目的 制备抗猴痘病毒(monkeypox virus,MPXV)A35R蛋白单克隆抗体并建立其双抗体夹心ELISA检测方法,同时对方法进行验证.方法 原核表达MPXV A35R蛋白并免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术制备抗A35R蛋白单克隆抗体,对单克隆抗体的特异性、结合活性进行鉴定;建立双抗体夹心ELISA检测方法,对该方法的线性范围、检测限、专属性、准确性、精密度进行验证.结果 制备了 7 株抗MPXV A35R单克隆抗体.Western blot鉴定结果显示,7株单克隆抗体均与MPXV A35R蛋白及灭活MPXV发生特异性反应;7株单克隆抗体结合活性为11.35～27.73 ng/mL;抗体经配对筛选后,确定以7G5和2F5为最佳配对抗体,用于建立双抗体夹心ELISA方法.该方法对灭活MPXV抗原最低检测限为1.250×104 TCID50/mL,对MPXV A35R蛋白最低检测限为 1.95 ng/mL,线性范围为 3.91～125.00 ng/mL,线性回归方程为y=1.732 0x-0.920 8,R2=0.984 3;该方法专属性较强且不与其他病毒及蛋白发生交叉反应;准确性验证结果显示,病毒抗原回收率为 96.94%～110.04%;批间CV为 0.26%～8.13%,批内CV为 2.10%～5.48%.结论 成功制备了抗MPXV A35R蛋白单克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测方法.验证结果显示,该方法具有较高的灵敏度、准确度、重复性及专属性,可用于以A35R蛋白为基础的猴痘亚单位疫苗的生产质量控制.

目的:评价自拟温阳活血汤联合孕三烯酮胶囊治疗子宫腺肌病痛经的疗效。方法:将符合入选标准的2016年1月-2018年12月青海省大通县中医院子宫腺肌病痛经患者88例，按随机数字表法分为2组，每组44例。对照组采用西医常规疗法治疗，研究组在对照组基础上加用自拟温阳活血汤。2组均连续治疗6个月。分别于治疗前后进行中医证候评分和痛经评分，采用阴道超声检测并计算子宫体积，采用诺丁汉健康调查表(Nottingham Health Poofite, NHP)评估患者生活质量，采用双抗夹心ELISA法检测血清糖类抗原125(carbohydrate antigen 125, CA125)、TNF-α、IL-8水平，评价临床疗效。结果:研究组总有效率为93.2%(41/44)、对照组为72.7%(32/44)，2组比较差异有统计学意义( χ2＝6.510， P<0.01)。治疗后，研究组中医证候评分、痛经评分及子宫体积均低于对照组( t值分别为7.956、4.959、4.235， P值均<0.01)；疼痛、精力、情感、睡眠、社会活动及身体活动评分均低于对照组( t值分别为8.592、9.341、6.652、13.597、4.085、7.858， P值均<0.01)。治疗后，研究组血清CA125[(33.02±5.11)IU/ml比(46.22±6.51)IU/ml， t＝10.580]、TNF-α[(41.13±5.03)pg/ml比(55.50±6.15)pg/ml， t＝11.997]、IL-8[(38.02±5.50)pg/ml比(49.42±6.51)pg/ml， t＝8.873]水平均低于对照组( P<0.01)。 结论:自拟温阳活血汤联合孕三烯酮胶囊可降低血清CA125、TNF-α、IL-8水平，改善子宫腺肌病痛经患者的临床症状，提高生活质量。

目的:获得乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)C2蛋白的HBV多肽。方法:同源重组法构建含1.2倍HBVC2全基因组表达重组体；脂质体法转染HepG2和Huh-7细胞；荧光定量PCR法检测HBV DNA水平；双抗体夹心酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和E抗原(HBeAg)的水平；免疫荧光法检测核心抗原(HBcAg)水平和分布。电转染法转染人永生化B淋巴细胞系(B-lymphoblastoid cell line，BLCL)，液相色谱串联质谱(liquid chromatography-mass spectrography/mass spectrometry，LC-MS/MS)法分离鉴定HBV多肽，生物信息学预测亲合力，并检索已报道序列。结果:成功构建了含3881 bp目的片段的HBVC2全基因组的重组体，即pAAV/HBV1.2 C2。HepG2和Huh-7细胞转染重组体后24、48和72 h，培养上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg均呈现较高水平；HBcAg多分布在细胞核，均在48 h表达水平达高峰。从5株BLCLs细胞裂解液中检出来源于HBsAg、HBeAg和HBcAg的HBV多肽(序列长度≥8aa)共95条。比较分析共同序列和包含或重叠(≥8aa)序列，67条多肽形成了11个HBV多肽热点核心区域，有92条已见报道。51(53.68%)条多肽有相应的人类白细胞表面抗原(human leukocyte antigen，HLA)等位基因分型，而与5株细胞所携带HLA等位基因一致的共有21条。 结论:成功构建和表达了pAAV/HBV1.2 C2，获得了真实世界的HBVC2多肽谱。

