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Hedgehog信号通路在胆道闭锁肝纤维化中的表达及机制研究
编辑人员丨5天前
目的:探讨Hedgehog信号通路和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在胆道闭锁(biliary atresia, BA)肝纤维化进展中的作用,为BA肝纤维化发生机制提供实验依据。方法:选取2019年1月至2020年1月天津市儿童医院普外科12例BA患儿肝组织和4例先天性胆管扩张症(congenital biliary dilatation,CBD)患儿肝组织,通过免疫组织化学观察Hedgehog信号通路配体SHH、效应转录因子GLI2蛋白表达分布情况,并通过蛋白质印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测其蛋白及mRNA表达情况;通过免疫荧光染色观察EMT标记物神经钙粘蛋白(N-cadherin)及CK19表达分布情况。培养人肝内胆管上皮细胞,使用人重组SHH蛋白(r-SHH)和Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺(Cyclopamine)进行外源性干预后,检测Hedgehog信号通路激活水平、EMT标记物E钙黏素(E-cadherin)、N-cadherin蛋白及mRNA表达水平。结果:免疫组织化学实验结果显示,SHH表达于BA胆管上皮细胞胞质中,GLI2表达于BA胆管上皮细胞胞核中。蛋白印迹法实验结果显示,BA组SHH、GLI2蛋白相对表达量分别为2.09±0.43、1.94±0.17,CBD组SHH、GLI2蛋白相对表达量为1.00±0.05、1.00±0.37,组间比较,差异均有统计学意义( P均<0.05)。实时荧光定量聚合酶链反实验结果显示,BA组SHH、GLI2 mRNA的相对表达量分别为2.89±0.96、2.35±0.78,CBD组SHH、GLI2 mRNA的相对表达量分别为1.00±0.34、1.00±0.22,组间比较,差异均有统计学意义( P均<0.05)。免疫荧光染色结果显示,EMT标记物N-cadherin与CK19共表达于BA胆管上皮细胞。使用r-SHH处理激活Hedgehog信号通路效应转录因子GLI2后,促进了EMT(抑制了E-cadherin,增强了N-cadherin),阻断该通路后,EMT被阻断。 结论:Hedgehog信号通路在BA中高表达,是促进肝内胆管上皮细胞发生EMT的重要诱导通路,其在BA肝纤维化进程中起重要作用,为BA肝纤维化发生机制提供实验依据。
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编辑人员丨5天前
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影响脑胶质瘤预后的关键信号通路调控机制研究进展
编辑人员丨5天前
脑胶质瘤恶性程度高,复发率高,预后差,对此分析了脑胶质瘤中Hippo/YAP、PI3K/AKT/mTOR、miRNA、WNT/β-catenin、Notch、Hedgehog及TGF-β等信号通路及关键酶的作用机制,得出 YAP1抑制剂可能成为未来治疗脑胶质瘤有效的靶点,抑制PI3K/AKT/mTOR、Shh、WNT/β-catenin及HIF-1α可降低肿瘤细胞的迁移能力及耐药性,进而改善脑胶质瘤的预后。分析得出Notch1与Sox2呈正反馈调控机制,Notch4预示脑胶质瘤的恶性程度,这样不仅在临床上可针对脑胶质瘤干细胞进行治疗,也能将Notch作为判断预后的一个指标,为治疗脑胶质瘤的方向提供探索性的尝试。miRNA在诊断中具有重要意义,而在治疗脑胶质瘤中可借助纳米颗粒的运载协同替莫唑胺发挥进一步的作用。相信这些研究会让大家对脑胶质瘤有更深入的认识,以期更好的寻找新的治疗方案来逐步攻克脑胶质瘤这道难题。
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编辑人员丨5天前
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Hh信号通路相关因子Shh、Ptch1、Gli1 mRNA的表达及意义
编辑人员丨5天前
