目的 探讨常规体外受精(IVF)后的未见原核(0PN)受精卵发生的影响因素及对其发育潜能影响.方法 对2019年1月至2021年12月期间在保定市妇幼保健院生殖医学科1 597个常规IVF周期及596个冻融胚胎移植(FET)周期进行回顾分析.将常规IVF-ET周期分为A1组(无0PN来源胚胎,n=731)、A2组(0＜0PN来源胚胎率≤20％,n=495)和A3组(0PN来源胚胎率＞20％,n=371)三组,比较三组的患者基本情况、新鲜周期临床治疗情况和实验室指标.依据行囊胚培养的D3卵裂胚来源不同分为B1组(0PN来源,n=2 409)和B2组(2PN来源,n=6 602)两组,比较两组囊胚形成率、可利用囊胚形成率.依据囊胚来源将囊胚FET周期分为C1组(0PN来源冻融囊胚,n=85)和C2组(2PN来源冻融囊胚,n=511),比较两组的妊娠率、着床率、流产率、活产率、胎儿畸形率等指标.结果 (1)与A1组比较,A2、A3组的年龄更小、基础FSH水平更低、抗苗勒管激素(AMH)水平更高(P＜0.05),而组间不孕年限、体质量指数(BMI)无显著差异(P＞0.05).A2、A3组两组患者用药天数、长方案占比、获卵数显著高于A1组(P＜0.05),其中A2组拮抗剂方案占比最低,获卵数最高.(2)B1、B2两组的囊胚形成率无显著差异(P＞0.05),B1组的可利用囊胚形成率显著高于B2组(P＜0.05).(3)FET周期中,C1、C2组患者间年龄、不孕年限、BMI、优质囊胚比例、D5囊胚占比均无显著差异(P＞0.05),C2组的移植胚胎数显著高于C1组(P＜0.05).囊胚移植后,两组间种植率、妊娠率、孕周、早产率、新生儿体重、新生儿体长比较均无显著差异(P＞0.05),C1组流产率显著高于C2组、活产率显著低于C2组(P＜0.05).结论 接受常规IVF-ET治疗的患者卵巢储备情况可能会对0PN来源胚胎的形成有一定影响;0PN来源囊胚移植流产率高于2PN来源囊胚,而活产率低于2PN来源囊胚,但在患者无2PN来源胚胎可移植的情况下,0PN来源囊胚移植提高了胚胎利用率,降低了患者诊疗费用,减少了患者精神及身体上的痛苦,有很大利用价值.

已知Pif1解旋酶在维持基因组稳定性方面发挥重要作用,且不同生物Pif1解旋酶具有不同的生物学活性;然而迄今为止,嗜热细菌Pif1解旋酶的生物学活性分子特征的研究尚未见报道.本文运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了嗜热脱铁去硫弧茵Pif1解旋酶(Defe.Pif1)结合活性与解旋活性的分子特征.通过原核表达纯化系统,本研究获得纯度95％以上、无标签的Defe.Pif1蛋白.利用荧光偏振技术研究Defe.Pif1结合反应的底物特异性,揭示出Defe.Pif1优先结合ssDNA与G4DNA,并对含3’-尾链的部分双链底物有较强亲和力,其结合反应底物特异性为:ssDNA＞G4 DNA＞3’-ssDNA-dsDNA-Y-structure＞Other substrates.通过快速停留检测技术研究Defe.Pif1的解旋活性,明确其最适解旋温度为50℃,最佳反应溶液为10 mmol/L NaC1、3mmol/L DTT、3 mmol/L MgC12及1 mmol/L ATP;进一步的解旋动力学特征分析结果显示,Defe.Pif1可以高效解旋含G4结构的DNA底物,其解旋5’-G4-dsDNA底物时的解旋幅度超过90％,解旋速率也与其解旋5'-ss-dsDNA底物的速率相近,提示Defe.Pif1解旋G4 DNA更接近Bs.Pif1的单体反应模式.此外,本研究还发现Defe.Pif1解旋不同类型复制叉/复制泡底物时拥有独特的解旋倾向性:与解旋其它复制中间体DNA的低效性不同,Defe.Pif1解旋12nt-bubble底物的速率与幅度均较高,暗示12nt-bubble结构很可能是该解旋酶复制中间体的天然底物.上述结果证明,Defe.Pif1不仅具有Pif1解旋酶家族成员共同的结合与解旋G4DNA等活性特征;而且作为嗜热细菌的解旋酶,它还具有独特的反应条件与解旋底物特异性.本研究为研究Pif1解旋酶家族其它成员的分子特征与生物功能提供了潜在的研究策略,为阐明此类Pif1解旋酶的分子作用机制奠定实验基础.

