发展趋势进行了展望,旨在指导人们在未来使用DSN酶介导的生物传感器中能避免相关问题,研发出更快捷、更方便、灵敏度更高的生物传感器.

[目的]建立一种测定miR-21含量新型实验方法.[方法]利用microRNA-21(miR-21)作为靶标,并设计基于双链特异性核酸酶(Duplex specific nuclease,DSN)及杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)的探针MP、H1及H2,通过加入靶标从而引起DSN和HCR反应,达到双重信号放大的目的,最终信号输出方式为DNAzyme显色,裸眼可视,根据其产生颜色强度对靶标进行定量检测.[结果]DSN结合HCR靶标的最低检测限可达1 pmol/L,线性范围为1 pmol/L～1μmol/L,特异性良好,除靶标miR-21外,非特异性靶标均无明显信号产生,在人体血清实际样品中检测miR-21,其回收率可达到92.3％～101.5％.[结论]该检测方法成功建立测定miR-21含量的技术平台,灵敏性可达1 pmol/L,且特异性好、快速可视,为研究及临床诊断心血管疾病提供技术依托.

目的 探索ARID家族富含AT的相互作用域4B(ARID4B)以及Nnf1的剂量抑制因子(DSN1)蛋白表达水平在肝细胞癌(HCC)患者预后评估中的作用.方法使用癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达数据库(GEO)中的数据来分析HCC中ARID4B和DSN1的表达.所有组织样本均取自2016年6月至2017年6月在秦皇岛市第三医院外科接受肝切除手术且术前未行化学治疗或放射治疗的H CC患者.取新鲜冷冻的130对HCC组织和邻近非癌肝组织(ANLT)样品,采用实时定量聚合酶链反应(real-time qPCR)检测ARID4B mRNA和DSN1 mRNA的表达水平.对130例经37％甲醛溶液固定、石蜡包埋的HCC组织样品进行免疫组织化学分析,以检测ARID4B和DSN1在HCC组织中的表达水平并确定其临床意义.结果生物信息学分析、RT-PCR结果表明,与ANLT相比,ARID4B和DSN1在HCC组织中高表达(P<0.05).ARID4B高表达与肿瘤结节数(P=0.042)、TNM分期(P=0.001)密切相关.DSN1高表达与性别(P=0.035)、甲胎蛋白(AFP)(P=0.005)、肿瘤结节数(P=0.023)密切相关.此外,Kaplan-Meier和Cox比例风险分析表明,ARID4B和DSN1高表达与HCC患者的不良生存率显著相关,并且ARID4B和DSN1是HCC患者整体生存和无病生存的独立预后因素.结论ARID4B和DSN1可作为预测HCC患者预后的生物学标志物.

目的 探讨mmu-miR-672-5p调控大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞凋亡的分子机制.方法 过表达或敲低mmu-miR-672-5p后,检测大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞的凋亡水平.过表达或敲低mmu-miR-672-5p后,通过RNA-seq检测mmu-miR-672-5p调控的基因.设定阈值后,通过siRNA敲低相关基因后,检测大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞的凋亡水平.通过荧光素酶报告实验验证mmu-miR-672-5p是否靶向此基因.过表达此基因后,通过免疫印迹检测CLEAVED-CAS3的表达水平,以及大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞的凋亡水平.结果 过表达mmu-miR-672-5p后,大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞的凋亡水平下降(P<0.05);敲低mmu-miR-672-5p后,大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞的凋亡水平上升(P<0.05).分别敲低和过表达mmu-miR-672-5p后,高通量测序发现大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞中多种基因的表达被调节,包括Zfp229、Zfp503、Slc4a5、Stk24、Tmem106b、Bax、Adgrb3、Tmem63b、Pmp22、Mroh2a、Dsn1、Pramef25、Naaladl2、Clk2、Stx16、Usp28、Clint1、Jph4、Msl2、Krtap8-1、Pkp2、Mllt3、Rai14.敲低上述基因后,发现仅敲低Bax时,大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞的凋亡水平下降(P<0.05).过表达Bax后,CLEAVED-CAS3的表达水平上升,大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞的凋亡水平上升(P<0.05).过表达mmu-miR-672-5p后,Bax的mRNA和蛋白水平均下降(P<0.05);敲低mmu-miR-672-5p后,Bax的mRNA和蛋白水平均上升(P<0.05).此外,mmu-miR-672-5p靶向Bax的3端非编码区(P<0.05).同时过表达mmu-miR-672-5p和Bax后,大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞的凋亡水平无显著变化(P>0.05);同时敲低mmu-miR-672-5p和Bax后,发现大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞的凋亡水平无显著变化(P>0.05).结论 mmu-miR-672-5p通过靶向Bax的3端非编码区,降低了Bax的表达水平,随后抑制了大鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞的凋亡.