目的:探讨结肠癌肝转移患者经导管肝动脉化疗栓塞(TACE)治疗后血清癌胚抗原(CEA)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)水平及与预后关系。方法:选取2014年5月至2016年5月新疆喀什地区第二人民医院接受TACE治疗的95例初治结肠癌肝转移患者作为研究对象。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法检测血清CEA、VEGF、MMP-9水平，分析血清CEA、VEGF、MMP-9水平与结肠癌肝转移患者3年总生存率(OS)关系，并采用COX回归分析影响结肠癌肝转移患者预后的危险因素。结果:结肠癌肝转移患者TACE治疗后血清CEA、VEGF、MMP-9水平均显著低于TACE治疗前( P<0.05)。TACE治疗后血清CEA、VEGF、MMP-9水平与结肠癌肝转移患者性别、年龄及肿瘤长径无关( P>0.05)；而与患者肿瘤部位、大体分型及TNM分期有关( P<0.05)。随访3年后95例结肠癌肝转移患者OS为45.26%，生存分析发现TACE治疗后血清CEA水平≥5 μg/L患者3年OS明显低于血清CEA水平<5 μg/L患者( P<0.05)，血清VEGF水平≥269 mg/L患者3年OS明显低于血清VEGF水平<269 mg/L患者( P<0.05)，血清MMP-9水平≥192 mg/L患者3年OS明显低于血清MMP-9水平<192 mg/L患者( P<0.05)。COX多因素分析发现，TACE治疗后血清CEA、VEGF、MMP-9水平均是影响结肠癌肝转移患者预后的独立危险因素( P<0.05)。 结论:结肠癌肝转移患者TACE治疗后血清CEA、VEGF、MMP-9水平均明显降低，揭示此三种分子可能作为结肠癌肝转移预后评价的指标。

目的:构建和筛选鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpW的B细胞和T细胞表位。方法:运用生物信息学软件预测OmpW的小鼠B细胞及T细胞表位并合成相应肽段；构建重组质粒pET28a-ompW并原核表达、纯化获得OmpW蛋白；以OmpW蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，2周免疫1次，共3次。第3次免疫后1周，收集小鼠血清、分离小鼠脾细胞培养。分别用OmpW蛋白及不同的T细胞表位肽刺激脾细胞，72 h后收集脾细胞上清。间接ELISA法检测小鼠血清中的特异性IgG抗体水平，双抗夹心ELISA法检测脾细胞上清液中IFN-γ浓度。结果:筛选并构建了5个B细胞表位及4个T细胞表位，B细胞表位分别是OmpW B1、OmpW B2、OmpW B3、OmpW B4、OmpW B5，T细胞表位分别是OmpW T1、OmpW T2、OmpW T3、OmpW T4；间接ELISA法检测结果显示，OmpW B1和OmpW B5能够与OmpW全长蛋白质免疫小鼠的血清发生抗原抗体反应，其 A450值与对照组相比显著升高( P<0.001)；双抗夹心ELISA法结果显示OmpW T4表位刺激的脾细胞上清中的IFN-γ浓度最高，与对照组相比差异有统计学意义( P<0.001)。 结论:成功构建并筛选出OmpW蛋白的两个B细胞表位OmpW B1及OmpW B5和一个T细胞表位OmpW T4。