目的:分析来源OPN卵裂期胚胎培养至囊胚后行冷冻复苏周期的临床妊娠结局,评价来源OPN囊胚的临床应用价值.方法:回顾性分析2014年3月至2016年9月在安徽省妇幼保健院生殖医学中心接受辅助生殖助孕治疗中40个来源OPN的卵裂期胚胎培养至囊胚的冷冻复苏周期,分析其临床妊娠及分娩结局情况.结果:40个完全来源OPN的囊胚复苏周期移植的临床妊娠率为45.0％ (18/40),种植率为31.67％(19/60),随访截止时间至2016年9月,其中9例活产(5男4女),继续妊娠7例(8胎),2例流产(2胎),流产组织绒毛分析结果显示均异常.结论:患者行IVF-ET治疗后,可将来源OPN的卵裂期胚胎培养至囊胚给予冷冻,在没有来源2PN正常受精的卵裂期与囊胚时,患者可慎重选择来源OPN囊胚行复苏周期进行移植.

[背景]目前关于桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)生防基因的研究不多,仅从其基因组中克隆了2个几丁质酶基因片段,其单个几丁质酶的完整基因序列相关研究未见报道.[目的]克隆S.sampsonii KJ40的几丁质酶基因ChiKJ40并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其抑菌作用.[方法]采用PCR扩增法从S.sampsonii KJ40中克隆几丁质酶基因ChiKJ40,连接到表达载体pET-32a,导入Escherichia coli BL21 (DE3)进行诱导表达.使用His标记蛋白质微量纯化试剂盒对重组几丁质酶进行纯化,Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的浓度,几丁质酶试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的几丁质酶活性.观察重组几丁质酶对桉树焦枯病菌(Cylindrocladium scoparium)、栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、链格孢菌(Alternaria alternate)、紫丝核菌(Rhizoctonia violacea)几种致病真菌的抑菌作用.[结果]ChiKJ40基因(登录号为MF434484)在E.coli中经IPTG诱导表达,获得42 kD的重组几丁质酶,不同浓度IPTG在37℃诱导3h,蛋白产量无明显变化.0.2 mmol/L IPTG 16℃诱导过夜,重组几丁质酶主要以可溶性形式存在于上清,小部分以包涵体存在于沉淀中.粗酶液几丁质酶活性为0.080 U/mL,酶比活力为0.041U/mg,纯化酶液几丁质酶活性为0.046 U/mL,酶比活力为0.115 U/mg,纯化倍数为2.8,酶活回收率为57.5％.重组几丁质酶处理后,C.scoparium、C.parasitica和A.alternata菌丝细胞出现分节、膨胀,R.violacea菌丝溶解且部分被破坏成碎片.[结论]ChiKJ40基因的研究补充了S.sampsonii的生防背景,为几丁质酶基因找到了新的来源,并为其应用奠定了理论基础.

目的 探讨体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET)新鲜周期移植完全来源未见原核(non-pronuclear,0PN)(可见2极体)胚胎的临床结局. 方法 回顾性分析2012年5月-2016年3月在本中心接受IVF-ET治疗(包括常规IVF和ICSI),移植完全来源0PN(可见2极体)胚胎的妇女共145例,分析其临床结局. 结果 145例妇女在新鲜移植周期共移植来源0PN(可见2极体)胚胎198枚,胚胎着床率17.7％ (35/198).临床妊娠28例,临床妊娠率19.3％(28/145),其中22例孕妇分娩活产健康子代23例(含1例双胎妊娠),未见畸形,1例异位妊娠,2例胎停育、1例无胎心、1例感染引产、1例流血流产. 结论 IVF周期中,无2PN胚胎但可见2极体胚胎的情况下,在充分告之病人知情同意后,可行移植0PN,并需对临床妊娠过程及结局严密观察追踪.