目的:探讨前列腺癌、癌旁前列腺组织以及正常前列腺增生组织中Hedgehog(Hh)信号通路相关因子Shh、Ptch1、Gli1 mRNA的表达及意义。方法:选择2017年2月至2019年2月本院收治的42例前列腺癌患者作为研究对象,设为观察组。所有患者均拟手术治疗,术中取癌组织与癌旁组织(距离病灶≥3 cm);选择同期手术治疗的39例前列腺增生患者的手术标本,设为对照组。利用免疫组化和qRT-PCR技术检测前列腺增生、前列腺癌和癌旁组织中Hh信号通路相关因子Shh、Ptch1和Gli1蛋白及mRNA的表达情况,分析比较Hh信号通路在前列腺增生、前列腺癌和癌旁组织中表达的差异及其机制。结果:观察组的癌旁组织与对照组的Shh、Ptch1和Gli1蛋白阳性率比较,差异均无统计学意义(均 P>0.05);观察组的癌组织中Shh、Ptch1和Gli1蛋白阳性率均高于对照组(均 P<0.05)。观察组的癌旁组织与对照组的Shh、Ptch1和Gli1 mRNA表达水平比较,差异均无统计学意义(均 P>0.05);观察组的癌组织中Shh、Ptch1和Gli1 mRNA表达水平均高于观察组的癌旁组织和对照组(均 P<0.05);Spearman秩相关系数结果显示,Hh信号通路中Shh、Ptch1和Gli1与术前前列腺特异抗原(PSA)均无相关性(均 P>0.05);与Gleason评分、临床分期、病理分级均呈正相关性(均 P<0.05)。 结论:Hh信号通路中Shh、Ptch1和Gli1在前列腺癌患者中呈高表达,其在前列腺癌疾病的发生发展中可能起到一定的作用。
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编辑人员丨5天前
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孕期邻苯二甲酸二丁酯暴露抑制Hedgehog信号导致后代肾脏自噬
编辑人员丨5天前
目的:观察孕期邻苯二甲酸二丁酯(DBP)暴露对后代肾脏的毒理作用,并探讨其机制。方法:将6只孕鼠在孕期14~18 d分别随机予以850 mg/(kg·d)的DBP处理3只孕鼠为染毒组,另外3只孕鼠予以等剂量的玉米油处理为对照组。在产后第1天分别随机收集各组6只子代鼠的肾脏组织,采用免疫组织化学(IHC)染色检测肾脏自噬水平,蛋白质印迹法(Western blot)及定量分析验证自噬相关基因Beclin-1在肾脏中的表达。用Western blot及实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肾脏组织中Hedgehog信号通路上的相关标志物的表达水平。在体外实验中,分别予以Hedgehog信号通路的抑制剂索尼德吉Sonidegib及激动剂重组音刺猬蛋白(SHH)处理NRK52E肾小管上皮细胞,采用Western blot分析各组的自噬水平。组间比较采用独立 t检验。 结果:IHC提示染毒组Beclin-1的表达高于对照组(2.37±0.12比1.00±0.10, t=15.190, P<0.05),蛋白印记及其定量分析显示染毒组Beclin-1蛋白表达量高于对照组(1.20±0.104比1.00±0.01, t=3.317, P<0.01)。同时,Western blot及其定量分析表明,暴露组Hedgehog信号通路标记物Gli1和Ptch1表达低于对照组(1.00±0.15比0.43±0.09, t=5.644, P<0.01;1.00±0.01比0.35±0.10, t=11.20, P<0.01)。RT-qPCR也提示暴露组Gli1和Ptch1表达低于对照组(1.00±0.18比0.51±0.10, t=4.122, P<0.01;1.00±0.10比0.62±0.08, t=5.140, P<0.01)。体外研究证实当加入Hedgehog抑制剂Sonidegib后,实验组的NRK52E细胞自噬指数(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)高于对照组(0.49±0.11比1.25±0.05, t=10.890, P<0.01),而当加入其激动剂SHH后,实验组的自噬指数低于对照组(0.49±0.11比0.36±0.09, t=11.260, P<0.01)。 结论:孕期DBP暴露通过抑制Hedgehog信号引起后代肾脏发生自噬,从而可能引起肾脏相关疾病。
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编辑人员丨5天前
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GLI3:c.2880del导致的多指(趾)家系分析
编辑人员丨5天前
目的:探讨一个多指(趾)畸形家系潜在的致病基因及机制。方法:收集多指(趾)家系5代11人的临床资料及外周血,全外显子测序,Sanger测序进行验证,确定突变位点。构建重组质粒,在293T细胞中进行外源表达,进行免疫印迹实验和免疫共沉淀实验确定突变蛋白分子量及融合抑制因子(suppressor of fused,SUFU)相互作用情况。结果:先证者及其外曾外祖母、外祖母、母亲、舅舅均存在NM_000168.6( GLI3):[c.2880del,p.(Asp962MetfsTer41)]移码突变,正常成员未见异常。其表达一个分子量约为130 kDa截短的突变体,与SUFU的相互作用显著降低,音速刺猬(sonic hedgehog signaling,SHH)信号通路激活强度受限。根据美国医学遗传学和与基因组学学会遗传变异分类标准与指南评级为致病变异。 结论:GLI3:c.2880del突变是家系中多指(趾)的致病因, GLI3基因突变谱进一步丰富。
