目的:基于永离有丝分裂基因A相关激酶9(NEK9)/转移相关肿瘤基因家族2(MTA2)信号通路泛素化修饰探讨胃癌(GC)的转移机制.方法:使用癌症基因组图谱(TCGA)和Kaplan-Meier Plotter数据库分析NEK9表达与GC分期、预后之间的关联.体外实验中,将GC细胞分为:对照组、shNC 组、shNEK9 组、shNC+NC-OE 组、shNEK9+NC-OE 组和 shNEK9+MTA2-OE 组.分别采用 MTT 和Transwell法测定细胞的增殖、迁移和侵袭,并通过 Western blot检测 NEK9、MTA2、上皮间充质转化(EMT)标记和PI3K/AKT信号通路蛋白表达.结果:TCGA数据库分析显示,NEK9 mRNA在肿瘤组织中的表达明显上调,并且与TNM分期较晚和NEK9高表达者的预后较差密切相关.此外,NEK9在7个GC细胞系中的表达明显高于正常胃上皮GES-1细胞(P＜0.05).与对照组相比,shNEK9组细胞活力、相对集落形成、EdU阳性细胞数、侵袭和迁移细胞数均显著降低(P＜0.05).此外,在shNEK9组细胞中,E-钙粘蛋白水平上调(P＜0.05),波形蛋白水平下调(P＜0.05).通过免疫共沉淀试验证明NEK9与MTA2有相互作用.NEK9敲低加速了 HGC-27细胞中MTA2的降解,并且 MTA2泛素化在NEK9沉默的细胞中增加.与shNEK9+NC-OE组组相比,shNEK9+MTA2-OE组相对集落形成、EdU阳性细胞数和迁移和侵袭数均显著增加(P＜0.05).结论:NEK9在GC中明显上调,其敲低在体外抑制GC细胞的生长和转移.NEK9可能通过去泛素化途径稳定 MTA2进而激活PI3K-AKT信号通路来对GC细胞产生促癌影响.

目的:观察经皮耳缘迷走神经刺激对大鼠射血分数保留性心力衰竭模型心肌结构重塑、电重塑及凋亡的干预作用，并探讨这种作用与氧化应激反应的关系。方法:通过对SD大鼠建立动静脉瘘后2周使用结扎的方法封闭动静脉瘘，在短期内增加心脏容量负荷从而构建大鼠射血分数保留性心力衰竭模型。40只大鼠随机分为4组，每组各10只：假手术组、腹主动脉-下腔静脉瘘+封闭组(AVF+L)、腹主动脉-下腔静脉瘘+封闭+经皮耳缘迷走神经刺激组(AVF+L+tVNS)及腹主动脉-下腔静脉瘘+封闭+经皮耳缘迷走神经刺激+乙酰胆碱M 2受体拮抗剂使用组(AVF+L+tVNS+M －)。AVF+L+tVNs组在AVF+L基础上进行经皮耳缘迷走神经刺激。AVF+L+tVNS+M －组在AVF+L+tVNs组基础上每天尾静脉注射乙酰胆碱M 2受体拮抗剂美索曲明(0.5 mg/kg)。通过心脏超声仪和心脏电生理刺激仪获得各组大鼠心脏结构重塑及电重塑的相关参数。酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组大鼠B型尿钠肽前体(NT-proBNP)及氧化应激相关指标的值。苏木素伊红(HE)染色观察心肌结构破坏、细胞排列紊乱及炎性细胞浸润情况。缺口末端标记法(TUNL)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blotting)法检测心肌B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(BCL-2)、BCL-2基因家族中细胞凋亡促进基因(BAX)mRNA及蛋白的表达。 结果:AVF+L组大鼠出现以心室壁肥厚及舒张功能不全为特征性的心力衰竭，且左心室射血分数(LVEF)均>50%，考虑大鼠射血分数保留性心力衰竭模型构建成功。HE染色提示AVF+L组大鼠心肌组织结构破坏、细胞排列紊乱及炎性细胞浸润明显，而AVF+L+tVNs组大鼠较AVF+L组心肌组织病理改变均明显缓解。与AVF+L组比较，AVF+L+tVNs组大鼠NT-proBNP值降低[(301.25±16.07)ng/L比(79.33±5.63)ng/L， P<0.05]、E/A值升高(1.28±0.06比1.66±0.05， P<0.05)、BCL-2 mRNA的表达升高[0.08(0.07，0.08)比0.70(0.64，0.76)， P<0.05]及BCL-2蛋白的表达升高(0.19±0.03比0.46±0.04， P<0.05)、BAX mRNA的表达降低(5.00±0.32比2.14±0.36， P<0.05)及BAX蛋白的表达降低(0.76±0.04比0.43±0.05， P<0.05)、凋亡指数亦降低(16.26±0.32比7.04±0.24， P<0.05)。并且与AVF+L组比较，AVF+L+tVNs组大鼠心肌结构重塑、电重塑及氧化应激相关指标均降低( P<0.05)。与AVF+L组比较，AVF+L+tVNS+M －组大鼠上述指标差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:tVNS可缓解HFpEF大鼠的心肌结构重塑、电重塑及凋亡状态，这种效应可能与降低氧化应激反应活性相关。