目的 分析未见原核(0PN)来源胚胎和正常受精的双原核(2PN)来源胚胎的优质囊胚形成率,以及囊胚冻融移植后的临床结局,评价0PN囊胚的临床应用价值及新生儿情况.方法 回顾性分析2015年1月—2016年12月在山东大学附属生殖医院体外受精(IVF)或卵母细胞胞质内单精子注射(ICSI)治疗周期中出现的0PN来源胚胎及2PN来源胚胎的临床资料,分析两种受精方式0PN来源胚胎及2PN来源胚胎的优质囊胚形成率;收集囊胚冻融移植周期中,移植IVF或ICSI来源的、第5天(D5)或第6天(D6)2PN囊胚及0PN囊胚的临床资料,分析临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、活产率和新生儿异常率.结果(1)IVF方案中2PN来源胚胎比0PN来源胚胎的优质囊胚形成率略高(分别为46.64%、42.42%),差异有统计学意义(P<0.01);ICSI方案中2PN来源胚胎的优质囊胚形成率(41.96%)更显著高于0PN来源胚胎(21.73%),差异也有统计学意义(P<0.01).(2)囊胚冻融移植周期中,IVF方案的D5 0PN囊胚的临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、活产率和新生儿异常率(分别为52.64%、49.91%、17.37%、46.54%、1.31%),分别与D6 2PN囊胚的临床妊娠率、胚胎种植率、流产率、活产率和新生儿异常率(分别为46.78%、41.20%、23.36%、39.56%、4.21%)比较,差异均有统计学意义(P均<0.05).IVF方案的D5 2PN囊胚的临床妊娠率、胚胎种植率、活产率和新生儿异常率(分别为59.73%、55.95%、53.03%、3.90%),分别与D5 0PN囊胚的相应指标比较,差异均有统计学意义(P均<0.05);其中新生儿异常率2PN囊胚略高于0PN囊胚,余3项均优于0PN囊胚;流产率无明显差异(P>0.05).IVF方案中D5 2PN囊胚的临床妊娠率、胚胎种植率、流产率和活产率(分别为59.73%、55.95%、18.23%、53.03%)与D6 2PN囊胚的相应各率(分别为46.78%、41.20%、23.36%、39.56%)分别比较,差异均有统计学意义(P均<0.05),仅新生儿异常率无明显差异(P>0.05).结论 在优先移植2PN囊胚的原则上,0PN囊胚在知情同意后可以用来移植;IVF方案中,综合2PN和0PN囊胚的发育速度和质量评价,选择获得妊娠可能性大的囊胚进行移植.

[背景]滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)感染能够引起鸡和火鸡的气囊炎、关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎等.有研究表明,许多支原体中与代谢相关的酶类不仅分布在细胞质,也分布于细胞膜表面,通过结合宿主细胞的胞外基质蛋白,协助病原菌黏附入侵宿主细胞.已有报道牛支原体(Mycoplasma bovis)和鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的醛缩酶(Fructose-bisphosphate aldolase,FBA)分布在膜蛋白和胞浆蛋白中,而MS的FBA蛋白还未见相关研究.[目的]对MSFBA蛋白进行生物信息学分析、原核表达、免疫原性分析及亚细胞定位检测,为进一步探索MS代谢相关酶类的生物学功能奠定基础.[方法]通过分析软件PSORTb、SignalP 4.1 Server和TMHMM Server在线预测MSFBA的亚细胞定位、信号肽及跨膜区,并用BLASTn和MEGA 5.0进行同源比对及进化树分析;通过Overlap PCR点突变扩增MS的fba全基因序列,连接表达载体pET-28a(+)并进行原核表达及纯化,获得纯化后的重组MSFBA (rMSFBA)蛋白;用MS阳性血清进行Western blot鉴定rMSFBA的免疫原性;用纯化的rMSFBA蛋白制备兔多克隆抗体,与MS全菌蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白进行Western blot分析,同时对MS全菌进行悬浮免疫荧光分析,检测MSFBA的膜定位情况.[结果]生物信息分析预测MSFBA分布在细胞质中,无信号肽,无跨膜区,在MS种内相似性高达99％,与其他种属FBA相似性在61％?78％之间,进化树显示其与牛鼻支原体(Mycoplasma bovirhinis)、仓鼠支原体(Mycoplasma cricetuli)等的FBA蛋白进化关系较近,与精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、人型支原体(Mycoplasma hominis)等的FBA蛋白进化关系较远;表达rMSFBA蛋白并纯化,经测定其相对分子质量大小约为33 kD;rMSFBA能与MS阳性鸡血清特异性结合,证实其具有较好的免疫原性;Western blot显示抗rMSFBA的兔血清能与MS全菌蛋白和胞浆蛋白反应,而与膜蛋白不反应,说明MSFBA蛋白分布于胞浆中;悬浮免疫荧光实验证实MS的细胞膜上未见FBA蛋白分布.[结论]首次报道了滑液支原体的FBA蛋白是一个高度保守的免疫原性蛋白,主要分布在细胞质中,该结果为进一步研究MSFBA蛋白的生物学功能提供了分子基础.

目的 总结移植异常原核数[0PN (non-pronuclear)、1PN(one-pronuclear)]来源胚胎病例的临床结局,以供临床工作中参考.方法 收集2013年1月1日至2018年12月31日期间于首都医科大学附属北京朝阳医院生殖中心接受体外受精/卵胞质内单精子显微注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)助孕的不孕症患者的临床资料,进行回顾性分析移植0PN、1PN来源胚胎病例的妊娠结局.结果 总结了47例患者,移植非2PN来源胚胎50个周期.只移植0PN有18个周期,临床妊娠率50.0％.只移植1PN有17个周期,临床妊娠率29.4％,与0PN比较,差异无统计学意义(P＞0.05).已分娩的新生儿未见异常.结论 在没有2个原核(2PN)来源的胚胎可以移植的情况下,患者可以移植0PN与1PN来源的囊胚,可以获得可接受的临床妊娠结局,0PN的临床结局可能更好.