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编辑人员丨5天前
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核转录因子Gli在恒河猴轮状病毒致胆道闭锁小鼠肝脏上皮间充质化中的调控作用
编辑人员丨5天前
目的:研究sonic hedgehog(Shh)信号通路核转录因子Gli1/Gli2在恒河猴轮状病毒(RRV)感染致胆道闭锁小鼠肝脏上皮间充质化(EMT)中的调控作用。方法:通过RRV构建胆道闭锁小鼠模型,根据RNA干扰技术对Shh信号通路关键转录因子Gli1/Gli2表达调控的不同,将实验小鼠分为正常组、模型组、Gli1过表达组、Gli1 shRNA组、Gli2过表达组、Gli2 shRNA组,应用实时荧光定量聚合酶链反应及蛋白质印迹法检测实验小鼠肝脏组织中EMT关键调控因子Snail/Slug及EMT特征性细胞因子波形蛋白(Vimentin)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA及蛋白的表达;对不同分组中的小鼠肝脏组织分别行苏木精-伊红染色和Masson染色观察记录肝纤维组织表达面积百分比。采用单因素方差分析和 LSD- t检验进行数据分析。 结果:Gli2过表达组、Gli2 shRNA组及模型组Snail、Slug、Vimentin、α-SMA、E-cadherin mRNA相对表达量分别为15.13±3.40、5.48±0.46、8.78±1.06、12.40±2.18和3.06±0.53;3.73±1.16、5.62±1.75、3.56±1.06、3.88±1.16和10.51±1.83;8.13±1.27、5.32±0.98、5.05±0.98、4.02±0.77和5.12±1.60。与模型组相比,Gli2过表达组Snail、Vimentin、α-SMA的mRNA表达明显升高,E-cadherin的mRNA表达明显降低,差异均有统计学意义( t=4.53、5.29、8.12、-2.13,均 P<0.05);与模型组相比,Gli2 shRNA组Snail、Vimentin的mRNA表达明显降低,E-cadherin的mRNA表达明显升高,差异均有统计学意义( t=-2.86、-2.12、5.62,均 P<0.05)。Gli2过表达组、Gli2 shRNA组及模型组Snail、Slug、Vimentin、α-SMA、E-cadherin蛋白灰度比值分别为2.02±0.39、0.31±0.08、0.95±0.17、1.07±0.17和0.42±0.06;0.53±0.13、0.40±0.18、0.20±0.04、0.28±0.07和1.09±0.31;0.70±0.15、0.42±0.22、0.64±0.13、0.81±0.11和0.42±0.09。与模型组相比,Gli2过表达组Snail、Vimentin、α-SMA蛋白灰度比值明显升高,差异均有统计学意义( t=12.71、4.28、3.70,均 P<0.05);与模型组相比,Gli2 shRNA组Vimentin、α-SMA表达明显降低,E-cadherin表达明显升高,差异均有统计学意义( t=-6.14、-7.57、5.96,均 P<0.05)。Gli1过表达组及Gli1 shRNA组小鼠肝脏组织未见明确EMT特征细胞因子表达变化趋势。正常组、模型组、Gli1过表达组、Gli1 shRNA组、Gli2过表达组、Gli2 shRNA组肝脏纤维组织表达面积百分比分别为(1.03±0.58)%、(33.02±11.39)%、(39.81±5.67)%、(26.06±1.29)%、(49.81±8.57)%和(17.55±0.66)%。Gli2过表达组及Gli2 shRNA组与模型组肝脏纤维组织表达面积百分比相比,差异均有统计学意义( t=3.21、-2.96,均 P<0.05);Gli1过表达组及Gli1 shRNA组与模型组肝脏纤维组织表达面积百分比相比,差异均无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:Shh信号通路在胆道闭锁小鼠肝纤维化中起重要作用,Shh信号通路关键转录因子Gli2可显著调控胆道闭锁小鼠肝脏EMT过程。
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编辑人员丨5天前