目的:比较肠炎沙门菌制备的菌影(SE-ghost)通过肌肉注射(肌注)和口服不同免疫途径接种雌性BALB/c小鼠诱导体液和细胞免疫应答的功效。方法:用SE-ghost接种BALB/c小鼠，间接ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平和阴道灌洗液IgA抗体水平；流式细胞仪检测小鼠脾脏CD3 ＋CD4 ＋T、CD3 ＋CD8 ＋T细胞百分比变化和脾脏内细胞因子IL-4、IFN-γ分泌；三次免疫后所有小鼠口服半数致死量肠炎沙门菌进行强毒攻击。用SE-ghost刺激小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)，流式细胞仪检测表面分子抗体APC-CD11c、FITC- MHC ClassⅡ、PE-CD40、FITC- CD86、PE-CD80表达量；双抗体夹心ELISA测定BMDCs上清液IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12p70的产量。 结果:与PBS组相比，SE-ghost(口服)和SE-ghost(肌注)免疫组小鼠体内肠炎沙门菌特异性抗体IgG和IgA水平明显增高；脾脏CD3 ＋CD4 ＋T细胞百分比上调、高分泌细胞因子IL-4 、IFN-γ。肌肉注射SE-ghost比口服可诱导更强的体液和细胞免疫应答。致病菌肠炎沙门菌强毒攻击后，SE-ghost(口服)和SE-ghost(肌注)免疫组生存率高达80%。与对照组相比，BMDCs经SE-ghost刺激后高表达表面成熟分子抗体CD86、CD80、CD40、MHCⅡ，高分泌细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70。 结论:通过肌肉注射SE-ghost进行免疫，可在小鼠中引发更强大的抗原特异性免疫应答，以防止沙门菌感染。SE-ghost是一种有用的沙门菌候选疫苗。

目的:分别用新型复合层析介质Capto Core700和传统分子筛介质Sepharose 4FF纯化MDCK细胞制备的H5N1型流感病毒浓缩液，并比较分离纯化效果。方法:用Capto Core700与Sepharose 4FF纯化灭活H5N1型流感病毒浓缩液，透射电镜分析不同样品中病毒颗粒的形态；分别用单向免疫扩散法(single radial immunodiffusion, SRID)、福林酚法(Lowry法)、双抗体夹心ELISA、qPCR检测不同层析介质纯化前后病毒血凝素含量、总蛋白质含量、宿主细胞蛋白质(host cell protein, HCP)含量和宿主细胞DNA(host cell DNA, HCD)含量，计算病毒抗原回收率和杂质去除率；用动物实验检测不同纯化病毒的免疫原性，并用 t检验分析两种层析介质纯化效果差异。 结果:Capto Core700与Sepharose 4FF纯化的H5N1型流感病毒在透射电镜下均呈典型的流感病毒形态；两种层析介质纯化后病毒血凝素回收率差异无统计学意义( P>0.05)，但前者的杂质(总蛋白质、HCP、HCD)去除率均高于后者，且差异有统计学意义( P<0.05)；动物实验表明两种层析介质纯化的病毒样品均具有良好的免疫原性。 结论:相对于Sepharose 4FF层析介质，Capto Core700在保证病毒抗原蛋白回收率的基础上可以更有效地去除HCP、HCD和总蛋白质等工艺相关杂质。本研究为MDCK细胞生产H5N1型流感病毒疫苗纯化工艺开发提供了参考。

目的:制备Yamagata系乙型流感病毒血凝素蛋白（hemagglutinin，HA）的特异性单克隆抗体，建立检测Yamagata系乙型流感病毒的双抗体夹心ELISA方法。方法:用Yamagata系乙型流感病毒（B/Phuket/3073/2013）抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，通过4次有限稀释获得阳性杂交瘤细胞并建株。将单克隆抗体1F7和2H6分别作为捕获抗体和检测抗体，建立一种检测Yamagata系乙型流感病毒的双抗体夹心ELISA法。结果:该方法中捕获抗体1F7在96孔板的包被量为40 ng/孔，检测抗体2H6工作浓度为100 ng/孔；该方法仅能与Yamagata系乙型流感病毒发生反应，具有较强特异性。灵敏度分析显示，该方法对病毒尿囊液和病毒纯化HA蛋白最低检测值分别为2 -1 HAU/100 μL和1.22 ng/mL，具有较高灵敏度。重复性试验表明，该方法批内和批间重复性变异系数均小于5%。 结论:本研究建立的ELISA方法特异性强、灵敏度高、重复性好，为Yamagata系乙型流感病毒快速诊断及定量检测提供技术支持。

