目的:探讨长链非编码RNA DNA损伤诱导的非编码RNA(LncRNA NORAD)通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移、侵袭和凋亡的机制.方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测人颅内动脉瘤组织和正常组织中LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1表达.体外分离培养人VSMC,随机分为 对照组、LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics 组、共转染(LncRNA NORAD siRNA+miR-513b-5p inhibitor)组、共转染阴性对照(LncRNA NORAD siRNA阴性对照+miR-513b-5p inhibitor阴性对照)组,分组转染后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表达;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和免疫荧光染色检测各组细胞增殖情况;采用Hoechst 33342染色和免疫荧光染色检测各组细胞凋亡情况;采用细胞划痕实验和Transwell实验检测各组细胞迁移、侵袭情况;采用免疫印记实验检测各组细胞上皮间充质转化(EMT)标志蛋白神经钙黏素(N-cadherin)、E-钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达;采用双荧光素酶报告实验分析VSMC中LncRNA NORAD对miR-513b-5p、miR-513b-5p对GREM1的靶向调控.结果:与正常组织比较,颅内动脉瘤组织LncRNA NORAD、GREM1 mRNA表达明显升高(尸＜0.05),miR-513b-5p表达明显降低(P＜0.05).与对照组比较,LncRNA NORAD siRNA 组、miR-513b-5p mimics 组细胞 GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67 阳性率、迁移率、侵袭数及 N-cadherin、Vimentin 蛋白表达降低(P＜0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达升高(P＜0.05);共转染阴性对照组各指标差异无统计学意义(P＞0.05).与LncRNA NORAD siRNA组比较,共转染组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高(P＜0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达降低(P＜0.05).结论:敲低LncRNA NORAD可通过上调miR-513b-5p表达而降低GREM1表达,从而抑制VSMC增殖与侵袭迁移,并促使其凋亡.

目的:探讨紫云英苷上调miRNA-513（miR-513）对前列腺癌细胞株C4-2B细胞增殖能力及细胞周期的影响。方法:选取前列腺癌细胞株C4-2B，采用125 μg/L紫云英苷作用48 h者为紫云英苷组，未处理者为对照组。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测两组C4-2B细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期。采用miRNAMap预测软件预测miR-513的靶基因为叉头框蛋白R2（FOXR2），并采用双荧光素酶报告基因实验进行验证。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测两组细胞miR-513和FOXR2 mRNA的相对表达水平，蛋白质印迹法检测两组细胞中FOXR2、细胞周期蛋白依赖性激酶7（CDK7）、β-actin和细胞周期蛋白H（cyclin H）的表达。结果:与对照组比较，培养第2、3、4、5天紫云英苷组C4-2B细胞增殖活力均降低（均 P<0.05）。对照组和紫云英苷组S期细胞比例分别为（48.1±3.2）%和（36.0±2.1）%，紫云英苷组S期细胞比例降低（ t=3.12， P=0.021）；G 2期细胞比例分别为（24.9±3.3）%和（11.8±2.4）%，紫云英苷组G 2期细胞比例降低（ t=3.18， P=0.019）。对照组和紫云英苷组C4-2B细胞中miR-513的相对表达水平分别为1.01±0.22和6.55±0.61，紫云英苷组C4-2B细胞中miR-513的相对表达水平升高（ t=7.70， P<0.01）。双荧光素酶报告基因实验验证FOXR2为miR-513的靶基因。对照组和紫云英苷组C4-2B细胞中FOXR2 mRNA相对表达水平分别为1.04±0.14和0.19±0.06，差异有统计学意义（ t=5.53， P=0.002），提示紫云英苷促进miR-513表达后，FOXR2 mRNA表达降低。紫云英苷组C4-2B细胞FOXR2、CDK7和cyclin H蛋白相对表达水平较对照组均降低。 结论:紫云英苷可能通过上调miR-513的表达，抑制前列腺癌C4-2B细胞增殖，诱导细胞周期停滞。

