目的:对自制冷冻片微型载体（Strawtop）法与麦管法冷冻保存人微量精液的冻存效果进行系统评价。方法:采用前瞻性研究分析2018年5月1日至2018年6月30日期间于同济大学附属东方医院生殖医学中心行卵胞质内单精子显微注射（ICSI）助孕治疗的患者捐献的部分精液样本，比较自制Strawtop法与麦管法冷冻人精子复苏后的冷冻复苏率、DNA碎片指数（DNA fragmentation index，DFI）、超显微结构和受精能力与胚胎发育情况。结果:Strawtop法冻存人精子的冷冻复苏率（46.8%±17.1%）显著高于麦管法（23.1%±13.7%， P=0.001）；与冷冻前（18.9%±11.6%）相比，麦管法（33.5%±15.0%）冷冻精子复苏后的DFI显著增加（ P=0.019），而Strawtop法冻融人精子的DFI（23.4%±11.7%）与冷冻前相比差异无统计学意义（ P=0.375）；Strawtop法对冷冻精子超显微结构的损伤低于麦管法；Strawtop法冻融精子、麦管法冻融精子和新鲜精子的正常受精率、卵裂率和受精后48 h（第2日）的优质胚胎率差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:Strawtop法冷冻人微量精液冷冻复苏率高于麦管法，复苏精子的损伤较小，且复苏后无需离心洗涤即可直接用于ICSI，具有较高的临床应用价值。

目的:构建氯化镁(MgCl 2)微米缓释抗钙化的组织工程小口径血管。 方法:联合应用Triton X-100+脱氧胆酸钠盐、DNA/RNA核酶对绵羊颈动脉行脱细胞处理，制成组织工程小口径血管支架，HE染色，电镜下观察脱细胞情况和血管支架性能。采用复乳法超声破碎高速搅拌挥发法，制备载有MgCl 2的微米抗钙化缓释微球颗粒。检测缓释微球的粒径、包封率、载药量(率)及测出缓释曲线。应用碳二亚胺盐酸盐/琥珀酸亚胺(EDC/NHS)交联人工小口径血管，采用冷冻干燥技术将载有MgCl 2的微米缓释微球与血管支架结合，电镜下观察结合情况。检测标本血管厚度、拉力强度和压力承受值。 结果:羊颈动脉经脱细胞处理后能去除各类细胞，并保持支架原有性能。载有MgCl 2的微米抗钙化缓释微球粒径(1.31±0.02)μm，相对均匀，微球颗粒包封率82.79%，载药量(率)2.98%，25天内存在缓慢释放，释放率达81.08%。载有MgCl 2的缓释微球颗粒与小口径组织工程血管能有效紧密结合。 结论:以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为载体制成的载有MgCl 2的缓释微球颗粒可缓释镁离子，这为构建抗钙化组织工程小口径血管奠定了基础。

目的:研究自制的冷冻载体是否可以冷冻保存ICR小鼠卵裂胚和囊胚.方法:比较自制载体Cryotip和商业化载体Cryotop开展小鼠卵裂胚胎玻璃化冷冻效果,以及玻璃化冷冻保存小鼠囊胚的结局;对Cryotip组和Cryotop组卵裂胚胎复苏率、囊胚形成率、囊胚复苏率以及孵化率进行数据分析.结果:Cryotip组和Cryotop组冷冻小鼠卵裂胚胎的复苏率和囊胚形成率、囊胚孵化率差异均无统计学意义.在小鼠囊胚冻存方面,复苏率和囊胚孵化率差异无统计学意义.结论:自制载体Cryotip具有与商业化载体Cryotop接近的冷冻保存ICR小鼠卵裂胚胎和囊胚的效果.

微量精子样本不仅获取难度大(睾丸/附睾穿刺手术或显微外科取精术)、数目少且质量差,采用传统的冷冻方法还容易导致精子复苏率和回收率低下.为改善微量精子的冷冻保存效果,对现有冷冻保存技术进行了多方面改进,如新研发的多种微量精子冷冻载体在提高活动精子复苏率、精子回收率和操作便利性方面取得了较大进步.抗冻蛋白、卵磷脂、纳米颗粒和抗氧化剂等精子冷冻保护剂辅助因子在一定程度上改善了精子冷冻效果.精子玻璃化冷冻保存技术逐渐展现其发展潜力.综述微量精子冷冻保存技术在冷冻载体、冷冻保护剂和冷冻方案的优化方面的研究进展.

