目的:研究槲皮素体外抗呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的作用，为新型抗呼吸道合胞病毒中药开发提供基础研究数据。方法:根据细胞毒性实验确定槲皮素的最大工作浓度，采用病毒滴度TCID 50检测法、细胞毒性检测法、Western blot和实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测槲皮素体外对RSV的增殖、蛋白表达和基因转录抑制效果。采用RNA干扰敲低HSP70表达水平，检测病毒的生长曲线。 结果:槲皮素对Vero细胞的毒性呈现明显的梯度依赖效应，最大无毒浓度为25 μM，且12 μM的槲皮素浓度下，细胞上清中病毒滴度抑制率达60%；同时Western blot结果显示槲皮素处理的细胞中病毒F蛋白受到显著抑制；qPCR对细胞中RSV G蛋白的转录本的检测结果表明槲皮素使病毒G蛋白的转录效率下降了85%以上。敲低HSP70的表达水平后，病毒的滴度下降了两个数量级。结论:槲皮素体外对RSV-A有较好的抗病毒作用，且可能是通过抑制其特异性底物HSP70实现的。

目的:探索单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)复发模型的建立及鉴定方法。方法:选取12只BALB/c健康小鼠，采用随机数字表法按照紫外灯照射时间不同分为紫外灯照射3 min组、2 min45 s组和2 min30 s组，每组4只，观察角膜损伤情况以确定最适紫外灯照射参数。另取72只BALB/c健康小鼠，采用随机数字表法将其分为空白对照组、模型组和复发组，每组24只。所有小鼠均用手术刀片在右眼角膜划开#字，空白对照组滴入5 μl生理盐水，模型组和复发组均滴入Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)悬液，感染后不予腹腔内注射HSV-1异种血清抗体。初次感染病毒后5周，对复发组采取紫外灯照射法诱导小鼠模型眼疾病复发；评价眼表病变症状评分和角膜擦拭液相对应的非洲绿猴肾(Vero)细胞培养后细胞的形态学改变。结果:照射时长2 min45 s为紫外灯照射最适条件。模型组和复发组小鼠在初次感染后1周内出现HSK表现，1周后症状逐渐消失。诱导复发前裂隙灯显微镜检查模型组和复发组小鼠HSK均未自发性复发，经紫外灯照射后复发组小鼠1周内复发，出现HSK表现。诱导复发后1 d，空白对照组、模型组和复发组眼表病变症状评分分别为0.333±0.471、1.500±0.764和2.667±0.943；3 d时分别为0.000±0.000、0.833±0.373和5.167±2.267；7 d时分别为0.167±0.373、1.000±0.577和3.000±1.155；诱导复发后3 d，复发组眼表病变症状评分均高于空白对照组和模型组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。Vero细胞培养小鼠角膜擦拭液后发生漂浮、聚拢等形态学改变(CPE病变)，复发组小鼠角膜擦拭液细胞培养CPE病变阳性率为71%(17/24)，明显高于模型组的8%(2/24)，差异有统计学意义( P<0.01)。综合2个指标计算建模复发成功率可达71%。 结论:紫外灯照射可成功诱导未注射中和血清抗体的HSK小鼠复发。

目的:分析白细胞介素-36(IL-36)家族成员在糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)外周血中的水平，探讨重组人IL-36α对DKD患者单核细胞功能的调控作用。方法:连续入组2型糖尿病患者41例、DKD患者36例、对照者20名，分离血浆和外周血单个核细胞，酶联免疫吸附法检测血浆IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36受体拮抗剂(IL-36Ra)水平，分选单核细胞，实时定量PCR检测单核细胞中IL-36受体亚基mRNA表达。使用重组IL-36α刺激单核细胞，检测培养上清中毒性分子和细胞因子水平，流式细胞术检测程序性死亡受体-1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)表达。单核细胞与Vero细胞共培养，评估单核细胞的杀伤功能。结果:2型糖尿病组和DKD组血浆IL-36α、IL-36β水平显著高于对照组，DKD组血浆IL-36α水平亦高于2型糖尿病组( P<0.05)。IL-36γ和IL-36Ra水平在3组之间差异无统计学意义( P>0.05)。单核细胞中IL-36受体亚基mRNA表达在3组之间差异无统计学意义( P>0.05)。DKD组肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平高于对照组和2型糖尿病组( P<0.05)，PD-1和CTLA-4水平低于对照组和2型糖尿病组( P<0.05)。DKD组单核细胞诱导Vero细胞死亡的比例显著高于对照组和2型糖尿病组( P<0.05)。重组人IL-36α刺激后，DKD患者单核细胞分泌颗粒酶B和TNF-α水平显著升高( P<0.05)，单核细胞诱导Vero细胞死亡的比例显著升高( P＝0.024)。 结论:DKD组单核细胞分泌颗粒酶B和IL-36α水平升高诱导单核细胞功能增强。