目的:观察黄芪甲苷对溶血磷脂酸（LPA）诱导的小鼠神经母细胞瘤细胞（N1E-115）神经突起回缩的影响，探讨其作用机制。方法:将N1E-115细胞按随机数字表法分为空白组、模型组及0、40、80 μg/ml黄芪甲苷组。0、40、80 μg/ml黄芪甲苷组分别以20、40、80 μg/ml黄芪甲苷干预24 h，空白组及模型组不做药物干预，每组以无血清培养12 h，模型组及黄芪甲苷各浓度组以40 μmol/L的LPA干预10 min。于倒置显微镜观察并拍照，采用Image J软件计数N1E-115细胞神经突起数量；采用免疫荧光染色法检测细胞RAS同源基因家族成员A（RhoA）、Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶2（ROCK2）、p-ROCK2、磷酸化肌球蛋白轻链2（p-MLC2）蛋白表达；荧光实时定量PCR法检测RhoA、ROCK2 mRNA水平；Western blot法检测RhoA、ROCK2、p-MLC2、肌球蛋白轻链2（MLC2）蛋白表达。结果:与20 μg/ml黄芪甲苷组比较，40、80 μg/ml黄芪甲苷组神经突起回缩抑制率升高（ P<0.05）；与模型组比较，20、40、80 μg/ml黄芪甲苷组RhoA、p-ROCK2、p-MLC2蛋白平均荧光强度及40 μg/ml黄芪甲苷组ROCK2蛋白平均荧光强度降低（ P<0.05或 P<0.01）；20、40、80 μg/ml黄芪甲苷组RhoA mRNA［（0.89±0.09）、（0.41±0.01）、（0.09±0.03）比（1.50±0.01）］、ROCK2 mRNA［（0.89±0.09），（0.14±0.01），（0.20±0.01）比（1.62±0.17）］水平降低（ P<0.05或 P<0.01）；20、40、80 μg/ml黄芪甲苷组ROCK2蛋白［（0.75±0.06，0.57±0.02，0.66±0.01）比（1.08±0.02）］、p-MLC2蛋白［（1.72±0.03）、（1.40±0.04）、（1.29±0.03）比（2.19±0.11）］、MLC2蛋白［（1.13±0.02）、（0.68±0.03）、（0.75±0.03）比（1.60±0.03）］及40、80 μg/ml黄芪甲苷组RhoA蛋白［（0.35±0.01）、（0.40±0.03）比（0.57±0.08）］表达降低（ P<0.05或 P<0.01）。 结论:黄芪甲苷可阻止LPA诱导的神经突起回缩，促进受损神经再生，其机制可能与下调RhoA-ROCK2通路RhoA、ROCK2、p-ROCK2、p-MLC2、MLC2蛋白表达，抑制神经生长锥崩溃有关。