目的 优化紫杉醇/低分子肝素-胱胺-维生素E琥珀酸酯(PTX/LMWH-cys-TOS)胶束的处方,评价其制剂学特性和体外细胞活性.方法 以载药率和包封率为指标,考察有机溶剂、药物载体比例对胶束载药能力的影响,优化最佳处方.利用冷冻干燥法制备了胶束冻干粉针并考察复溶稳定性,采用透析法研究了胶束在不同浓度的二硫素糖醇溶液中的释放动力学,采用 CCK8 法研究了胶束在紫杉醇敏感和耐药细胞上的抗肿瘤活性,利用 HPLC 法测定了紫杉醇在肿瘤细胞内的质量浓度.结果 紫杉醇和LMWH-cys-TOS的最佳比例是 1∶3.6,使用乙醇作为有机溶剂.加入冻干保护剂的胶束产品外观良好,复溶后的胶束应该在 4℃保存,而且要尽快使用;在二硫苏糖醇存在的释放介质中,紫杉醇释放速度随着二硫苏糖醇浓度的增加而增加,二硫苏糖醇的浓度是 20 mmol/L时,紫杉醇的 36 h的累积释放量高达 93%.胶束能提高紫杉醇在耐药细胞HCT-15/Taxol上的毒性和药物在肿瘤细胞内的质量浓度.结论 PTX/LMWH-cys-TOS胶束改善了紫杉醇的溶解度,实现了靶向给药.

目的·利用冷冻电镜技术分析人源性赖氨酸乙酰转移酶7(lysine acetyltransferase 7,KAT7)的全长蛋白结构,获得人源KAT7的轮廓信息.方法·使用pGEX-4T1载体和人源KAT7全长基因构建重组蛋白表达质粒pGEX-4T1-GST-KAT7,在原核蛋白表达体系BL21(DE3)中表达KAT7蛋白,使用GST亲和层析获得GST-KAT7重组蛋白;在利用TEV蛋白酶去除GST蛋白标签后,通过HiLoad 16/600 Superdex 75 pg体积排阻色谱进一步分离纯化KAT7蛋白.将获取的蛋白样品利用蛋白质印迹法(Western blotting)对KAT7进行鉴定,使用负染电镜筛选样品并初步观察蛋白形貌;使用冷冻电镜收集数据,利用冷冻电镜数据分析软件CryoSparc挑选蛋白颗粒并分析KAT7全长蛋白的空间结构;通过UCSF Chimera软件将蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)中KAT7的MYST结构域模型(5GK9)、AlphaFold预测模型与生成的结构模型进行匹配分析.结果·利用亲和层析成功纯化人源性KAT7的全长蛋白,并通过体积排阻色谱获得高纯度的KAT7蛋白;在通过Western blotting鉴定KAT7后,利用负染电镜、冷冻电镜及单颗粒重构技术初步解析了KAT7全长蛋白的空间结构,并通过三维优化处理获得了分辨率约为10A的初步三维结构模型;KAT7全长蛋白空间结构呈不规则的半环状,已有的MYST结构域模型(PDB:5GK9)可匹配入KAT7全长模型的C端部分,调整后的AlphaFold预测模型也可匹配KAT7全长结构模型.结论·利用冷冻电镜技术初步分析了人源性KAT7的全长蛋白空间结构模型.

玻璃化冷冻技术作为辅助生殖中的一项重要技术手段,相比传统的程序冷冻法具有诸多优势.目前已在卵母细胞和各个胚胎期应用,显示了较好的可行性与稳定性.但是,玻璃化冷冻效果仍会受到一些因素影响,如样本自身质量、冻融方法、冷冻保护剂和冷冻载体的选择等.再者,玻璃化冷冻技术应用时间不长,临床结局以及新生儿出生状况跟踪相对匮乏,还需长期安全性评价.本文就玻璃化冷冻技术的发展、应用、影响因素及安全性评价方面做一综述.

目的 比较不同冷冻保护剂和不同冷冻载体对人睾丸精子的冷冻保存效果. 方法 选取在兰州大学第一医院生殖医学专科医院进行诊断性睾丸穿刺获得成熟活动精子的患者,以及行睾丸精子ICSI术后的患者,在知情同意下将剩余睾丸组织冷冻保存,共46例.将每例睾丸组织分为4份,随机分成4组进行冷冻:1.8 ml冷冻管+甘油复合冷冻剂(A组,46例);1.8 ml冷冻管+Fasrun冷冻保护剂(B组,46例);0.25 ml麦管+Fasrun冷冻保护剂(C组,46例);超微量冷冻麦管+ Fasrun冷冻保护剂(D组,46例).冷冻标本经液氮熏蒸后投入液氮,比较各组复苏后精子活力和复苏率. 结果 冷冻前各组的活动睾丸精子能够满足ICSI操作所用精子量;冷冻复苏后,C组和D组能够容易找到正常活动精子(≥0.1/200倍视野)的例数显著高于A组、B组(P＜0.05);D组解冻后运动精子复苏率显著高于A组、B组(P＜0.05),C组解冻后运动精子复苏率显著高于A组(P＜0.05). 结论 应用改良的超微量冷冻麦管+ Fasrun冷冻保护剂能够提高睾丸精子的冷冻复苏率.