目的:探讨肠道分节丝状菌（SFB）定植与轮状病毒感染风险的关系及SFB抵御轮状病毒感染的可能机制。方法:病例对照研究。选择在浙江大学医学院附属儿童医院门诊因腹泻经粪便检测轮状病毒阳性的0~5岁患儿50例为研究对象，即轮状病毒性肠炎组，并以非胃肠道疾病、非感染性疾病的外科疾病患儿55例为对照组，年龄、性别组成与轮状病毒性肠炎组相匹配。提取粪便菌群的DNA，通过实时荧光定量PCR分析测定SFB，将轮状病毒性肠炎组及对照组患儿分别按照年龄和性别分组，分析SFB的阳性率在不同组间的差异，并进一步比较分析这两组患儿在≤2岁组及>2~5岁年龄组SFB阳性率的差异。通过p3340蛋白与轮状病毒进行中和试验，确定Vero细胞轮状病毒感染率与p3340浓度之间的关系。组间比较采用 χ2检验或Fisher确切概率法。 结果:轮状病毒性肠炎组患儿50例，年龄（1.7±0.9）岁，对照组患儿55例，年龄（1.8±1.1）岁。轮状病毒性肠炎组患儿SFB 的阳性率在各个年龄中呈递减分布，其中≤1岁组最高，为10/14，>1~2岁组为67%（14/21），>2~5岁组为9/15，差异无统计学意义（ P=0.867）；对照组患儿≤1岁组SFB阳性率为12/15，>1~2岁组为95%（19/20），>2~5岁组为50%（10/20），差异有统计学意义（ P=0.004）。轮状病毒性肠炎组患儿男童SFB阳性率为74%（20/27），女童为56%（13/23），差异无统计学意义（ χ2=1.71， P=0.192）；对照组患儿男童SFB阳性率为79%（22/28），女童为70%（19/27），差异无统计学意义（ χ2=0.49， P=0.485）。轮状病毒性肠炎组SFB阳性率66%（33/50），对照组为75%（41/55），差异无统计学意义（ χ2=0.56， P=0.454）。在≤2岁患儿中，轮状病毒性肠炎组SFB阳性率69%（24/35），对照组为89%（31/35），差异有统计学意义（ χ2=4.16， P=0.041）；在>2~5岁患儿中，轮状病毒性肠炎组SFB阳性率为9/15，对照组为50%（10/20），差异无统计学意义（ P=0.734）。经Pearson相关性分析，随着SFB阳性率的增加，轮状病毒的感染率呈下降趋势（ r=-0.87， P<0.001）。随着p3340特异蛋白浓度的增加，适合培养轮状病毒的Vero细胞荧光素酶的发光强度呈下降趋势（ F=4.17， P=0.001）。 结论:2岁以内婴幼儿肠道SFB定植与降低轮状病毒感染风险相关；克隆特定SFB功能蛋白p3340可以中和轮状病毒感染Vero细胞，且这种针对轮状病毒感染的机制可能不同于常见的抗病毒机制。