AP3/DEF(APETALA3/DEFICIENS)基因为MADS-box基因家族的B类基因,在花发育过程中主要参与调控花瓣和雄蕊发育.对盐肤木(Rhus chinensis)AP3/DEF同源基因进行克隆及功能分析,有助于探究其在盐肤木雄蕊发育过程中的作用.采用RT-PCR技术获得盐肤木AP3/DEF同源基因CDS;利用NCBI CD Search对其序列和结构域进行比较分析;利用酵母双杂交系统,对AP3/DEF同源蛋白与盐肤木中其它MADS-box转录因子进行蛋白互作验证;通过实时荧光定量PCR分析盐肤木AP3/DEF同源基因的时空表达模式;用过表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)验证盐肤木AP3/DEF同源基因在花器官发育中的功能.结果表明,克隆得到2个盐肤木AP3/DEF同源基因分别命名为RcAP3(GenBank:OR962160)和RcTM6(GenBank:OR962159),根据其氨基酸保守结构域比对及系统进化分析,发现这2个蛋白序列与漆树科的芒果(Mangifera indica)和阿月浑子(Pistacia vera)AP3/DEF同源蛋白亲缘关系最近.酵母双杂交结果表明,RcAP3和RcTM6与盐肤木B类蛋白RcPI、C类蛋白RcAG和Rcag存在互作关系,但与A类和E类蛋白不存在互作关系.实时荧光定量PCR分析结果显示,RcAP3和RcTM6基因在不同性别盐肤木花芽快速发育期高表达,在花芽发育早期和开花后表达水平较低;RcAP3在雌花、雄花和两性花的花芽分化过程中均维持较高的表达水平,而RcTM6在两性花中显著表达,在雄花和雌花中表达量很低.两性花快速生长期,RcAP3在花瓣和雄蕊中高表达且差异很小,而RcTM6在雄蕊中的表达量显著高于其它花器官.RcAP3基因能恢复拟南芥ap3-3突变体花瓣和雄蕊的缺陷表型,RcTM6过表达则导致拟南芥花瓣、雄蕊和子房缩短,花药败育,表明盐肤木中同属AP3/DEF亚家族的同源基因RcAP3和RcTM6存在功能分化.RcAP3促进花瓣和雄蕊发育,而RcTM6抑制雄蕊发育.研究结果为进一步研究盐肤木性别分化的分子机制奠定了基础.

[目的]泛素结合酶E2(UBC)作为泛素蛋白酶体途径中将泛素转移至靶蛋白的重要中转酶,与植物的生长发育和许多胁迫有关.从辣椒全基因组中鉴定E2 基因家族成员,分析相关基因表达模式,为后续研究提供理论基础.[方法]基于辣椒全基因组信息,利用生物信息学方法对E2 基因家族进行鉴定,系统分析该家族成员的基本理化性质、亚细胞定位、染色体定位、基因结构、系统进化关系、顺式作用元件、蛋白质互作网络、非生物胁迫响应与组织器官表达模式.[结果]辣椒E2家族有 48 个成员,在 11 条染色体上呈不均匀地分布,其编码蛋白主要定位于细胞外和细胞核中;通过对辣椒、番茄和拟南芥的比较进化分析将其分为Group I-Group XIII亚族,同一亚族具有相似的蛋白保守基序和基因结构;发现共有 26 个蛋白之间存在互作;顺式作用元件分析表明,CaUBC基因启动子区含有大量光响应、激素响应元件,上游 2 000 bp区域中存在多种与生长发育和抗逆性相关的顺式作用元件;CaUBC参与胁迫响应,在不同非生物胁迫和激素处理下,将其分为 3 类,其中高温环境下第 3 类基因为高表达;在组织器官中表现出不同的表达,其中CaUBC38 在果实中的表达量变化较为明显,进行RT-qPCR分析发现,50 d相对表达量最高,10 d表达量最低.[结论]获得 48 个辣椒E2(CaUBC)基因,揭示了E2 家族不同成员在辣椒生长发育和非生物胁迫过程中的表达特征.

ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase,CPS)与ent-贝壳杉烯合酶(ent-kaurene synthase,KS)的连续催化是植物以香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)为底物开启赤霉素生物合成路径的关键步骤.该研究通过分析与挖掘瑞香狼毒的转录组数据,成功克隆得到赤霉素途径的 2 个关键二萜合酶基因SchCPS和SchKS.二者完整开放阅读框分别为 2595、1701 bp,编码864、566 个氨基酸残基,生物信息学分析预测其相对分子质量分别为97.9、64.6 kDa,理论等电点为 5.61、6.12,均为亲水性蛋白.序列比对及系统发育树显示,SchCPS蛋白含有CPS基因家族保守的LHS、PNV及DxDD基序,归类于TPS-c亚家族;SchKS蛋白含有KS基因家族保守的DDxxD、NSE/DTE和PIx基序,归类于TPS-e亚家族.功能验证结果表明,SchCPS可催化GGPP质子化并环化成ent-CPP,SchKS则作用于ent-CPP去磷酸化并再次环化生成贝壳杉烯.该文首次从瑞香狼毒中克隆获得SchCPS与SchKS全长基因,并完成功能验证,不仅丰富了现有的CPS和KS基因库,也为瑞香狼毒中更多活性成分基因的克隆与生物合成途径解析奠定了基础.

目的:明确溶质转运体家族蛋白SLC35E在多菌型(MB)与少菌型(PB)麻风皮损中的差异.方法:首先收集25例确诊为麻风感染患者的石蜡包埋皮损组织,其中多菌型麻风患者12例,少菌型13例,分析SLC35E1和SLC35E2B不同SNP位点的突变情况;同时收集12名健康对照者皮肤组织作为正常对照组,采用免疫组化染色法检测SLC35E1、SLC35E2B、CD68、S100在上述皮损及正常对照组中的表达差异,免疫荧光染色法检测CD68、S100与SLC35E1、SLC35E2B蛋白在皮损组织中的共表达情况.结果:对25例麻风组织样本进行生物信息学分析,SLC35E1的SNP位点rs202071873在麻风患者中的突变率为0％,SLC35E2B的3个SNP位点rs12729295、rs1 17820608、rs2072923在麻风患者中的突变率分别为100％、40％,100％.免疫组化染色显示SLC35E1、SLC35E2B、CD68、S100在麻风组织的真皮及表皮均有表达,其中CD68主要表达于麻风组织真皮,SLC35E1在真皮层的表达量与CD68基本一致,两者表达量基本呈正相关;S100在麻风患者表皮和真皮中的表达无显著差异,与SLC35E1、SLC35E2B表达量无明显相关性;与少菌型麻风相比,多菌型麻风患者SLC35E1在真皮层呈低表达(P=0.046);与健康对照组相比,多菌型麻风患者SLC35E2B在表皮层呈低表达(p=0.004);免疫荧光共染显示麻风组织皮损中CD68与SLC35E1、SLC35E2B蛋白共染均出现重叠结果,且与SLC35E1重叠荧光强度高于SLC35E2B;S100与SLC35E1、SLC35E2B蛋白共染未见重叠结果.结论:麻风患者皮损中可能存在SLC35E2B位点突变,SLC35E1的表达可预测多菌型(MB)与少菌型(PB)麻风在真皮层感染差异,SLC35E1、SLC35E2B可能通过影响巨噬细胞功能干扰机体对麻风分枝杆菌的清除,进而影响麻风的发病.

