家族性糖皮质激素缺乏症4型(FGD4)是由尼克酰胺转氢酶(NNT)基因变异导致的1种罕见的常染色体隐性遗传病。本文收集1例FGD4患儿的临床资料、实验室检查和基因变异结果，并回顾性分析国内外报道的FGD4患儿临床资料，汇总基因变异类型及临床特征。本病例发现NNT基因新的变异位点，为FGD4患儿早期诊断和早期治疗提供依据。

回顾性分析2014年11月南京医科大学附属儿童医院内分泌科诊治的1例 NNT基因突变致家族性糖皮质激素缺乏症(FGD)患儿的临床资料及诊治过程。患儿，女，1岁5个月，以"皮肤颜色深0.5年"就诊。实验室检查提示皮质醇降低、促肾上腺皮质激素增高，随访过程中患儿出现抽搐和性早熟。全外显子组测序发现患儿 NNT基因8号外显子纯合突变c.1054G>A(p.G352R)，为新发突变。国内尚未见 NNT基因突变患者报道。文献复习发现 NNT突变致FGD患儿(共40例)除典型的全身皮肤黏膜色素沉着、低血糖和抽搐表现外，还可合并盐皮质激素缺乏、性早熟、男性性腺发育异常、甲状腺疾病和心脏疾病等。

目的 检测膀胱癌中长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase antisense RNA 1,NNT-AS1)表达情况,研究其对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响及可能分子机制.方法 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测膀胱癌组织标本及细胞中LncRNA NNT-AS1表达情况;将膀胱癌细胞转染分为sh-NC组,sh-NNT-AS1组,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组和sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组.采用CCK-8法检测细胞增殖吸光度值(A值);Transwell实验检测细胞迁移、侵袭穿膜数;细胞成球实验检测干细胞干性.检索starBase和TargetScan数据库,并通过双荧光素酶报告基因实验预测验证LncRNA NNT-AS1 和miR-582-5p,miR-582-5p与NCKAP1 的靶向结合关系.Western blot检测膀胱癌干细胞标志蛋白(CD44,ALDH1A1,Oct4,Nanog)及Hippo-YAP/TAZ信号通路相关蛋白表达灰度值.结果 与癌旁组织相比,膀胱癌组织中LncRNA NNT-AS1表达水平(0.34±0.07 vs 1.15±0.21)明显升高,差异有统计学意义(t=16.364,P＜0.001).与人正常膀胱上皮SV-HUC-1 细胞(1.00±0.01)相比,膀胱癌细胞T24,5637,UM-UC-3和TCC-SUP中LncRNA NNT-AS1 表达(6.03±0.17,4.66±0.36,5.47±0.26,3.02±0.20)明显升高,差异有统计学意义(t=17.472～51.160,均P＜0.001).与sh-NC组相比,在24,48和72 h时sh-NNT-AS1组细胞增值能力(A值)均显著降低(0.80±0.01 vs 1.07±0.06,1.18±0..07 vs 1.83±0.03,1.89±0.07 vs 2.53±0.06),差异有统计学意义(t=7.688,14.783,12.024,均P＜0.05);sh-NNT-AS1 组细胞迁移穿膜数(55.00±2.65 个 vs 354.30±7.84 个)、细胞侵袭穿膜数(45.67±2.33 个 vs 303.00±9.07 个)及膀胱癌干细胞成球数(20.85±2.17 个 vs 41.35±3.67 个)显著降低,差异具有统计学意义(t=-62.641,-47.596,8.328,均P＜0.001).