目的:观察不同比例三联抗结核药物复合缓释材料在模拟体液中的药物释药性能.方法:以聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)作为载体,采用双乳、喷涂、冷冻干燥溶剂挥发法制备不同比例抗结核药物的复合缓释材料:A组,异烟肼(INH,H)∶利福平(RFP,R)∶吡嗪酰胺(PZA,Z)=15∶15∶30;B组,H∶R∶Z=20∶30∶50;C组,H∶R∶Z=30∶30∶120;D组,H∶R∶Z=80∶120∶250.药物总质量与PLGA之比为1∶5.扫描电子显微镜(SEM)观察HRZ/PLGA复合缓释材料的表面形态,高效液相色谱法(H PLC)检测其在模拟体液中H、R、Z三种药物的释放浓度,计算药物累计释放量及释放率,分析其体外缓释性能.结果:A组和B组缓释材料表面分散均匀,空隙规则、分布均匀,直径分别为23.07±0.38μm和25.67±1.26μm;C组和D组缓释材料分散欠均匀,空隙不规则、分布欠均匀,直径分别为31.25±1.98μm和45.67±3.26μm.A组H、R、Z分别于42d、56d、42d的累计缓释度超过50％,于70d时的阶段释药量分别为157.43 ±057μg、129.29 ±0.14μg、196.43 ±0.28μg,浓度分别为28.486μg/ml、23.525μg/ml、39.265μg/ml.B组H、R、Z分别于35d、42d、35d的累计缓释度超过50％,于70d时阶段释药量分别为9.89±0.96μg 、21.71±0.42μg 、51.12±0.87μg,浓度分别为1.789μg/ml、1.618μg/ml、10.242μg/ml.C组H、R、Z分别于21d、35d、42d的累计缓释度均超过50％,于70d时阶段释药量分别为1.76±0.49μg、8.43 ±0.31μg、81.14±0.58μg,浓度分别为0.352μg/ml、1.618μg/ml、10.242μg/ml.D组H、R、Z分别于28d、42d、35d的累计缓释度均超过50％,于70d时阶段释药量分别为1.71 ±0.21μg、14.01 ±0.42μg、65.57 ±0.26μg,浓度分别为0.312μg/ml、2.128μg/ml、13.516μg/ml.70d时A组三种药物浓度均大于各自的10倍最低抑菌浓度(MIC),且A组分散均匀,空隙规则、分布均匀,直径约为23.07±0.38μm,三种药物在不同的时间段释放行为不相同,前14d药物缓释规律按Higuchi方程拟合最好,即前14d三种药物按照扩散的形式进行缓释,14d后三种药物按照零级动力学缓释曲线释放,即等量缓释.其余3组均有药物未达到10倍MIC.结论:复合HRZ/PLGA缓释材料具有优良的载药及药物缓释效果,是一种理想的复合药物缓释系统,其中H∶R∶Z=15∶15∶30的HRZ/PLGA缓释材料为较佳配方.

目的 探索一种安全、便捷、有效的用于微量精子冷冻的方法.方法 选择内径130 μm的玻璃剥卵针50支作为冷冻载体,进行10个周期的反复冻融,检测其完整性,计算不同冷冻周期中载体折损率.选取50例经检测合格的精液标本,将密度调整至(0.5 ～1)×106/ml,使用精子冷冻保护剂按照1∶1体积混合预平衡10 min,每份标本装载2支载杆,计算装载时间,其中1支载杆作为快速冷冻组,迅速投入液氮中冷冻保存,另1支载杆采用液氮熏蒸30 min后再投入液氮中保存,比较两种方法解冻后精子的复苏率.结果 50支冷冻载体中,其中有36支完成全部10轮的冷冻-复苏周期测试,折损率为28.0％,损坏原因中78.6％为金属镊子直接夹持导致玻璃剥卵针破裂.玻璃剥卵针至少可耐受4个周期反复冻融,但之后约4％～6％的会出现自发破损.100支冷冻载体装载精子时间为45～398 s,平均为(112.3±94.1)s.冷冻前平均精子活力为65.6％±9.9％,快速冷冻复苏后平均精子活力为36.64％±8.7％,熏蒸法冷冻复苏后平均精子活力为23.48％±6.2％.快速冷冻法精子复苏率为55.9％±11.0％,熏蒸冷冻法精子复苏率为36.3％±9.8％,两者比较,差异具有统计学意义(F=18.31,P＜0.01).结论 采用剥卵针作为冷冻载体,并配合快速冷冻法,冷冻保存微量精子是一种安全、有效、简便的方法,适合临床广泛开展.