目的:探讨环状RNA(CircRNA)BICD2调节miR-218-5p/Ras同源基因家族成员A(RhoA)轴对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响.方法:qRT-PCR、Western blot分别检测OSCC组织、癌旁组织、人口腔上皮细胞系HOEC及OSCC细胞系HSC-4、CAL-27、SCC-15中CircBICD2、miR-218-5p表达及RhoA蛋白表达;将SCC-15细胞分为 Ct 组(A,未转染对照)、si-NC 组(B)、si-CircBICD2 组(C)、miR-NC 组(D)、miR-218-5p 组(E)、si-CircBICD2+anti-NC 组(F)、si-CircBICD2+anti-miR-218-5p 组(G),qRT-PCR 检测细胞中 CircBICD2、miR-218-5p 表达;CCK-8 法和平板克隆实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测RhoA、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表达;双荧光素酶验证CircBICD2与miR-218-5p、miR-218-5p与RhoA的关系.结果:在OSCC组织和细胞中,CircBICD2、RhoA蛋白高表达,miR-218-5p低表达,在SCC-15细胞中miR-218-5p相对表达量最低,CircBICD2表达及RhoA蛋白相对表达量最高(P＜0.05).后续实验取SCC-15细胞为研究对象;与B组比较,C组CircBICD2、RhoA蛋白表达降低,miR-218-5p表达升高(P＜0.05);与D组比较,E组miR-218-5p表达上调,RhoA蛋白表达下调(P＜0.05);与C组、F组相比,G组miR-218-5p表达降低,RhoA蛋白表达升高(P＜0.05).下调CircBICD2或过表达miR-218-5p均可抑制SCC-15细胞增殖和EMT,促进细胞凋亡;下调miR-218-5p减弱了沉默Cir-cBICD2对SCC-15细胞增殖、EMT的抑制作用以及对细胞凋亡的促进作用;CircBICD2靶向调控miR-218-5p/RhoA轴.结论:沉默CircBICD2可能通过上调miR-218-5p来抑制RhoA表达,抑制SCC-15细胞增殖、EMT,促进细胞凋亡.

丙酮酸脱氢酶 E1 组分 β 亚基-1(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta-1,PDHB-1)基因是编码丙酮酸脱氢酶复合物E1 酶β亚基的基因,在果实酸度积累过程中具有重要作用.为了探究苹果(Malus domestica L.)PDHB-1家族的进化特征及其在不同酸含量苹果中的表达情况,本研究利用NCBI、Pfam等数据库和ClustalX、MEGA、TBtools等软件进行生物信息学分析,通过结合可滴定酸含量测定与实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析,获得该家族基因在'艾斯达'和'成纪 1 号'2 个不同酸含量的苹果中的表达情况.PDHB-1家族主要定位于叶绿体、细胞质和线粒体中,α-螺旋和不规则卷曲是该家族二级结构形成的主要因素.组织特异性表达谱显示大部分成员的表达量在果实中高于其他组织.qRT-PCR 结果表明,大部分成员其表达量变化趋势与可滴定酸含量变化趋势一致,在果皮中,有 14 个成员的表达水平在酸含量较高的'艾斯达'苹果中显著高于酸含量较低的'成纪 1 号',其中MdPDHB1-15差异最显著;在果肉中,17 个成员的表达水平在'艾斯达'苹果中显著高于'成纪 1 号',MdPDHB1-01表达量最高.预测苹果PDHB-1基因家族在苹果果实酸度积累过程中有重要调控作用.

[目的]本研究为开展WRKY基因功能验证提供基础,进而为大黄药材品质形成的转录调控机制研究提供科学依据.[方法]基于掌叶大黄(R.palmatum L.)的全长转录组数据,通过生物信息学方法鉴定掌叶大黄WRKY基因家族成员,分析其蛋白理化性质、结构域、系统发育关系、蛋白互作,结合转录组数据进行不同组织和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理的表达谱分析.[结果]掌叶大黄WRKY基因家族包含 53 个成员,编码蛋白氨基酸数量为 192-748,均为亲水性蛋白,预测定位均在细胞核.掌叶大黄WRKY基因家族与拟南芥WRKY基因家族成员进化树可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3 个亚族,其中Ⅱ亚族WRKY占比最高(58.49%).转录组数据分析显示掌叶大黄WRKY基因家族成员在掌叶大黄根、根茎和叶中差异表达,其中 7 个基因在根和根茎中表达量较高,12 个基因响应MeJA处理呈差异表达,其中 10 个被MeJA显著诱导,4 个候选基因RpWRKY5/6/9/33 的qPCR分析与其转录组结果基本一致.蛋白互作网络显示RpWRKY2/16/20/22/23 与查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)发生相互作用.[结论]获得 53 个掌叶大黄WRKY基因、生物信息、组织及响应MeJA的表达特征,其中 5 个可能与大黄蒽醌类物质的合成有关.