与sh-NC组相比,sh-NNT-AS1组细胞中CD44(0.04±0.01 vs 1.12±0.02),ALDH1A1(0.23±0.01 vs 1.16±0.05),Oct4(0.17±0.02 vs 1.10±0.04),Nanog(0.49±0.03 vs 1.24±0.03)的蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=83.656,31.591,36.019,30.619,均P＜0.001).与si-NC组相比,sh-NNT-AS1组CD44+CD133+细胞比例(9.30%±0.79%vs 88.50%±2.77%)明显降低,差异有统计学意义(t=-47.624,P＜0.001).双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-582-5p为LncRNA NNT-AS1靶基因,NCKAP1为miR-582-5p靶基因;LncRNA NNT-AS1 靶向调控miR-582-5p/NCKAP1 轴.与sh-NNT-AS1 组相比,在 24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞增值能力(A值)均明显升高(0.98±0.03 vs 0.73±0.06,1.74±0.04 vs 1.22±0.05,2.33±0.16 vs 1.69±0.14),差异有统计学意义(t=5.977～11.628,均P＜0.001).与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,在 24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组细胞增值能力(A值)显著降低(0.69±0.04,1.01±0.07,1.39±0.08),差异有统计学意义(t=7.877～16.323,均P＜0.001).与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞迁移穿膜数(322.31±28.45个 vs 81.42±13.22 个)、细胞侵袭穿膜数(316.07±30.21 个 vs 92.13±12.65 个)及膀胱癌干细胞成球数(38.55±2.20个 vs 18.98±1.16 个)显著增加,差异具有统计学意义(t=15.115,13.158,14.592,均P＜0.001).与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞CD44(1.05±0.08 vs 0.10±0.01),ALDH1A1(1.20±0.16 vs 0.22±0.02),Oct4(1.32±0.14 vs 0.19±0.03),Nanog(0.97±0.12 vs 0.15±0.04),YAP(1.29±0.11 vs 0.42±0.07)和TAZ(1.41±0.16 vs 0.35±0.05)蛋白表达灰度值均显著增加,差异具有统计学意义(t=10.650～21.243,均P＜0.001).与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1 组细胞迁移穿膜数(65.33±12.60 个)、细胞侵袭穿膜数(71.08±15.19 个)、膀胱癌干细胞成球数(11.36±1.05 个)均显著降低,差异具有统计学意义(t=16.125,14.395,21.365,均P＜0.001).与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞CD44(0.25±0.05),ALDH1A1(0.61±0.11),Oct4(0.22±0.08),Nanog(0.44±0.07),YAP(0.25±0.09)和TAZ(0.30±0.04)蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=6.412～17.889,均P＜0.001).结论 膀胱癌中LncRNA NNT-AS1 表达上调,其对膀胱癌细胞增殖、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响,可能是通过调控miR-582-5p/NCKAP1 分子轴,激活Hippo-YAP/TAZ信号通路完成.