目的:对艰难拟梭菌630（Cd630）菌株和致病决定区基因座（PaLoc）敲除突变株（ΔPaLoc）进行转录组测序和分析，获得Cd630野生型菌株和ΔPaLoc基因的差异性表达谱，并测定野生型Cd630菌株和ΔPaLoc突变株的细胞毒力，为构建艰难拟梭菌全菌减毒疫苗奠定基础。方法:对Cd630菌株和ΔPaLoc敲除突变株进行转录组测序，接着对差异表达基因进行筛选，随后对差异基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。最后在非洲绿猴肾细胞（Vero）和人克隆结肠腺癌细胞株（Caco-2）中进行Cd630野生型菌株和ΔPaLoc敲除突变菌株的细胞毒性验证实验。结果:转录组数据表明ΔPaLoc突变株毒素基因 tcdA、 tcdB未转录。 CD630_36010、 CD630_020910、 CD630_02080和 cel等基因分别上调17.92、11.40、8.93和7.55倍；编码高丝氨酸脱氢酶的 hom2基因、孢子形成蛋白基因 CD630_15810、锌结合脱氢酶基因 CD630_23230、1-磷酸半乳糖醇 5-脱氢酶基因 CD630_23240分别下调为野生型的0.06、0.075、0.133和0.183倍。GO和KEGG富集分析结果表明，ΔPaLoc突变株差异转录基因主要富集于密度感应系统、ABC运输系统、双组分系统、磷酸转移酶（PTS）系统、糖代谢通路以及万古霉素耐药相关的通路等。细胞毒力实验结果表明野生型Cd630菌株对Vero细胞和Caco-2细胞具有毒力，ΔPaLoc突变株丧失对Vero细胞和Caco-2细胞的毒力。 结论:通过对Cd630和ΔPaLoc突变株进行转录测序，表明毒素基因未转录，其他差异性基因可为进一步研究ΔPaLoc突变株生理生化特征提供指引。细胞毒力实验表明，ΔPaLoc突变株丧失了对Vero细胞和Caco-2细胞的毒力，ΔPaLoc突变株为艰难拟梭菌全菌减毒疫苗的构建奠定了基础。

目的 研究迷迭香酸(RosA)体外抗水痘-带状疱疹病毒(VZV)的作用及其机制.方法 采用不同浓度的RosA(400、200、100、50μmol/L)处理VZV感染的Vero细胞,采用细胞病变效应(CPE)法和MTT法评价RosA体外抗VZV的作用以及对细胞的毒性,采用RT-qPCR法检测RosA对VZV ORF36 mRNA表达的影响.结果 当RosA浓度为100、200、400μmol/L时,RosA对VZV的抑制率分别为55.88％、78.99％和98.19％,其抑制效果与RosA浓度呈正比.当RosA浓度为400μmol/L时,RosA对VZV的灭活率为85.44％,灭活作用的EC50为185.95μmol/L,RosA的CC50为2362.10μmol/L,EC50为63.02μmol/L,SI为37.48.当RosA浓度为100、200、400μmol/L时,VZV ORF36 mRNA的表达量分别下调了48.2％、85.9％、97.2％.结论 RosA在体外具有抗VZV的作用,其抗病毒作用与RosA抑制VZV ORF36的转录有关.

目的 探讨脊髓灰质炎疫苗猴体神经毒力试验毒力返强对神经免疫反应的影响及病理机制.方法 Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)的原液(≥7000 lgCCID50/L)以及10-1稀释各型脊髓灰质炎疫苗采用脑内法进行神经毒力试验,观察脊髓灰质炎的病理变化,并利用免疫组织化学法检测脊髓灰质炎病毒受体CD155以及CD4+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞和CD68+小胶质细胞的分布.结果 发生脊髓灰质炎的猴体出现脊髓炎症细胞浸润,少量神经元变性,脊髓神经元变性坏死、卫星现象、噬神经细胞现象、血管周围炎症细胞袖套状浸润和胶质细胞增生;主要为CD4+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞和CD68+小胶质细胞大量浸润在血管袖套和增生的胶质结节中;在发生和未发生脊髓灰质炎的猴体中,CD155分布未见明显差别,均表达在神经元和胶质细胞,而血管内皮细胞未见表达.结论 脊髓灰质炎疫苗毒力返强导致典型病毒性脑脊髓炎.