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Shh/Gli1信号通路在睡眠剥夺致幼鼠认知功能障碍中的作用
编辑人员丨5天前
目的:评价音猬因子(Shh)/胶质瘤相关癌基因同源物1(Gli1)信号通路在睡眠剥夺致幼鼠认知功能障碍中的作用。方法:SPF级健康雄性C57BL/6小鼠48只,4周龄,体重14~16 g,采用随机数字表法分为3组( n=16):对照组(C组)、睡眠剥夺组(SD组)和睡眠剥夺+Shh激动剂SAG组(SD+SAG组)。采用多平台水环境法制备小鼠睡眠剥夺模型,每天睡眠剥夺20 h,连续10 d。SD+SAG组于每次造模前5 min腹腔注射SAG 10 mg/kg,C组和SD组腹腔注射等量生理盐水。造模结束后随机取10只小鼠行新物体识别和Y迷宫实验,行为学实验结束后处死小鼠取海马,采用高尔基染色法测定海马CA1区树突棘密度,采用Western blot法检测Gli1和脑源性神经营养因子(BDNF)表达,采用RT-qPCR法检测Gli1和BDNF的mRNA表达。 结果:与C组比较,SD组新物体识别、Y迷宫偏好指数及海马CA1区树突棘密度降低,海马Gli1和BDNF及其mRNA表达下调( P<0.05);与SD组比较,SD+SAG组新物体识别、Y迷宫偏好指数及海马CA1区树突棘密度升高,海马Gli1和BDNF及其mRNA表达上调( P<0.05)。 结论:Shh/Gli1信号通路抑制,降低海马神经元突触可塑性参与了睡眠剥夺致幼鼠认知功能障碍的过程。
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编辑人员丨5天前
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核转录因子Gli在胆道闭锁肝上皮间充质转化中的调控作用
编辑人员丨5天前
目的:研究胆道闭锁肝纤维化过程中Shh信号通路核转录因子Gli1/Gli2在肝上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)中的调控作用,为阐明胆道闭锁肝纤维化的机制提供依据。方法:选择2018年1月至2018年12月经手术证实为胆道闭锁Ⅲ型患儿的肝活检组织标本10例作为胆道闭锁组,年龄在1~3月龄。以相同年龄段无肝胆系统畸形死亡新生儿尸检肝组织5例作为正常对照组。应用实时荧光定量聚合酶链(RT-qPCR)反应及蛋白质印迹法检测肝组织中Gli1/Gli2、EMT关键调控因子Snail/Slug及EMT特征性细胞因子的表达。另将2周龄BALB/c小鼠处死后分离肝内胆管上皮细胞mIBEC,按处理方式不同分为正常对照组、干扰对照组、过表达对照组、Gli1-shRNA组、Gli1过表达组、Gli2-shRNA组、Gli2过表达组。其中,正常对照组加入等体积培养基,干扰对照组加入空白慢病毒,过表达对照组加入空白腺病毒,Gli1-shRNA组应用Gli1-shRNA沉默Gli1,Gli2-shRNA组应用Gli2-shRNA沉默Gli2,Gli1过表达组应用Gli1腺病毒过表达Gli1,Gli2过表达组应用Gli2腺病毒过表达Gli2。应用RNA干扰技术研究Shh信号通路关键转录因子Gli1/Gli2表达对EMT过程的调控作用。采用单因素方差分析和LSD- t检验对数据进行统计学分析。 结果:RT-qPCR检测结果显示,胆道闭锁组患儿肝组织Gli2、Snail、Vimentin、α-SMA mRNA相对表达量分别为10.96±6.21、7.37±4.09、8.85±2.37和7.35±4.09,较对照组肝组织4.46±1.24、3.34±0.95、4.49±2.07和3.38±0.93均明显升高,组间比较,差异有统计学意义( P<0.05)。胆道闭锁组患儿肝组织E-cadherin相对表达量为3.00±1.29,较对照组4.96±1.91明显降低,组间差异亦有统计学意义( P<0.05)。应用RNA干扰技术沉默Gli2基因后,Gli2-shRNA组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中Snail、Vimentin、α-SMA mRNA相对表达量分别为2.23±0.67、3.11±1.07和2.74±0.61,较干扰对照组5.21±0.88、3.67±1.04和3.46±1.24明显降低,组间比较,差异有统计学意义( P<0.05)。Gli2-shRNA组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中E-cadherin mRNA相对表达量为9.09±1.29,较干扰对照组4.36±0.85表达明显升高,组间比较,差异有统计学意义( P<0.05)。