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1(NNT-AS1)在非小细胞肺癌(NSCLC)进展中的潜在机制.方法 30例NSCLC组织和癌旁正常组织获自于2020年6-12月在空军军医大学第二附属医院接受手术切除的NSCLC患者,NSCLC细胞系H1650、A549、H1299、H2170以及人肺上皮细胞BEAS-2B常规培养.将A549细胞分为siRNA阴性对照(si-con)组、靶向NNT-AS1的siRNA(si-NNT-AS1)组、miR-142-3p抑制物阴性对照(si-NNT-AS1+in-miR-con)组、miR-142-3p 抑制物(si-NNT-AS1+in-miR-142-3p)组、锌指 E 结合蛋白 1(ZEB1)阴性对照空载(si-NNT-AS1+vector)组和ZEB 1过表达质粒(si-NNT-AS1+ZEB1)组.BALB/c雄性裸小鼠随机分为sh-NC组(n=5)和sh-NNT-AS1组(n=5),分别将转染sh-NC或sh-NNT-AS1慢病毒的A549细胞皮下注射到裸小鼠背部.35 d后切除肿瘤,测量肿瘤组织重量和体积.qRT-PCR检测NSCLC组织和细胞中NNT-AS1、miR-142-3p和ZEB1水平;双荧光素酶报告基因实验探究3个因子之间的作用关系.细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞增殖,集落形成实验测定集落形成数量,Tranwell测定迁移和侵袭细胞数量,肿瘤异种移植实验检测体内肿瘤生长情况.结果 与癌旁正常组织比较,NSCLC组织中 NNT-AS1 和ZEB1 mRNA上调[(3.28±0.26)vs.(1.05±0.04),(2.65±0.22)vs.(1.04±0.06)],miR-142-3p下调[(0.43±0.03)vs.(1.02±0.08)],差异均有统计学意义(P均＜0.05).与人肺上皮细胞 BEAS-2B 比较,NSCLC 细胞系 H1650、A549、H1299、H2170 中 NNT-AS1 和 ZEB1 mRNA 上调,miR-142-3p 下调,差异均有统计学意义(P均＜0.05);且A549细胞中NNT-AS1、miR-142-3p和ZEB1 mRNA表达差异变化最大,因此选择A549细胞继续进行后续的探究.与miR-NC组比较,A549细胞中miR-142-3p转染后降低了 NNT-AS 1-WT或ZEB 1-WT的荧光素酶活性,差异均有统计学意义(P均＜0.05).与si-con组比较,si-NNT-AS1组A549细胞中NNT-AS1和ZEB1 mRNA、蛋白表达降低,miR-142-3p表达增高,差异均有统计学意义(P均＜0.05);与si-NNT-AS 1+in-miR-con组比较,si-NNT-AS1+in-miR-142-3p组A549细胞中ZEB1 mRNA和蛋白表达升高,miR-142-3p表达降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05);与si-NNT-AS1+vector组比较,si-NNT-AS1+ZEB1组A549细胞中ZEB1 mRNA和蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P均＜0.05).与si-con组比较,si-NNT-AS 1组A549细胞活力[(0.42±0.04)vs.(0.84± 0.07)]、集落形成数量[(54.23±5.64)个vs.(117.36±11.24)个]、迁移和侵袭细胞数量[(72.16±6.54)个vs.(164.23± 12.34)个和(65.23±5.27)个vs.(123.18±10.21)个]均下调,细胞凋亡率[(21.69±2.54)％vs.(7.54±0.72)％]上调,差异均有统计学意义(P 均＜0.05);与 si-NNT-AS 1+in-miR-con 组比较,si-NNT-AS1+in-miR-142-3p 组 A549 细胞活力、集落形成数量、迁移和侵袭细胞数量均上调,细胞凋亡率下调,差异均有统计学意义(P均＜0.05);与si-NNT-AS1+vector组比较,si-NNT-AS 1+ZEB1组A549细胞活力、集落形成数量、迁移和侵袭细胞数量均上调,细胞凋亡率下调,差异均有统计学意义(P均＜0.05).体内实验表明,与sh-NC组比较,sh-NNT-AS 1组肿瘤组织中NNT-AS 1和ZEB1 mRNA表达降低,miR-142-3p表达增高,肿瘤体积、重量以及增殖细胞核抗原(Ki67)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达显著降低,差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 沉默NNT-AS1抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,可能与miR-142-3p/ZEB1轴有关.