目的 探讨不同抗体分型重症肌无力(myasthenia gravis ,M G)患者的临床特点.方法 收集114例临床确诊M G患者的临床资料.使用酶联免疫吸附法检测患者血清中的抗乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine re-ceptors antibody ,AChR Ab) 、肌肉特异性激酶抗体(antibody to muscle-specific kinase ,M uSK Ab) 、抗联接蛋白抗体(titin antibody ,Titin Ab)和抗兰尼碱受体抗体(ryanodine receptors antibody ,RyR Ab) .根据致病抗体AChR Ab 、M uSK Ab的表达情况将患者分为AChR Ab阳性组,MuSK Ab阳性组和双抗体阴性(double serum negative ,DSN )组,对3组的临床表现、实验室检查和胸腺病理进行分析;根据疾病严重程度相关抗体 Titin Ab和RyR Ab的表达情况,分为Titin Ab阳性组和Titin Ab阴性组,RyR Ab阳性组和RyR Ab阴性组,并比较两种抗体分型的阳性组和阴性组间的临床表现、实验室检查和胸腺病理,以及 Titin Ab阳性MG和RyR Ab阳性M G组的受累肌群.结果 AChR Ab (+)组 76例(66.7%) 、M uSK Ab (+)组 9例(7.9%) 、DSN 组 29例(25.4%) ,三组间甲状腺功能(100.0% vs. 33.3% vs. 58.6%)和自身抗体异常发生率(63.2% vs. 33.3% vs. 37.9%)以及胸腺病理患者比例(胸腺增生／萎缩 48.0% vs.33.3% vs. 71.4%,胸腺瘤 52.0% vs.66.7%vs. 28.6%)差异均有统计学意义( P＜ 0.05 ) ;组间两两比较,仅 AChR Ab (+)M G 甲状腺功能异常率高于MuSK Ab(+)MG及DSN MG组(均 P＜0.05) ,余差异均无统计学意义(均 P＞0.05).三组间不同临床分型(眼肌型与全身型)患者比例、球部症状和肌无力危象发生率差异均无统计学意义(均 P＞0.05). Titin Ab阳性组甲状腺功能异常率高于Titin Ab阴性组(100.0% vs. 33.3%, P＜0.05) ,自身抗体、胸腺病理、球部症状及肌无力危象患者比例差异两组间无统计学意义(均 P＞0.05) . RyR Ab阳性组胸腺瘤、肌无力危象发生率高于阴性组,自身抗体异常率低于阴性组(分别为66.7% vs. 32.1%、55.3% vs. 21.4%、30.0% vs. 57.1%,均 P＜0.05) ;甲状腺功能异常率和球部症状患者比例两组间差异无统计学意义( P＞0.05 ) . Titin Ab(+)M G较RyR Ab (+)MG患者易出现眼外肌在受累(100.0% vs. 60.0%,P＜0.05) ,而RyR Ab (+)MG更易出现球部肌肉(66.7% vs.25.0%,P＜0.05 )及呼吸肌受累(53.3% vs 20.8%,P＜0.05 ) .结论 AChR Ab 、M uSK Ab不同表达情况下,AChR Ab(+)M G易出现甲状腺功能异常,M uSK Ab(+)M G易合并胸腺瘤,而双阴性患者病情温和,胸腺病理多呈良性. RyR Ab(+)M G与Titin Ab(+)M G比较,RyR Ab(+)M G易有球部症状和呼吸肌受累,RyR Ab阳性MG病情更严重.

微小RNA(miRNA)作为肿瘤等多种疾病相关的一类核酸标志物,在疾病早期或预后阶段水平极低,需要提高miRNA检测灵敏度.双链特异性核酸酶(DSN)是近年来新发现的一种特异性水解DNA-RNA杂交链中DNA、而对单链RNA不产生作用的核酸酶;利用其酶切特性可导致miRNA循环再利用,从而实现miRNA检测信号放大.目前基于DSN酶切放大效应检测miRNA为一项热点研究,其与等温扩增及纳米材料相结合,主要在DSN介导的比色传感器、荧光传感器、电化学及电化学发光传感器等方面发展出许多miRNA检测新方法,为医学检验工作者提供了极具前景的miRNA技术工具.巧妙设计DNA探针、克服DSN部分局限性、增加新型纳米材料等则是基于DSN酶切放大效应检测miRNA新方法的未来研究发展方向.