目的:分析微小RNA-23a（miR-23a）与磷酸酶及张力蛋白同源物基因（PTEN）调控轴在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）LS513细胞中的表达情况，并探讨二者对CRC发生发展的影响。方法:将LS513细胞分为空白对照组（NG组，细胞不做特殊处理）、阴性对照组（NC组，加入5 μl Lipofectamine3000和50 pmol/μl NC）、抑制miR-23a表达组（miR-23a-inhibitor组，转染miR-23a-inhibitor序列）。采用实时荧光定量PCR法检测LS513细胞miR-23a、PTEN mRNA水平；MTT法检测LS513细胞增殖能力；Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力；蛋白质印迹法检测增殖、迁移侵袭及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路相关蛋白水平变化。结果:与NG组、NC组比较，miR-23a-inhibitor组LS513细胞中miR-23a水平显著降低（ P<0.05），PTEN mRNA及蛋白表达水平均显著升高（ P<0.05）。MTT法检测结果显示与NG组、NC组比较，miR-23a-inhibitor组增殖抑制率显著升高[（16.62±3.21）% vs（16.65±3.26）% vs（47.55±13.61）%]（ P<0.05），PCNA蛋白表达显著降低（ P<0.05）。与NG组、NC组比较，miR-23a-inhibitor组LS513细胞迁移数[（287.25±58.32）vs（285.37±58.43）vs（136.87±36.53）]、侵袭数[（242.53±50.95）vs（239.87±50.62）vs（103.77±30.06）均显著减少（ P<0.05），且MMP-9、E-cadlerin蛋白表达显著降低（ P<0.05）。与NG组、NC组比较，miR-23a-inhibitor组LS513细胞中p-PI3K/PI3K、p-ATK/ATK蛋白表达量显著降低（ P<0.05）。 结论:抑制miR-23a表达可能上调PTEN基因表达抑制PI3K/Akt通路活化，进而抑制LS513细胞增殖、迁移及侵袭。

目的 探讨舌鳞癌细胞线粒体微小RNA(mitochondrial microRNAs,mitomiRs)的表达,筛选出与化疗耐药相关的mitomiRs.方法 提取舌鳞癌细胞系CAL-27及其顺铂耐药细胞株CAL-27-re的线粒体、细胞质、总细胞RNA,采用高通量miRNA芯片筛选出耐药和亲本细胞中差异表达的mitomiRs,应用qRT-PCR验证在CAL-27和CAL-27-re中表达上调的mitomiRs,并在化疗耐药及敏感的舌鳞癌患者样本中验证表达上调的mit-omiRs.结果 芯片结果显示,在CAL-27和CAL-27-re的线粒体、细胞质和总细胞RNA共6个组分中共检测到263个miRNA,其中共有57个mitomiRs和134个细胞质微小RNA(cytoplasmic microRNAs,cytomiRs);与总miR-NA相比,CAL-27-re细胞中有35个mitomiRs表达上调,CAL-27细胞中有31个mitomiRs表达上调(≥1.5倍).进一步比较分析亲本和耐药细胞中差异表达的mitomiRs,在CAL-27-re细胞中有miR-2392、miR-4462、miR-1290、miR-4449、miR-1268a、miR-1246、miR-371a-5p、miR-3934-5p、miR-4271、miR-513p、miR-664b-3p共11个mi-tomiRs表达上调;而5个表达下调的mitomiRs则分别是miR-188-5p、miR-1973、miR-3653、miR-4499、miR-5787;其他41个mitomiRs在两种细胞株中的表达水平几乎相同.qRT-PCR与miRNAs芯片结果相符合,并且在CAL-27和CAL-27-re中得到验证的11个表达上调的mitomiRs中,有miR-1268a、miR-2392、miR-4462、miR-1290、miR-4449共5个mitomiRs在化疗耐药舌鳞癌临床样本中也同样表达上调.结论 顺铂化疗耐药和敏感的舌鳞癌细胞中存在差异表达的mitomiRs,特异高表达的mitomiRs:miR-1268a、miR-2392、miR-4462、miR-1290、miR-4449可能在舌鳞癌化疗耐药中具有重要作用.

目的 探讨胶质母细胞瘤(GM)病人外周血中miRNA的表达情况及其与肿瘤分级和预后之间的相关性.方法 应用实时荧光定量PCR法检测40例GM病人(GM组)和40例健康人(对照组)外周血中miR-106b-5p、miR-196b-5p、miR-483-5p、miR-513a1-5p、miR-574-3p及miR-197-5p的表达水平,分析其表达与GM病理分级和预后的相关性.结果 GM组病人外周血中miR-106b-5p、miR-196b-5p、miR-483-5p和miR-574-3p的表达明显高于对照组,差异具有统计学意义(t=4.626～7.013,P<0.01);两组miR-513a1-5p及miR-197-5p的表达差异无统计学意义(P>0.05).外周血中miR-106b-5p和miR-574-3p的表达与GM病理分级及预后均有显著相关性(U=314.047、313.500,χ2=8.205、9.114,P<0.01).结论 外周血中miR-106b-5p和miR-574-3p的表达或许可以作为GM病人肿瘤分级及预后的诊断标志物.