目的 探讨山东地区汉族儿童先天性甲状腺功能减低症(CH)烟酰胺核苷酸转氢酶(NNT)基因突变情况及其与CH的关系,为CH的诊断提供理论依据.方法 对50例来自山东地区的汉族CH患儿进行NNT基因编码区筛查.提取血液基因组DNA,PCR扩增NNT基因全部编码区后进行Sanger测序,将测序结果与NCBI中NNT基因编码区原序列(NM_012343.3)进行比对,检测这些患儿是否携带NNT基因突变并对发现的突变进行生物信息学分析.结果 2 例患儿中发现了NNT基因c.1475C＞T(p.A492V)突变,1例患儿中发现NNT基因c.2704C＞A(p.P902T)突变,Polyphen值显示前者几乎无蛋白危害性,可能不是致病突变,而后者蛋白危害性较大,应为致病突变.结论 NNT基因突变可能不是山东汉族人群CH的主要病因,仍需扩大样本量进行研究.

目的 了解贵州省人感染H7N9禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因的分子特征、溯源和疾病风险,为高致病性禽流感H7N9病毒的预防和控制提供依据.方法 采用实时PCR对5株高致病性禽流感H7N9毒株标本(1株人感染鼻咽拭子标本,4株活禽市场环境标本)进行核酸的提取、HA基因的扩增和测序,运用生物信息学软件对H7N9禽流感病毒HA基因的同源性、遗传进化、受体结合关键位点、致病相关位点和糖基化位点变异情况进行分析.结果 贵州省威宁县人感染H7N9禽流感病毒HA基因与当地活禽市场环境中H7N9禽流感病毒核苷酸和氨基酸同源性分别为99.8%和99.6%,而4株活禽市场环境中的H7N9禽流感病毒核苷酸和氨基酸同源性分别为100.0%和100.0%.与2017年广西人感染的A/Guangxi/5/2017毒株同源性最高,分别为99.7%~99.9%和99.4%~99.8%;与2016年底广东环境中分离的毒株A/Environment/Guangdong/C16283222/2016同源性为99.0%~99.2%和98.9%~99.2%,而与WHO推荐的A/Shanghai/2/2013和A/Anhui/1/2013候选疫苗株的同源性为96.8%~97.0%和95.8%~96.2%.与广西毒株A/Guangxi/5/2017遗传进化距离最近.5株毒株HA蛋白裂解位点突变为PEVPKRKRTAR↓GLF,为高致病性禽流感突变株;受体结合关键位点均发生了G186V的突变,均未发生Q226L突变,5株毒株均发生的新突变为A363S,仅感染人的毒株发生的突变是R56K和I297V;5个潜在糖基化位点中仅421NWT和493NNT发生位置后移的变异.结论 贵州省威宁县5株H7N9禽流感病毒均为高致病性禽流感突变株,候选疫苗株匹配保护效果可能已经降低,HA蛋白裂解位点、G186V和新的突变位点的变异可能增强了H7N9禽流感病毒对人体的易感性和致病性.

目的 探讨亚低温对糖尿病合并脑梗死(CI)大鼠缺血半暗带凋亡的作用及机制.方法 健康雄性SD大鼠随机分为糖尿病组(n=42)和非糖尿病组(n=14),通过高脂饲料喂食联合链脲霉素(STZ)诱导2型糖尿病.制备大鼠永久性大脑中动脉栓塞模型,造模成功2周后随机分为糖尿病CI常温组(n=14)、糖尿病CI亚低温组(n=14)、糖尿病假手术组(n=14)、非糖尿病CI常温组(n=14).建立永久性大脑中动脉栓塞CI模型后2 h开始对亚低温组进行亚低温干预6 h.于术后不同时间点进行神经行为学评估,术后3 d检测各组大鼠缺血半暗带的细胞凋亡程度以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达量.结果 ①与非糖尿病CI常温组比较,糖尿病CI常温组神经功能评分降低(P<0.05),缺血半暗带凋亡水平升高( P <0.05 ), cleaved caspase-3 和 MMP-9 蛋白表达量增加( P <0.05 ), Bcl-2 基因表达量降低(P<0.05),Bim基因表达量增加(P<0.05).②与糖尿病 CI 常温组比较,糖尿病 CI 亚低温组神经功能评分增加(P<0.05),缺血半暗带凋亡水平降低(P<0.05),cleaved caspase-3和MMP-9蛋白表达量降低( P<0.05),Bcl-2基因表达量增加(P<0.05),Bim基因表达量降低(P<0.05).结论 糖尿病加重CI大鼠的神经功能损伤,亚低温干预可以减轻糖尿病CI大鼠的神经功能损伤,减轻血脑屏障受损从而抑制缺血半暗带神经细胞凋亡可能是其保护机制.