目的 探究3-(4-氯苯基)-1,4-二苯基-1,4,5,7-四氢-6H-吡唑并[3,4-b]吡啶-6-酮(以下简称为J1)体外抑制新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的作用及潜在作用机制.方法 采用MTT法评价化合物J1 对Vero-E6、ACE2/293T和HRT18 细胞的毒性.利用感染性SARS-CoV-2 和人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)检测化合物J1 的抗冠状病毒活性.采用SARS-CoV-2 假病毒体外细胞感染模型和时间点加药实验检测J1 抑制SARS-CoV-2 病毒感染靶细胞的作用阶段.通过S蛋白介导的细胞融合抑制实验检测J1 是否通过阻止病毒膜融合而抑制SARS-CoV-2 的进入.采用SPR实验和分子对接技术阐明 J1 与 SARS-CoV-2 S 蛋白的作用.结果 J1 对 Vero-E6、ACE2/293T 和HRT18 细胞的毒性较小,半数细胞毒性浓度 CC50 均大于 100 μmol·L-1.J1 能显著抑制 SARS-CoV-2 原始株和 Delta 变异株的活性,半数有效浓度 EC50 分别为 6.07 μmol·L-1 和2.21 μmol·L-1.此外,J1 可抑制HCoV-OC43 病毒的感染,显著减少NP蛋白和mRNA的表达.分子对接结果显示,J1 通过氢键作用和疏水作用力与SARS-CoV-2 S蛋白活性位点稳定结合.机制研究结果表明,J1 可抑制SARS-CoV-2 病毒进入靶细胞,半数抑制浓度IC50 为 1.57 μmol·L-1.J1 浓度依赖性抑制SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞膜融合,SPR实验证实J1 与S蛋白具有较强结合能力.结论 吡唑并吡啶酮类衍生物J1 通过靶向S蛋白抑制SARS-CoV-2 进入靶细胞.

目的 通过9型腺相关病毒(adeno-associated virus 9,AAV9)系统表达发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)Gn蛋白,并评价其免疫原性.方法 将SFTSV Gn基因重组至病毒载体pAAV-CMV-FH,将构建的重组质粒转染HEK293T细胞,获得重组病毒AAV9-Gn;免疫荧光和Western blot法鉴定Gn蛋白的表达情况.将18只雌性BALB/c小鼠随机分为Mock组(无血清DMEM)、AAV9-GFP组(1 × 1011 vg)和AAV9-Gn组(1×1011 vg),各组均经小鼠右后肢肌内注射,100μL/只.连续21 d监测各组小鼠体质量、饮食、行为及精神状态,并计算体质量变化率;于免疫后2、4、8、16周,采用荧光灶减少中和试验(fluorescent reduction neu-tralization test,FRNT)检测各组小鼠血清中SFTSV中和抗体水平,ELISA法检测AAV9-Gn组小鼠血清中特异性IgG 1和IgG2a抗体水平.结果 与特异性抗体孵育显色后,转染AAV9-Gn的Vero细胞于荧光显微镜下可见特异性绿色荧光,且可与小鼠抗SFTSV Gn单克隆抗体发生特异性结合,并于相对分子质量约61 000处可见特异性结合条带.3组小鼠体质量均呈增长趋势,组间差异无统计学意义(F=0.158～2.621,P＞0.05),且饮食、行为及精神状态均表现正常.免疫后2、4、8和16周,AAV9-Gn组小鼠血清中的SFTSV中和抗体效价均明显高于Mock组和AAV9-GFP组(H=13.332～14.538,P均＜0.001),且效价峰值出现在第8周;不同时间点小鼠血清中特异性IgGl抗体水平均明显高于IgG2a(F=4.373～12.975,P均＜0.05).结论 通过AAV9表达系统可正确表达SFTSV Gn蛋白,且对小鼠毒性较低,并具有良好的免疫原性,有望作为SFTSV疫苗的候选成分.

1 案例1.1 简要案情男童,10 岁.某年 4 月 10 日被宠物狗误伤,暴露等级为Ⅱ级,11 日接种人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的第1、2 针剂.当日患儿出现精神不振、无力、嗜睡、厌食等症状;12 日,恢复正常.18 日接种第3针,当日再次出现上述类似症状,并伴有胸闷、呕吐等表现.19日23时后,嗜睡情况愈加严重,"120"急救人员赶到时确认患儿已死亡.