目的 研究microRNA (miR)-513b-5p对晶状体稳定性调节蛋白αB-crystallin的调节关系,及miR-513b-5p对晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)氧化应激和凋亡调节的下游机制.方法 实时定量PCR(RT-qPCR)和Western blot法分别检测白内障患者和健康志愿者晶状体组织中miR-513b-5p及αB-crystallin的水平.miR-513b-5p拟似物mimic单独转染LEC细胞SRA01/04,或抑制剂和H2O2共处理SRA01/04;另外,mimic与αB-crystallin过表达质粒cDNA3.1-αB-crystallin(c-CRYAB)联合转染SRA01/04,试剂盒检测的细胞凋亡率,RT-qPCR法和Western blot法分别检测miR-513b-5p 的水平及αB-crystallin、活性氧(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)的表达变化,生物信息学分析和荧光素酶报告基因实验研究miR-513b-5p和αB-crystallin的靶向关系.结果 白内障患者晶状体组织中miR-513b-5p的水平显著上调(P＜0.05)和αB-crystallin的表达水平下调(P＜0.05);过表达miR-513b-5p促进SRA01/04凋亡和活性氧ROS分子水平,下调抗氧化分子SOD;抑制miR-513b-5p降低H2O2所诱导的活性氧ROS(P＜0.05);αB-crystallin的表达被miR-513b-5p过表达显著性下调(P＜0.05),miR-513b-5p过表达对细胞凋亡和ROS与SOD水平的调控作用被αB-crystallin过表达显著削弱(P＜0.05).结论 miR-513b-5p通过对αB-crystallin蛋白的负调节从而促进LEC的氧化应激和凋亡.

目的 胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,多个基因和miRNA参与了胃癌的发生、发展和转移.本研究选取胃癌相关的mRNA和miRNA表达数据,利用生物信息学方法构建胃癌相关的mRNA-miRNA融合网络并识别胃癌相关的关键基因.方法 从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中选取胃癌相关的mRNA(GSE54129)和miRNA(GSE23739)表达数据,利用GEO2R筛选出差异表达mRNA和miRNA,利用STRING数据库和DAVID软件进行网络构建和功能富集分析,应用Cytoscape软件进行网络拓扑结构分析,应用TFcheckpoint数据库识别网络中的转录因子,应用Kaplan-Meier ploter进行生存分析.结果 共计识别出704个差异表达的mRNA和38个差异表达的miRNA.构建的mRNA和miRNA融合网络包含了71个基因、15个miRNA和145条边.这些基因主要富集到RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、细胞黏附、细胞外空间(基质和胞外囊泡)和肝素结合等(经Benjamini校正后均P＜0.05).通过网络拓扑学结构分析识别出了14个胃癌相关的关键节点,其中包含CTNNB1、IGF1、THBS1、PTGS2、ACTA2、CT-GF和APOE7个基因,hsa-miR-375、hsa-miR-107、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-513a-5p和hsa-miR-146b-5p 5个miRNA,SOX2和GATA6 2个转录调控因子.针对以上7个基因和2个转录调控因子的生存分析证实这些节点均与胃癌患者的生存曲线有关联,均P＜0.05.结论 胃癌的发生与发展受到涉及多个基因、miRNA和其他转录因子的生物分子网络调控,其关键节点对胃癌预后的预测有重要临床意义.

目的 观察结肠癌(CC)组织、细胞中微小RNA-513b-5p(miR-513b-5p)的表达变化,以及miR-513b-5p对CC细胞增殖和迁移的影响,并探讨相关机制.方法 采用qRT-PCR法检测CC组织、癌旁组织和CC细胞株(HCT116、RKO、SW480、LoVo、SW620)、人结肠成纤维细胞(CCD-112CoN)中的miR-513b-5p.将HCT116细胞分为miR-con组(转染miR-con)、miR-513b-5p抑制剂组(转染miR-513b-5p inhibitors);采用CCK-8试剂盒和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力.通过生物信息预测miR-513b-5p在信号传导及转录激活因子3(STAT3)上的结合位点;分别将野生型STAT3(STAT3-WT)质粒、突变型STAT3(STAT3-MUT)质粒和miR-513b-5p mimic、miR-con转染HCT116细胞;用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,采用Western blotting法检测STAT3蛋白.取部分HCT116细胞,分为miR-con组(转染miR-con)、miR-513b-5p模拟物组(转染miR-513b-5p mimics)、STAT3过表达组(共转染STAT3过表达质粒和miR-513b-5p mimics);采用CCK-8法和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力.结果 CC组织和细胞中miR-513b-5p表达分别低于正常组织和CCD-112CoN细胞(P均<0.01).miR-513b-5p抑制剂组细胞增殖活力和迁移数量均高于miR-con组(P均<0.05).StarBase在线分析数据库显示,STAT3与miR-513b-5p存在结合位点;miR-513b-5p mimics可抑制STAT3-WT组荧光素酶活性(P<0.05),而对STAT3-MUT组荧光素酶活性无显著影响;miR-513b-5p mimics组STAT3蛋白相对表达量低于miR-con组、miR-513b-5p inhibitors组STAT3蛋白相对表达量高于miR-con组(P均<0.01).miR-513b-5p模拟物组细胞增殖活力和迁移数量均低于miR-con组,STAT3过表达组细胞增殖活力和迁移数量均高于miR-513b-5p模拟物组(P均<0.01).结论 miR-513b-5p在CC组织和细胞中低表达,下调miR-513b-5p可促进细胞增殖和迁移;miR-513b-5p通过靶向STAT3起到抑制CC细胞增殖和迁移的作用.