目的 制备抗刚地弓形虫前纤维蛋白(TgPRF)的多克隆抗体,初步研究其对刚地弓形虫在小鼠胚胎成纤维细胞中增殖的影响. 方法 提取刚地弓形虫RH株RNA、扩增TgPRF基因,并构建pET-30a(+)-TgPRF重组质粒,将其转化至大肠埃希菌BL21 (DE3)感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白表达情况.目的蛋白经AKTA系统进行亲和层析纯化和超滤浓缩后进行蛋白质印迹分析(Western blotting).将2 mg纯化的重组蛋白TgPRF与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后,背部皮下多点注射免疫新西兰兔2只,首次免疫后每隔2周,用1 mg纯化的重组蛋白TgPRF与等体积弗氏不完全佐剂加强免疫3次,末次免疫后10 d心脏采血.免疫后血清进行Western blotting鉴定及ELISA抗体效价检测.将胚胎成纤维细胞接种于96孔板中(4×103个细胞/孔),并加入104个刚地弓形虫速殖子(RH-GFP).设空白对照组(A组),抗体干预组(B1、B2和B3组),阴性血清组(C组).B1、B2和B3组分别加入1∶20、1∶80、1∶200稀释的抗TgPRF兔血清100 μl;C组加入1∶20稀释的免疫前兔血清100μl,每组均设3个复孔.培养72 h后荧光显微镜观察,通过Image pro 6.0软件分析虫体增殖情况.采用SPSS13.0软件进行统计学分析. 结果 PCR扩增TgPRF基因片段为510 bp,pET-30a(+)-TgPRF经测序与目的序列完全一致.经IPTG诱导表达,TgPRF蛋白相对分子质量(Mr)约为25 000,且高表达条带主要存在于上清中.TgPRF蛋白经纯化浓缩后浓度为4 mg/ml,Western blotting分析显示,在Mr 25 000处出现特异性条带.经细胞计数试剂盒(CCK-8法)检测,抗TgPRF血清对胚胎成纤维细胞未见毒性损伤.ELISA检测抗TgPRF血清抗体效价＞1∶105;各实验组细胞于感染24h时,A组(0.62±0.23)及C组(0.74±0.25)相对虫体数量高于B1组(0.35±0.16) (P＜ 0.05),但与B2和B3组间差异无统计学意义(P＞0.05),B1～B3组虫体增殖抑制率分别为43.5％、11.4％、3.6％.感染48 h时,A组(3.61±0.66)与C组(3.38±0.78)相对虫体数量明显高于B1～B3组(P＜ 0.01),而B1组(1.09±0.58)与B2组(1.92±0.73)低于B3组(2.47±0.84) (P＜0.05),B1～B3组虫体增殖抑制率分别增高至69.9％、46.9％、31.7％;感染72 h时,A组(19.90±3.92)与C组(20.61±4.07)相对虫体数量高于B1组(5.58±2.43)与B2组(8.06±2.66) (P＜0.01),B3组(16.02±6.46)明显升高.B1～B3组抑制率分别为72.0％、59.5％、19.5％. 结论 弓形虫TgPRF蛋白能有效刺激新西兰兔产生抗体,且TgPRF兔血清抗体在体外能有效抑制弓形虫速殖子在小鼠胚胎成纤维细胞中的增殖并呈现明显的量效关系,但并不能完全消除虫体.

目的 原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuber-culosis,MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白(recombinant ESAT6-CFP10,rEC),并优化表达条件.方法 以(GGGGS)3为linker将ESAT6和CFP10两个基因连接,合成rEC全基因,插入至载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-rEC,转化至感受态E coli BL21(DE3),筛选优势菌株进行诱导表达,并对诱导温度(25、30、37℃)、诱导剂种类及浓度(0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L IPTG及0.5、1、5、10、15、20 g/L乳糖)、诱导时间(2、3、4、5、6h)、诱导起始A600(0.4、0.6、0.8、1.0)进行优化.菌种经5L发酵罐发酵培养后,采用亲和层析及离子交换层析纯化rEC融合蛋白,于-20℃分别储存0、2、4、6个月,12.5％ SDS-PAGE分析rEC融合蛋白,并对保存0、6月的样品进行HPLC-SEC分析.结果 重组质粒pET-28a-rEC经双酶切及测序鉴定,构建正确.rEC融合蛋白最适诱导条件为:于30℃,以0.1 mmol/L IPTG诱导4h.纯化后rEC融合蛋白纯度达95％以上,且可与鼠抗ESAT6单克隆抗体发生特异性结合,于-20℃保存6个月未见蛋白降解及聚体产生.结论 原核表达了rEC融合蛋白,并优化了其表达条件,获得的rEC融合蛋白具有较高纯度及稳定性.