目的:构建一种太赫兹（THz）超材料传感方法用于microRNA-21（miRNA-21）的信号放大检测。方法:首先构建THz超材料传感方法，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳及zeta电位验证方法的可行性；对传感器检测条件进行优化之后，对不同浓度的miRNA-21以及其他不同的miRNAs进行检测，并与其他microRNA检测方法进行比较；最后，对该传感器的回收率进行了评价。结果:在最优实验条件下，通过双链特异性核酸酶（DSN）循环识别与滚环扩增（RCA）的双重信号放大策略，该THz超材料传感器对靶标miRNA-21的响应范围为10 fmol/L至10 nmol/L，检测限为8.49 fmol/L。并且该传感器具有较好的特异性，具备了从多种miRNAs中识别靶标miRNA-21的能力，并且在商业化人血清样本中的回收率可达94.33%到115.33%。结论:该THz传感器可以实现靶标miRNA-21的高灵敏、高特异性检测，具备了在miRNA相关疾病无标记诊断与早期预警的潜力。

第二大类成簇规律间隔短回文重复序列与相关蛋白（CRISPR-Cas）包括靶向编辑双链DNA的Cas9、Cas12系统和靶向编辑单链RNA的Cas13系统。与传统的锌指核酸酶和转录激活样因子效应物核酸酶相比，第二大类CRISPR-Cas系统具有操作简单，特异性好，效率高等优点。近年来，第二大类CRISPR-Cas系统在妇科恶性肿瘤领域被广泛应用。因此，本文就其在妇科恶性肿瘤研究模型建立、肿瘤发病及耐药机制、功能基因筛选和靶向治疗等领域的研究进展进行综述。

在 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑中,借助于双链 DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用.为提高CRISPR/Cas9 系统介导 dsDNA 供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因 LacI 分别与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的 SpCas9 和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统(donor adapting system,DAS).首先在报告载体水平上对Cas9 核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复(homology-directed repair,HDR)效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用 CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达 30.5%,显著高于野生型.综上所述,本研究开发了新型的 CRISPR/Cas9-hLacI 供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9 基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具.

为构建高质量的丹参cDNA文库以及通过酵母双杂交获得丹参SrnJAZ8互作蛋白基因.研究以丹参的根、茎、叶、花、毛状根为材料,利用SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)方式合成全长cDNA,并结合基于双链的特异性核酸酶(duplex-specific nuclease,DSN)均一化技术,构建丹参的均一化全长cDNA文库.通过文库鉴定,检测到cDNA文库库容为1.45 × 106,重组率为100％,插入片段平均大小为500 ～2 000 bp.构建pDEST-pGADT7-SmJAZ8重组载体,将该载体转化Y2HGold菌种,通过酵母双杂交进行互作蛋白的筛选,最终筛选到了丹参DnaJ蛋白和UBQ蛋白.该研究既成功构建了丹参均一化全长cDNA文库,又为后续丹参功能基因筛选和基因功能的研究奠定了基础.

双链特异性核酸酶(DSN酶)是一种能高效识别并酶切完全互补配对的DNA双链或者DNA/RNA杂交双链中的DNA链,而对单链DNA和单/双链RNA几乎没有作用的核酸酶,所以DSN酶在生物和医学等领域有着广泛的应用.目前,基于DSN酶对单双链核酸不同的切割特点,搭载不同的信号输出及扩增方式,已经建立了一系列生物传感技术,如比色法、荧光法及电化学法等.实现了miRNAs、mRNA及重金属离子等一系列生物标志物及食品安全风险因子的检测.另外,DSN酶与新兴纳米材料搭载的纳米传感器也在RNA等物质传感中显示出了极大的分析优势.首先从结构、性质和切割方式3个方面介绍了DSN酶,并对近年来基于DSN酶介导的、具有代表性的生物传感器的组建及应用情况进行了综述,主要是根据不同的信号输出方法对DSN酶介导的核酸传感器进行归类综述,包括光学传感器、电化学传感器和光磁传感器等.具体综述内容包括,详细地阐述了各种传感器的传感原理,综合比较了各传感器的检测范围及检测灵敏度等,同时还归纳了目前DSN酶介导的生物传感器能够检测的靶物质类型,有助于人们以后对DSN酶更深层次的使用.最后,对DSN酶介导的生物传感器目前存在的不足及今后的发展趋势进行了展望,旨在指导人们在未来使用DSN酶介导的生物传感器中能避免相关问题,研发出更快捷、更方便、灵敏度更高的生物传感器.

CRISPR/Cas系统从发现和应用以来,热度持续上升.在过去几年中,这种技术已经成为了基因编辑的标准方案.该技术用一条指导RNA(guide RNA)来引导Cas9或Cpf1等核酸酶在特定的位点实现双链打断.但是这种系统也有可能在非特异性的位置进行切割,这种现象成为“脱靶效应”.脱靶剪切现象可能会给基因功能研究或者临床治疗带来很多麻烦.为了深入研究Cpf1的特异性,本研究通过一套双荧光报告系统探索了单核苷酸错配的影响.结果 表明,间隔区内的poly(T)结构会阻止Cpf1的靶向切割.而且rA的错配似乎是CRISPR/Cpf1容忍度最低的一类,这与CRISPR/Cas9的情况相同.这种相似性可能来源于两种酶在进化上的同源性.上述结果表明,在使用CRISPR/Cp1或者CRISPR/Cas9的时候应当更多注意其脱靶效应,因为这种效应是这套系统的一个内在特性.