目的:建立汉城病毒(Seoul virus, SEOV)L99株特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法，验证其检测性能，为双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)疫苗研制、生产和检定过程中Ⅱ型病毒抗原含量检测提供有效手段。方法:小鼠体内诱生法制备L99病毒单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)腹水，Protein-A亲和层析纯化腹水抗体，SDS-PAGE鉴定纯化抗体纯度，间接ELISA法测定McAb效价，Western blot鉴定其特异性；叠加ELISA法对4株McAb进行抗体配对。用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记单抗后，通过正交试验优化包被和标记抗体使用浓度，建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以Ⅱ型HFRS疫苗标准品作为定量标准，验证方法的检测限、线性范围、专属性、准确性、精密度；通过检测3批Ⅱ型病毒疫苗灭活原液验证方法适用性。结果:4株McAb腹水效价均>1∶10 6，抗体纯度均>98%；经Western blot鉴定，1D5、3A4、5B7特异识别Ⅱ型L99株出血热病毒核衣壳蛋白，2E3与Ⅰ型PS-6株出血热病毒存在交叉反应；经抗体配对筛选后，选择3A4为包被抗体，1D5为标记抗体；棋盘滴定法确定包被抗体工作浓度为20 μg/ml，HRP标记抗体工作浓度为1∶4 000。该方法对SEOV L99抗原最低检测限为0.078 1 μg/ml；线性范围为0.078 1~2.500 0 μg/ml， R2>0.99；专属性验证其对Ⅱ型HFRS疫苗具有检测特异性；抗原回收率在95.8%~108.7%之间，精密度验证变异系数<10%。用该方法检测3批Ⅱ型HFRS灭活疫苗原液结果均呈剂量依赖性。 结论:成功建立了SEOV L99株型特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法，为地鼠肾双价肾综合征出血热疫苗生产及检定过程中，SEOV L99株病毒抗原含量测定提供了检测方法。

目的:探究猪带绦虫（Ts）14-3-3.3蛋白作为囊虫病疫苗候选分子的潜力。方法:选取60只昆明小鼠，体重为18 ~ 22 g，按体重采用随机数字表法分为3组，分别为生理盐水对照组（对照组）、Ts14-3-3.3重组蛋白疫苗组（疫苗组）、Ts14-3-3.3重组蛋白疫苗 +佐剂组（疫苗 +佐剂组），每组20只。采用多点皮下注射法，在0周首次免疫后进行2次加强免疫，共免疫3次，每次接种间隔2周。3组在首次免疫后0、2、4、6、8周分别剖杀4只小鼠，摘眼球取血和无菌取脾，分别用于分离血清和制备脾淋巴细胞悬液[处理因素：原液、抗原刺激、刀豆蛋白A（ConA）刺激]。采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测小鼠血清特异性抗体免疫球蛋白（Ig）G、IgG2a、IgG1及IgE水平；采用CCK-8法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平；采用双抗夹心ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清液肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-12、IL-13、IL-10水平。结果:疫苗、疫苗 +佐剂组免疫2 ~ 8周IgG、IgG2a、IgG1水平均高于对照组，且疫苗 +佐剂组免疫2 ~ 8周上述指标均高于疫苗组（ P均 < 0.05）。组间相同处理因素下，免疫2 ~ 8周脾淋巴细胞增殖水平以及培养上清液TNF-α、IL-12、IL-13、IL-10水平比较，差异均有统计学意义（ P均 < 0.05）；疫苗、疫苗 +佐剂组免疫2 ~ 8周脾淋巴细胞增殖水平以及培养上清液TNF-α、IL-12、IL-13、IL-10水平均高于对照组，且疫苗 +佐剂组免疫2 ~ 8周上述指标均高于疫苗组（ P均 < 0.05）。组内不同处理因素下，抗原刺激、ConA刺激时免疫0 ~ 8周脾淋巴细胞增殖水平以及培养上清液TNF-α、IL-12、IL-13、IL-10水平均高于原液，且ConA刺激时免疫0 ~ 8周上述指标均高于抗原刺激（ P均 < 0.05）。 结论:Ts14-3-3.3重组蛋白疫苗可诱导小鼠产生有效的免疫应答。