过表达Gli2基因后,Gli2过表达组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中Snail、Vimentin、α-SMA mRNA相对表达量分别为9.89±2.06、14.51±3.63、12.41±3.00,较过表达对照组4.32±0.78、4.58±0.95、4.09±1.03明显升高,组间比较,差异有统计学意义( P<0.05)。Gli2过表达组小鼠肝内胆管上皮细胞mIBEC中E-cadherin mRNA相对表达量为2.30±0.39,较过表达对照组6.09±1.40表达降低,组间比较,差异有统计学意义( P<0.05)。沉默及过表达Gli1基因未见明确EMT特征细胞因子表达变化趋势。免疫荧光检测显示沉默Gli2基因表达后mIBEC中绿色荧光(胆管上皮细胞标记物CK19)增强,过表达Gli2基因后橙色荧光(间质细胞标记物α-SMA)增强。 结论:Shh信号通路在胆道闭锁肝纤维化中具有的重要作用,信号通路关键转录因子Gli2可显著调控肝内胆管上皮细胞EMT过程。
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编辑人员丨5天前
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神经管缺陷的病因学研究进展
编辑人员丨5天前
神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)是中枢神经系统最常见的先天性畸形,由遗传因素和环境因素共同影响。神经管闭合关键信号通路如SHH通路和PCP通路、叶酸代谢通路及肌醇代谢通路中的重要基因与NTDs的发生密切相关,其调控方式包括基因突变、基因间相互作用及表观遗传修饰等。环境因素如营养缺乏、孕期接触等也在NTDs发生过程中起着重要的作用。该文就神经管缺陷的病因学研究进展作一综述,以期为NTDs发病机制的深入研究、疾病防治提供参考。
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编辑人员丨5天前
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不同剂量氟对大鼠骨组织Ihh、Shh、Smo mRNA和蛋白表达的影响
编辑人员丨5天前
目的:探讨刺猬蛋白(Hedgehog,Hh)信号通路相关因子(Ihh、Shh、Smo)在慢性氟中毒大鼠骨组织中的表达变化及意义。方法:36只健康SD大鼠,根据体质量(100 ~ 120 g)采用随机数字表法分为3组(12只/组,雌雄各半);对照组大鼠饮用自来水(含氟量< 1 mg/L),低氟组和高氟组染氟剂量分别为5、50 mg/L。各组大鼠饲养6个月时,收集24 h尿样,取大鼠股骨干骺端,氟离子选择电极法检测尿氟、骨氟含量;HE染色,光镜观察骨组织形态学改变;酶联免疫吸附法检测血清骨碱性磷酸酶(BALP)水平;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和免疫组织化学法检测骨组织Ihh、Shh、Smo mRNA和蛋白表达水平。结果:随着染氟含量的增加,各组大鼠尿氟、骨氟含量和血清BALP水平[尿氟:(1.37 ± 0.44)、(5.96 ± 0.56)、(7.60 ± 0.61)mg/L,骨氟:(306.04 ± 12.58)、(652.91 ± 51.83)、(1 094.11 ± 126.34)mg/kg,血清BALP:(27.78 ± 4.09)、(46.59 ± 5.75)、(57.45 ± 3.99)U/L]逐渐增加( P均< 0.05)。光镜下染氟组大鼠股骨干骺端呈骨质硬化表现。高氟组大鼠Ihh、Shh、Smo mRNA表达水平(1.39 ± 0.36、0.56 ± 0.23、0.40 ± 0.15)高于对照组和低氟组(0.73 ± 0.19、0.92 ± 0.34,0.19 ± 0.04、0.36 ± 0.16,0.14 ± 0.04、0.24 ± 0.13, P均< 0.05),低氟组Shh mRNA表达水平高于对照组( P < 0.05)。高氟组大鼠Ihh、Smo蛋白表达水平(138.89 ± 3.72、149.29 ± 7.63)高于对照组和低氟组(127.39 ± 2.69、134.81 ± 3.53,129.64 ± 12.62、139.07 ± 9.30),且低氟组高于对照组( P均< 0.05);高氟组大鼠Shh蛋白表达水平(141.26 ± 7.49)高于对照组(130.96 ± 11.10, P < 0.05)。 结论:Hh信号通路相关因子在氟中毒大鼠骨组织中出现表达改变,氟可能通过诱导Hh信号活化来影响骨形成。
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编辑人员丨5天前