为研究单增李斯特菌(LM)核糖核酸酶RnaseⅢRncS氨基酸突变对RNA降解活性的影响.利用生物信息学软件分析单核细胞增生李斯特菌(LM)野毒株SB5中rncS基因编码的RnaseⅢ的结构域,并选择关键氨基酸利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对其进行了基因突变;然后将rncS突变基因片段D50A、E122A克隆至表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达;应用SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况及其抗原特异性;通过体外酶活试验研究其对RNA降解活性的影响.结构域分析结果显示,LM-RnaseⅢ氨基酸序列含有1个双链RNA结合结构域(DSRM)和1个核酸酶结构域(RIBOc),其中结构域RIBOc含有5个活性位点.SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组突变型RnaseⅢ-D50A和RnaseⅢ-E122 A蛋白相对分子质量均为42.5 kD,与理论值相符;Western blot分析表明重组突变型RnaseⅢ-1)50A和RnaseⅢ-E122A蛋白可与LM阳性血清发生免疫学反应.体外酶活实验表明,RnaseⅢ发挥降解活性依赖于Mn2+或Mg2+,将其第50位天冬氨酸突变后,RnaseⅢRncS的降解活性有所降低(P＜0.001);第122位谷氨酸突变后,RnaseⅢRncS降解活性极显著下降(P＜0.0001),提示第122位谷氨酸是维持LM RnaseⅢRncS酶活性的关键位点.

目的 反义核酸是一段与靶基因互补的单链寡核苷酸序列,通过与细胞内核酸杂交成双链结构抑制靶基因转录和翻译过程,从而调控基因表达.然而,无载体递送反义核酸跨膜能力较差且寡核苷酸磷酸二酯键易被核酶水解.为提高反义核酸入胞效率,并对活性作用的发挥进行进一步优化,本课题主要从寻求高效低毒的载体系统及优化修饰策略入手对其进行研究.方法 本研究利用中性胞苷脂材(DNCA)混合阳离子脂质体(CLD)对反义核酸G3139包载递送,结合部分位点磷硫代(PS)修饰方式,考察不同修饰位点的序列活性与作用机制.结果 与结论 采用混合脂材包载能显著提高反义核酸G3139的抗MCF7/ADR细胞增殖能力,并发现9 ～16位(5'-端计算)区域内多位点(≥4)修饰物抗肿瘤活性较高.此外,G3139部分位点PS修饰物有效激活RNase H降解靶mRNA,并降低杂交双链Tm(DNA的熔解温度)值.结合转录组学与蛋白组学研究,确证减少PS修饰位点数可以降低反义核酸与非特异性靶标结合,从而降低毒副作用.

目的:将信号放大策略用于荧光法实现血液中低浓度汞离子的检测.方法:将汞离子加入到富含胸腺嘧啶且3'端荧光标记的单链DNA溶液中,汞离子介导该特异序列形成分子内的双链结构,且该双链DNA具有3'凹端,因此能够被核酸外切酶Ⅲ水解并释放出荧光标记的单核苷酸,当加入二硫化钨(WS2)后,荧光标记的单核苷酸不能被二硫化钨吸附从而荧光信号明显增加.对WS2和ExoⅢ的量进行优化考察,对方法的线性、检测限、特异性等性能进行验证.3个不同浓度汞离子在血浆样品中的加样回收率也进行验证.结果:汞离子在1～30 nmol·L-1和30～250 nmol·L-1范围内线性关系良好,r分别为0.9936和0.9952,检测限为0.1 nmol·L-1,加样回收率分别为110.0％,116.0％,90.9％,RSD分别为16.5％,18.7％,17.8％(n=6).结论:建立的荧光法可以实现血液中低含量汞离子的检测,为临床上检测汞离子提供一种新方法.

[目的]建立一种测定miR-21含量新型实验方法.[方法]利用microRNA-21(miR-21)作为靶标,并设计基于双链特异性核酸酶(Duplex specific nuclease,DSN)及杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)的探针MP、H1及H2,通过加入靶标从而引起DSN和HCR反应,达到双重信号放大的目的,最终信号输出方式为DNAzyme显色,裸眼可视,根据其产生颜色强度对靶标进行定量检测.[结果]DSN结合HCR靶标的最低检测限可达1 pmol/L,线性范围为1 pmol/L～1μmol/L,特异性良好,除靶标miR-21外,非特异性靶标均无明显信号产生,在人体血清实际样品中检测miR-21,其回收率可达到92.3％～101.5％.[结论]该检测方法成功建立测定miR-21含量的技术平台,灵敏性可达1 pmol/L,且特异性好、快速可视,为研究及临床诊断心血管疾病提供技术依托.