目的 对广州禽类市场外环境H6亚型禽流感病毒进行分离和测序,分析HA基因遗传进化特点.方法 通过接种鸡胚分离H6亚型禽流感病毒,采用RT-PCR方法扩增HA基因全长序列并测序,通过DNA Star7.1和MEGA 4.0软件,分析HA基因遗传特征.结果 2016-2018年广州禽类市场外环境分离到6株H6亚型禽流感病毒,HA基因核苷酸同源性在81.0％～99.1％之间.基因序列特征分析显示,所有分离株裂解位点序列相对保守,只有1个碱性氨基酸插入,呈现低致病性禽流感病毒分子特点.受体结合位点均为226Q和228G,为禽类呼吸道上皮受体结合位点.2016年分离株发现183-NNT糖基化位点的缺失.进化分析显示,广州早期分离株属于广东常见的ST2853-1ike分支,但2018年监测发现了ST339-1ike新流行分支病毒.结论 广州地区H6亚型禽流感病毒尚为禽类低致病性病毒,本研究毒株HA基因变异较大,2018年毒株出现多遗传分支进化趋势,因此需要继续监测H6亚型禽流感病毒的流行和变异.

目的 探讨长链非编码RNA NNT-AS1(LncRNA NNT-AS1)靶向微小核糖核酸(miR)-496抑制卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制.方法 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LncRNA NNT-AS1与miR-496在卵巢癌细胞及正常卵巢上皮细胞中的表达;双荧光素酶报告基因检测LncRNA NNT-AS1与miR-496之间的相互作用.MTT实验检测抑制LncRNA NNT-AS1及miR-496过表达后卵巢癌细胞增殖能力;Transwell迁移及侵袭实验检测抑制LncRNA NNT-AS1及miR-496过表达后卵巢癌细胞迁移及侵袭能力变化情况.qRT-PCR检测LncRNA NNT-AS1与miR-496之间的调控关系.结果 与正常卵巢上皮细胞相比,LncRNA NNT-AS1在卵巢癌细胞中表达显著上调,miR-496表达水平显著下调;双荧光素酶实验证实LncRNA NNT-AS1可miR-496特异性结合并可调控miR-496表达;抑制LncRNA NNT-AS1表达与miR-496过表达后均可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭;抑制miR-496表达可逆转抑制NNT-AS1表达对卵巢癌细胞增殖、迁移侵袭的作用.结论 LncRNA NNT-AS1可通过靶向调控miR-496表达进而促进卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭.

目的 明确豆蔻属药用植物叶绿体基因组蛋白编码基因密码子使用模式及影响因素.方法 以草果Amomum tsao-ko、阳春砂Amomum villosum、白豆蔻Amomum kravanh和爪哇白豆蔻Amomum compactum叶绿体基因组50个共有蛋白编码基因为材料,利用CodonW 1.4.2软件、CUSP在线程序和Excel软件等分析基因密码子使用偏性参数和核苷酸组成.结果 4个豆蔻属物种叶绿体基因组具有相似的密码子使用模式,密码子第3位碱基GC含量为37.22％～37.31％,偏向使用NNA和NNT型密码子;4个物种的有效密码子数值(ENC)均在35以上,表明豆蔻属叶绿体基因组密码子偏性较弱.综合中性分析、有效密码子数(ENC-plot)分析、奇偶偏好性(PR2-plot)分析和对应性分析的结果显示豆蔻属叶绿体基因组密码子偏性主要受选择影响,同时突变等其它因素也对密码子的偏性产生一定的作用.在草果、阳春砂、白豆蔻和爪哇白豆蔻中分别确定了18、16、16、18个最优密码子,其中共有最优密码子13个.结论 豆蔻属植物叶绿体基因组密码子第3位碱基偏向使用A/T结尾,密码子偏性受选择影响最大,同时还受到诸如突变等其它因素的影响.