目的 应用生物信息学方法分析miRNAs在慢性乙型肝炎(CHB)肝组织中的表达变化及生物学功能.方法 在GEO数据库中获取GSE110217芯片数据,使用R语言筛选差异表达的miRNAs;使用miRDB、miRTarBase、Tar-getScan数据库预测其靶基因,进一步采用DAVID软件对目的 基因进行生物学功能(GO)分析,利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对基因进行生物通路富集分析,筛选靶基因所涉及的有意义的生物学功能和通路靶基因;采用String和Cytoscape软件进行靶基因蛋白相互作用(PPI)网络分析,筛选关键靶基因;使用Transmir数据库在线预测和富集分析,筛选miRNAs的转录因子;以富集在乙型肝炎(hsa05161)通路上的靶基因为基础,构建转录因子-miRNAs-靶基因调控关系网络.结果 在CHB肝组织中共筛出33个差异性表达的miRNAs,其中10个上调、23个下调.这些miRNAs的靶基因主要参与转录调控、细胞分裂、凋亡过程负调控及细胞黏附等生物过程,涉及通路主要有乙型肝炎通路及PI3K/AKT、FoxO、Hippo信号通路等.经PPI网络分析筛选出16个核心靶基因,其中PRKCA、SMAD4、YWHAB、NRAS、MAPK8富集在乙型肝炎通路中.转录因子-miRNAs-靶基因调控关系网络显示,共有21个靶基因涉及乙型肝炎通路,涉及的miRNAs分别为hsa-miR-218、-363、-30b、-513a-5p、-3652、-1、-214?、-145、-542-3p、-502-3p,这10个miRNAs的富集转录因子共25个.结论 在CHB患者肝组织中存在差异性表达的miRNAs,与乙型肝炎通路相关的hsa-miR-218等10个miRNAs可能在CHB的发生发展中发挥重要作用.

目的 探究组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase-1,HDAC1)调节垂体瘤中细胞凋亡的作用机制.方法 人垂体瘤细胞系RC 4B/C分为4组,即control组、mimic组、mimic+ HDAC1组和HDAC1组.所有细胞按照分组分别通过质粒转染技术上调miR-513c 5p或/和HDAC1的水平;对照组转染等量的NC质粒.通过Starbase预测和双荧光酶素报告验证HDAC1受到miR-513c 5p的靶向调节.检测和比较各组的细胞的细胞生长和调往率,并比较各组细胞miR-513c-Sp、HDAC1和PI3K/AKT通路的水平.结果 与对照组比较,mimic组的细胞活力降低(P＜0.05).HDAC1组的细胞活力高于对照组(P＜0.05),并且mimic+ HDAC1组的细胞活力高于mimic组(P＜0.05).mimic组的细胞凋亡率高于对照组(P＜0.05).HDAC1组的细胞凋亡率低于对照组(P＜0.05),并且mimic+ HDAC1组的细胞凋亡率低于mimic组(P＜0.05).Mimic组的HDAC1的mR-NA和蛋白水平低于对照组(P＜0.05),并且Mimic+ HDAC1组的HDAC1的mRNA和蛋白水平显著高于Mimic组(P＜0.05).MiR 513c-5p直接靶向HDAC1.Mimic组的PI3K、AKT1蛋白表达水平下调(P＜0.05),HDAC1组的PI3K、AKT1蛋白蛋白表达水平高于对照组(P＜0.05),并且mimic+ HDAC1组的PI3K、AKT1蛋白表达水平高于mimic组(P＜0.05).结论 HDAC1具有通过调节PI3K/AKT通路促进垂体瘤细胞在增殖和促进凋亡的作用,并且HDAC1对垂体瘤细胞的促癌作用受到miR-513c-5p的靶向调控.